절개 바셀린 갭 접근 방식은 빠른 채널 반응 속도의 높은 해상도와 Xenopus의 난자에서 발현 전압 - 의존성 이온 채널에서 이온 및 게이팅 전류의 낮은 잡음 녹음을 얻는 데 사용됩니다. 사소한 변형에, 전압 클램프 형광 측정은 절개 난자 프로토콜에 연결될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
절개 난자 바셀린 갭 (COVG) 전압 클램프 기술은 난자의 이종 이온 채널의 전기 생리학과 운동 특성을 분석 할 수 있습니다. 절개 설정에서 녹음 낮은 크기의 게이트 전류, 빠른 이온 전류의 활성화 및 비활성화를 해결하는 데 특히 유용합니다. 두 전극 전압 클램프 (TEVC) 기법을 통해 주요 장점은 증가 된 클램프 속도, 개선 된 신호대 잡음비, 및 세포 내 및 세포 외 환경을 조절하는 능력을 포함한다.
여기서는 절개 설정 및 프로토콜뿐만 아니라 전압 클램프 형광 측정 기능을 추가하는 데 필요한 변형을 설명하기 위해, (HNA V 1.5), 아프리카 손톱 개구리의 난모 세포에서 발현 인간 심장 나트륨 채널을 이용한다.
이러한 HNA V 1.5 빨리 활성화 이온 채널의 특성은 완전히 whic에서 TEVC를 사용하여 상온 근처에 해결 될 수없는난자의 세포막의 시간 전체가 전압 제어가 어려워 고정된다. 그러나 절개 기술에서 세포막의 단지 작은 부분의 절연은 패치 클램프 기술과 연관된 채널 황폐 방지하면서 정확하게 빠른 반응 속도를 기록 할 필요 급속한 클램핑을 허용한다.
COVG 기술, 이온 채널 속도론 및 전기 생리 특성과 함께 추가로 단백질 움직임이 세포 외로 적용 형광체, 유전자에 의해 코딩 형광 단백질의 삽입 또는 부자연 아미노산의 혼입 시스테인 공액 통해 추적되는 전압 클램프 형광 측정을 사용하여 정량 할 수있다 관심 1의 영역으로. 이러한 추가적인 데이터는 형광 분자를 둘러싸는 미세 변화를 통한 단백질의 전압 의존성 구조적 재 배열 대해 운동 정보를 산출한다.
서론
특수 전압 클램핑 기술은 제어 된 막 전위에서 이온 전류의 기록을 허용한다. 널리 두 전극 전압 클램프 (TEVC)를 사용하고 패치 클램프 기술은 많은 이온 채널의 특성에 대한 신뢰성있는 전기 생리 정보를 제공한다. 그러나, 이러한 방법은 모두 빠른 전압 문 나트륨 채널과 같은 Xenopus의 난자의 세포막에있는 것과 같은 다른 빠른 활성화 채널에 대한 신뢰할 수있는 데이터의 취득을 방지 단점이 있습니다. Bezanilla과 스테파니 연구소는 따라서 난자 2의 절개 바셀린 갭 전압 클램프 기술 (COVG)를 개발했다. 기법은, 나 +, K +, 및 칼슘 2 + 채널 3-8을 기록 널리 적용되어왔다.
COVG 기록하는 동안, 이종 단백질 발현 난자의 막을 세 지역으로 나누어 져 있습니다. 이온 전류 데이터로서 난자의 상부 영역으로부터 기록된다정상 영역을 둘러싸 욕을 용이하고 신속하게 변경 될 수있는 명령 전위에 클램프된다. 중간 영역의 상부 영역 (9)과 동일한 전위에 클램프 됨으로써 누설 전류에 대하여 가드. 난자 개구 (절개) 사포닌 용액 또는 정맥의 사용을 통해 발생하는 위치를 하단 영역입니다. 화학적 ....
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프로토콜
1. 초기 장비 설치
- 전기 및 기계 소음을 방지하기 위해 주변 패러데이 케이지 진동 격리 시스템 (예를 들면, 공기 테이블)에 무대와 미세 조작기를 놓습니다.
- 24 AWG 와이어의 6 인치 길이에 여섯 자세 / AgCl을 알약을 납땜. 이들 중 하나의 길이 (P1에 접속되는) 제 2 와이어의 접합부는 "Y"를 형성한다. 각 와이어의 끝에 앰프에 포함 된 금 BNC 핀을 납땜.
- 욕실 / 가드 headstage (P1, P2, CC, GS1 및 GS2)에 24 AWG 와이어에 납땜 다섯 자세 / AgCl을 알약을 연결합니다. 연결 "I" "I"headstage 및 V2의 headstage에 P1 떨어져 재림 와이어 자세 / AgCl을 펠렛.
- 장비 설명서의 지시에 따라 데이터 수집 장치에 앰프를 연결합니다.
