방법 논문

조직 공학 : 계층화 된 세포 시트의 전달을위한 다세포 3D 비계 건설

DOI:

10.3791/51044

⸱

2014년 10월 3일

 ,  , 
1School of Engineering, University of California, Merced

이 논문에서

요약

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복잡한 조직의 고도로 조직화된 구조를 만들려면 여러 재료 및 세포 유형을 통합된 복합체로 조립해야 합니다. 이 조합 설계는 강력한 섬유질 기질 염기를 포함하는 두 가지 별개의 생물학적으로 파생된 물질과 새로운 혈관 형성을 향상시키기 위한 내피 세포와 장기 특이적 층상 세포 시트를 통합합니다.

초록

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이러한 성인의 마음으로 많은 조직은 적절하게 손상 후 재생 할 수 없습니다. 조직 공학에서 2,3 전략 복구 및 수리에 몸을 지원하기 위해 혁신을 제안한다. 예를 들어, TE 방식은 심근 경색 (MI) 후 심장 리모델링을 약화 가능성이 거의 정상 사전 MI 수준으로 전체 심장 기능을 향상시킬 수 있습니다. 4, 심장 조직을 성공적으로 재생이의 적절한 전달이 포함 기능적 조직과 마찬가지로 이식 된 세포 / 조직 이식의 통합과 생존에 유리한 환경 단서 여러 세포 유형. 배달 차량, 세포 생존에 미치는 영향, 재료 강도 및 세포 간 조직의 조직의 촉진으로 평가 용해 신호, 세포 간 상호 작용 및 매트릭스 재료 : 엔지니어링 조직은 다음과 같은 여러 매개 변수를 해결해야합니다. 그래프트 세포의 직접 분사 만이 필수 요소를 무시를 이용하는 연구. 2,5,6이 성분을 결합 조직 설계는 아직 개발되어야한다. 여기서, 우리는 "조직"에서 새로운 혈관의 형성을 향상시키기위한 표적 장기 세포 유형 및 내피 세포를 포함하는 생물학적 유래 물질의 두 가지 유형의 패턴 화 된 세포 시트의 레이어를 이용하여 통합 된 디자인의 예를 제시한다. 이러한 연구는 심장과 같은 조직의 생성에 집중하더라도,이 조직 설계는 최소한의 디자인 및 재질 변경 심장 이외의 여러 장기에 적용 할 수 있고, 회생 치료를위한 상용 제품이 될 것을 의미한다. 이 프로토콜은 다섯 자세한 단계가 포함되어 있습니다. 온도에 민감한 폴리 (N의 -isopropylacrylamide) (pNIPAAM은) 코트 조직 문화 요리에 사용됩니다. 이어서, 조직 특이 세포는 강한 횡 유착 세포 시트를 형성하기 위해 코팅 된 플레이트 / 미세 패턴 표면의 표면 상에 배양한다. 셋째, 기본 매트릭스는 신생 혈관 permissi 다공성 매트릭스와 결합하여 조직을 위해 생성 된하이드로 겔과 내피 세포를했습니다. 마지막으로, 세포 시트 pNIPAAM 코팅 접시로부터 해제되어 완전한 구조를 만드는 기본 요소로 전송.

서론

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세포 및/또는 단일 물질의 주입만으로도 다른 장기 시스템에서는 다양한 성공을 보였고 심장 재생에서는 제한적인 성공을 보였습니다. 5,7-12 현재 줄기세포 유래 세포는 조직에 세포를 직접 주입하고 혈액 공급을 통해 관류하는 등 다양한 전달 방법을 사용하여 손상된 조직에 전달됩니다. 13-17 다른 사람들은 손상된 장기의 재생을 돕기 위해 세포만 이식하거나, 물질만 이식하거나, 물질 운반체와 함께 이식합니다. 18-21 이 설계는 재료 강도를 제공하는 여러 전략, 여러 재료 및 여러 세포 유형에서 패터닝을 결합합니다.

구체적으로, 염기 무세포화된 섬유 기질은 구조물에 기초적인 물리적 강도를 제공하여 필요한 경우 환자에게 봉합하기에 적합합니다. 기저 매트릭스의 공극 공간은 이식된 구조체의 혈관화를 신속하게 확립하기 위해 신생혈관 허용 하이드로겔(22)의 내피 세포로 채워져 있습니다. 그런 다음 이 복합체는 향상된 세포 간 통신을 가능하게 하고 네이티브 조직을 보다 밀접하게 모방할 수 있는 사전 패턴화된 세포 시트와 통합됩니다. 1,23-25 층상 세포 패치의 전체 생산 공정은 그림 1의 순서도에 요약되어 있습니다.

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프로토콜

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pNIPAAM 코팅 된 플레이트의 1 창조

  1. 60 % 톨루엔 / 40 % 헥산 용액 2 ㎖에 pNIPAAM의 2.6 g을 녹인다.
  2. pNIPAAM이 용해 될 때까지 교반 10 분 동안 60 ° C로 가열하여 혼합합니다.
  3. 뷰 흐너 깔때기에 60mm 직경의 원과 장소 종이에 종이 필터를 잘라.
  4. 미리 칭량 유리 비이커 흐너 깔때기를 통해 용액 (헥산 플라스틱을 용융하는 바와 같이, 플라스틱을 사용하지 않음) 필터.
  5. 벨 진공 (24 PSI) O / N (16 시간)로 비커와 내용을 놓습니다. 참고 : 잔류 이소 프로필과 반응 할 때까지 그렇게는 산소와 접촉하지 않는지 확인 산화됩니다.
  6. pNIPAAM의 무게를 설정하는 비커의 무게를 측정.
  7. 솔루션 w / w 50 대 50을 만들어 pNIPAAM에 이소 프로필 알코올을 추가합니다.
  8. UV 빛 아래 5 분의 조직 배양 판의 표면에 솔루션 및 코트 2 ㎖를 놓습니다.
  9. 두 번 따뜻한 PBS의 2 ㎖의 접시를 씻으세포 배양에 사용하기 전에.

세포 시트의 2 창조

주 : 표적 장기에 대한 일차 세포의 세포 시트를 서로 다른 방법들을 사용하여 생성 될 수 있고, 또는 여기에서 설명한 바와 같이 열 응답 성 폴리머로 조직 배양 표면을 코팅하여. 사전 코팅 온도에 민감한 판은 공급 업체들에 의해 제공됩니다.

참고 :이 프로토콜은 35mm 접시를 사용하여 문화입니다. 간단히, 세포는 제 1 인접 셀 사이의 수평 연결을 설정할 수 합류에 24 시간의 최소 37 ° C에서 배양된다. 세포 시트를 해제하려면 판은 32 ° C 이하의 온도로 실시한다. 세포 시트는 후 혈관 내피 세포와 혈관 신생 허용 하이드로 겔을 포함하는 강염기 섬유상 매트릭스에 전송된다.

  1. 세포 집단을 분리합니다. 주 :이 방법은 개개의 도출 과정과 세포 유형에 의존한다. 쥐 대동맥 부드러운 무scle 세포 (RASMC)이 예에서 사용됩니다. 이들은 쥐의 복부 대동맥으로부터 분리 일차 평활근 세포이다.
  2. 따뜻한 PBS의 2 ㎖의 세포를 씻으십시오.
  3. 5 분 동안 세포에 트립신 (또는 다른 클 리빙 / 연결 해제 용액) 3 ㎖를 추가합니다.
  4. 10 % 태아 소 혈청 (FBS)을 함유하는 배지, 또는 인산 완충 용액 (PBS) 3 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 억제한다.
  5. 원뿔 튜브에 세포를 수집하고 나누어지는 계산합니다.
  6. 5 분 동안 1,000 rpm으로 (228 XG)에서 세포를 스핀.
  7. 뜨는을 기음과 성장 배지에서 세포를 재현 탁 (SmGM2 플러스 총알 키트 배양액 RASMC에 사용됩니다).
  8. 백퍼센트 합류를 달성하기위한 농도 pNIPAAM 코팅 플레이트 - 35mm의 온도에 민감한 접시에 세포를 포함하는 미디어를 넣습니다. 주 : RASMCs 들어 그 숫자 / cm 2 100,000 세포로 측정되었다. 그 버지니아의 그러나, 통과하는 동안 세포의 손실, 120 % 루이 사용됩니다.
  9. 37 ° CO / N에서 인큐베이터에 놓습니다. 참고 : 접시에 세포 부착을 유지하기 위해 37 ° C에서 세포를 유지하는 것이 중요합니다.