- 배치하고 온도 컨트롤러 서미스터를 에폭시. 금속 scaffol에 구멍을 통해 블록 서미스터 쓰레드직접 가열 / 냉각 요소의 중심 위에서 좋아. 놓고 아주 가까이 있지만 솔루션을 접촉하지 온도 전도 하단 챔버의 몸에 드릴 구멍에 목욕 서미스터를 에폭시.
2. 난자와 예비 준비
- 이러한 HNA V
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결과
도 4는 디스플레이 사포닌 용액으로서 난자의 투과성의 변화는 난자의 바닥 부에인가된다. 5 사포닌 permeabilization 다음 확산에 의해 세포 내 용액의 교환 율을 보여 도표. 20 ~ 40 분은 정상 상태 2,18에 와서해야합니다.
기록 프로토콜에서 생성 된 그림 6A 쇼 흔적. 그림은 전압 프로토콜 (삽입)에 대한 응답 (P/-8 누출 공제 후) 이온 전류를 보여줍니다. 그림의 각 트레이스는 다른인가 전압을 나타냅니다. 느린 반응 속도와 흔적은 나트륨 채널을 열 수있는 가장 낮은 전위를 나타낸다. 일반적으로, 기존의 방법을 사용하여, 그것을 안쪽 전류 막 탈분극 때문에 이러한 낮은 전위에 대한 전압 제어를 유지하는 것이 곤란하다. 차례로이 탈분극은 긍정적 인 피드백 루프를 만들어 더 많은 채널을 활성화 . 절개.......
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토론
절개 난자 바셀린 갭 전압 클램프 기술은 데이터의 신속한 해결이 가능, 낮은 노이즈, 상대적으로 긴 프로토콜 19을 통해 내부 솔루션 및 외부 용액 조성물을 제어하고, 안정된 레코딩을 증가했다. 이러한 장점 떨어져 표준 두 전극 전압 클램프 및 패치 클램프 기술에서이 기술을 설정합니다. 전문 장비가 필요하고 프로토콜이 상대적으로 어려운 있지만 시스템이 최적화되면, 아주 몇 가지 문제가 발생합니다. 이것은 나트륨 (HNA V 1.5) 및 기타 빠르게 활성화 채널의 재현 녹음 할 수 있습니다.
프로토콜에서 가장 중요한 단계는 V1 전극과 난자와 말뚝으로 찌르는 형벌에 최고 실의 배치입니다. 셀과 실 구멍의 가장자리 사이의 밀착되어 레코딩 품질에 큰 영향을 미치고 있습니다. 상부 챔버는 가장 높은 재를 달성하기 위해 셀을 푸시 다운 할 수 있어야합니다난자를 손상시키지 않고 sistance. 이것은 난자 부푼 만들기 요구하고 평평하지만, 셀 품.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
모든 세인트 루이스 심장 분자 공학 연구실에있는 워싱턴 대학의 구성원. 버로우즈는 과학 인터페이스에서 기금 경력 상을 오신 것을 환영합니다 - 1010299을 (JS에).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 외부 솔루션 | 브랜드 | 카탈로그 번호 | [최종], 중량 또는 부피 |
| N-메틸-D-글루카민(NMDG) | 시그마-알드리치 | M2004 | 25mM |
| MES 나트륨 염 | 시그마-알드리치 | M5057 | 90mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 20mM |
| 수산화칼슘 | 시그마-알드리치 | 239232 | 2mM |
| MES 수화물 | 시그마-알드리치 | M8250 | 가변(pH 7.4) |
| 내부 용액 | |||
| N-메틸-D-글루카민(NMDG) | 시그마-알드리치 | M2004 | 105mM |
| MES 나트륨염 | 시그마-알드리치 | M5057 | 10mM |
| HEPES | 연구 제품 국제 | H75030 | 20mM |
| 에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N', N'-테트라 아세트산 (EGTA) | 시그마 -알드리치 | E4378 | 2mM |
| MES 수화물 | 시그마 -알드리치 | M8250 | 가변 (pH 7.4) |
| 탈분극 용액 | |||
| KCl | 시그마-알드리치 | 221473 | 110mM |
| 염화 마그네슘 | 시그마-알드리치 | M8266 | 1.5mM |
| 염화칼슘 | 케이슨 | C021 | 0.8mM |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 10mM |
| 피펫 솔루션 | |||
| KCl | 시그마-알드리치 | 221473 | 3M |
| 사포닌 솔루션 | |||
| 사포닌 | 시그마-알드리치 | 47036 | 0.125g |
| 내부 용액 | : 위 | : 50mL | |
| 한천 다리 용액 | |||
| : N- 메틸 -D- 글루카민 (NMDG) | 시그마 - 알드리치 | M2004 | 100ml 1M |
| HEPES | Research Products International | H75030 | 1.2g |
| MES 수화물 | 시그마 - 알드리치 | M8250 | 가변 (pH 7.4) |
| 과립 한천 | 연구 제품 International | A20250 | 3% |
| NMDG 저장 솔루션 | |||