파운데이션 매트릭스의 3 준비

참고 : 다양한 3D 섬유 행렬이 섬세한 세포 시트 사이에 강한 섬유 매트릭스를 레이어 할 수 있습니다. 예를 들면 다음과 같습니다 : gelfoam을, 바이오 글라스, 자연 acellularized 소재 26 또는 nanospun 재료 (27, 28)을이 연구에 사용 된 돼지 방광 매트릭스 (UBM)가 관대하게 우리의 협력자, 박사 Badylak에서 제공 한 29.

  1. decellularized 행렬이 사용되는 경우, 셀룰러 함량의 부족을 포함 매트릭스의 특성을 결정 27,28 특정 세포 생존 능력, 및 보이드 공간을 사용하기 전에. 22
  2. 원하는 크기와 형상으로 예비 살균 행렬을 잘라. 주 : 여기에서, 홀 펀치 4mm 직경의 원을 절단하는 데 사용된다.
ve_title "> 4. 신생 혈관 허용 히드로 겔로 시드 내피 세포

주 : 내피 줄기 세포 또는 전구 세포로부터 분화 포함한 다양한 소스로부터 획득 될 수있다. 여기에, HUVECs를 사용한다.

  1. 가교 시간만큼 긴 허용 하이드로 겔 (피브린, 콜라겐 젤)를 사용하면 세포가 가능한 머물 수 있도록 충분히 짧다. 주 : 여기에서, 히알루 론산 (HA)을 기반 겔 디설파이드 브릿지가 사용으로 가교.
  2. 회사 프로토콜에 따라 HA 하이드로 젤을 준비한다.
  3. 내피 세포를 수집하고 1X 트립신을 사용하여 단일 세포로 분산 용액. 참고 : Accutase 또는 세포 분열 버퍼는 단일 세포 분산에 사용될 수 있습니다.
  4. 또는 PBS에 10 % FBS 용액 / 15 ㎖ 중에 세포 원추형 튜브를 수집 (이것은 세포가 혈청과 접촉하지 않는 것이 중요한 경우) 대두 트립신 억제제의 동등한 양을 사용하여 트립신 효소를 비활성화.
  5. C세포 ount과 패치 사이즈에 필요한 양을 계산한다 (이전 정량화). 참고 : 4mm 패치, 여기 2,000,000 내피 세포가 사용된다.
  6. 2,000,000 세포를 추출, 새로운 15 ML 원뿔 튜브에 배치합니다.
  7. 5 분 (228 XG)에 스핀.
  8. 원뿔 튜브에서 펠릿으로 세포를 떠나, 뜨는을 대기음.
  9. 한 배급 : 1의 HA 및 젤라틴 액체 재료를 섞는다. 이어서 펠렛을 함유하는 원뿔형 튜브에 전체 부피의 80 %를 추가한다.
  10. 한 HA / 젤라틴 혼합물 : 1의 내피 세포를 재현 탁
  11. 2 단계에서 기본 섬유 매트릭스로 HA / 젤라틴 혼합물에서 일시 중단 된 세포를 놓습니다.
  12. 가교제의 원하는 총 부피 1/5 (20 %)를 추가
  13. 37 ° C에서 1 시간 동안 품어.