| NMDG, HEPES, MES 수화물 용액 | 위 | 40ml | |
| 물 | 60ml | ||
| 재료/장비 회사 이름 | 카탈로그 번호 | 코멘트/설명 | |
| 고성능 난모 세포 클램프 | Dagan | CA-1B | |
| 데이터 수집 시스템 | Axon CNS | Digidata 1440A | |
| 오실로스코프 | Tektronix | TDS 210 | |
| 랙 전원 필터 | APC | G5 | |
| 가열/냉각 수조 온도 컨트롤러 | Dagan | HCC-100A | |
| PC | Dell | Optiplex 990 | |
| pCLAMP 10.3 전압 클램프 소프트웨어 | Molecular Devices, LLC | pCLAMP10.3 | |
| TMC 진동 제어 탁상용 플랫폼 | TMC | 64 시리즈 | |
| TMC 진동 제어 에어 테이블 | TMC | 20 시리즈 | |
| V1/I 전극 데이터 수집기 | Dagan CA-1B | ||
| MX10L Micromanipulator | Siskiyou | MX10L | |
| 배스/가드(I/V) 헤드스테이지(적절한 커넥터 포함) | CA-1B | Dagan | |
| Omano | OM2300S-JW11 | ||
| 온도 제어 배스 | 사용자 정의 또는 Dagan | 사용자 정의 또는 HE-204C | Cool Polymers (D 시리즈)의 재료로 만든 맞춤형 챔버. Dagan은 또한 사전 사용 가능한 스테이지(HE-204C)를 제공합니다. |
| 사용자 정의 AgCl 펠렛 용기 | 사용자 | 정의 | 사용자 정의 가공 |
| Ag / AgCl 전극, 펠렛, 2.0 mm | Warner | E-206 | |
| 외부 난모 세포 목욕 | 사용자 정의 또는 Dagan | 사용자 정의 또는 CC-1-T-LB | 사용자 정의 기계 가공 또는 Dagan |
| 내부 난모 세포 목욕 | 사용자 정의 또는 | Dagan 사용자 정의 또는 CC-TG-ND | 사용자 정의 기계 가공 또는 Dagan |
| 에서 구매한천 다리 및 당겨진 전극 용 모세 혈관 | Warner | G150T-4 | |
| 현미경, 미세 조작기 및 욕조 용 회전 가능한 마운트 | Siskiyou | SD-1280P | |
| Fiber-Lite | Dolan-Jenner | LMI-600 | |
| Regular | Bleach Clorox | 470174-764 | |
| Xenopus laevis Oocytes | Nasco | LM535M (성적으로 성숙한 여성) | |
| 90 Na+ 외부 솔루션 | 솔루션 시트 | ||
| 참조 10 Na+ 내부 솔루션 | 솔루션 시트 | ||
| 참조 3 M KCL | 솔루션 | ||
| 보기 Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| NMDG 스토리지 솔루션 | 솔루션 시트 | ||
| 보기5mL 전사 피펫 | SciMart | GS-52 | |
| Modified KCl 전극 인젝터 | BD | 309659 | 플라스틱 주사기 팁이 용융되어 전극에 용액을 주입할 수 있습니다. 또는 WPI의 Microfil을 구입할 수 있습니다. |
| Microvaccum | 맞춤형 | 펜 | |
| 치 | VWR | 63040-458 | |
| 난자 처리 도구 (피펫 펌프) | VWR | 53502-222 | |
| 탈이온수 분출 병 | VWR | 16649-911 | |
| 바셀린 석유 젤리 | Fisher Scientific | 19-086-291 | |
| VCF 기록에 필요한 추가 재료: | |||
| VCF 현미경 | Nikon | Eclipse, FN1 | |
| Nikon CFI, APO 40XW, NIR 대물 | Nikon | N40X-NIR | |
| X-Y 고정 스테이지 정립 현미경용 변환기 시스템, | Sutter Instruments | MT500-586 | |
| 외부 VCF 난자 수조 | 사용자 정의 | 맞춤 가공. 챔버 크기는 2.7 x 1.9 x 0.4cm입니다. | |
| 내부 VCF 난모세포 목욕 | 맞춤형 | 가공. 챔버 치수는 1.6 x 1.6 x 0.4cm입니다. | |
| Modified Temperature Control Bath Custom | Cushion은 Cool Polymers (D 시리즈)의 재료로 제작되었습니다. 수정된 온도 조절기 수조의 챔버 치수는 수평 챔버의 경우 2.7 x 1.9 x 0.3cm이고 수직 챔버의 경우 1 x 2.5 x 0.5cm입니다. |
참고문헌
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in KV channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 8272-8277 (2013).
- Stefani, E., Bezanilla, F. Cut-open oocyte voltage-clamp technique. Methods Enzymol
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재인쇄 및 허가