세포 시트의 5 분리

  1. 세포 배양 후드에서의 인큐베이터 및 장소에서 세포를 함유하는 35mm pNIPAAM 처리 판을 제거RT.
  2. 신속하게 세포에서 미디어를 대기음, 37 ° C로 가열 된 6 % 정상 젤라틴 2 ㎖를 추가합니다.
  3. 젤라틴이 남아있는 동안, 일반 젤라틴 (동영상 1)의 표면 아래에 침수, 젤라틴으로 금속 격자를 배치합니다.
  4. 젤라틴은 강화 할 수 있도록 5-7 분 동안 얼음에 전체 판을 놓습니다.
  5. 7 분 후, 조심스럽게 플레이트 측으로부터 젤라틴 에지를 분리하는 주걱을 사용하고 플레이트 주부터 금속 격자 리프트 집게를 사용 : 6 % 젤라틴, 및 세포 시트는 격자 리프트한다.
  6. 접시에 세포 시트를 이동하고 조심스럽게 구조의 상단에있는 격자를 설정, 기본 섬유 매트릭스 하이드로 겔 조합의 상단에 배치합니다. 참고 : 셀 시트의 꼭대기 쪽은 여전히​​ 최고 위치에있을 것입니다.
  7. 따뜻한 미디어 (37 ° C) 2 ㎖를 추가합니다.
  8. O / N은 ​​하이드로 겔 표면에 부착하기 위해 세포 시트를 허용 부화.
  9. t 제거용액 (약 1 시간), 또는 그 다음날 따뜻해 후 그는 금속 격자.

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결과

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흐름도 (도 1)는 다층 패치를 제조하는 전체적인 방법을 도시한다. 세포 시트를 32 ° C 이하의 온도를 떨어 뜨려 pNIPAAM 처리 플레이트에서 분리된다. 이어서 세포 시트는 기본 섬유 매트릭스 (도 1)로 파종 혈관 내피 세포를 포함하는 가교 된 하이드로 겔의 상단에 배치된다. 전처리 감열 플레이트는 또한 세포 시트를 만드는 데 사용할 수있다. 특별 위상 표면은 특별히 패턴 셀 (30) (즉, 정렬)하는 데 사용됩니다.

베이스 섬유상 매트릭스는 네이티브 조직 매트릭스 또는 전기 방사를 decellularizing로부터 생성 될 수있다. 여기서, 섬유 재료 시트는베이스 패치 (도 2A)에 대한 4mm 직경으로 절단 하였다. 이 물질의 특성은 공극 공간을 채우기 위해 사용될 수있는 하이드로 겔의 양을 결정하는 것이 중요하다. 여기에서 사용 된 행렬...

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토론

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프로토콜의 중요한 단계는 다음과 같습니다 thermoresponsive 폴리머 플레이트 표면을 코팅하고 판을 냉각 한 후 세포 시트를 조작. 상이한 셀들이 서로 다른 물리적 특성을 보일 수 있기 때문에, 점착성 같이, 승강 시간은 서로 다른 세포 유형에 대해 최적화되어야한다. 이 프로토콜의 제 2 및 가장 현저 도전 성분은, 세포 시트, 티슈 조립 방법의 중요한 양태의 조작을 중심. 세포 시트의 단일 셀 층은 매우 취약하고 집게를 조작하면 쉽게 찢어 수 있습니다. 세포 시트 위치에 고정되지 않은 경우 또한, 그들은 계약을 체결하는 경향이 쉽게 접을 수 있습니다. 지지 스크린을 사용하여 제안 된 세포 시트 전송 깨지기 세포 시트의 조작을 돕는다.

이 논문에 제시된 설계 방법은 조직 공학 어플리의 다양한 세포 시트를 작성하여 매우 저가의 방법을 제공한다양이온. 또한, 대학 연​​구소 내 pNIPAAM 코팅 플레이트를 만드는 것은 여러 세포 유형, 및 표면을 수용하기 위해 만들어 ...

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공개 사항

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우리는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 캘리포니아 재생의학회(California Institute of Regenerative Medicine, CIRM; RN2-00921-1), NIH 자금 지원 국가 연구상(F32-HL104924) 및 CIRM 교육 보조금(TG21163). 자료 제공: Glycosan Biosystems Inc / BioTime 및 Dr. Stephen Badylak (University of Pittsburgh)

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Reagents
Calcein-AMInvitrogenC3099Cell tracker / live dye
Lysotracker RedInvitrogenL7528Cell
tracker Neutral RedSigmaN7005Visible Cell dye
pNIPAAMSigma Aldrich412780250Poly(N-isopropylacrylamide)
톨루엔시그마 Aldrich244511-1L
헥산시그마 Aldrich296090-1L
RAOSMCLonzaR-ASM-580쥐 대동맥 평활근 세포
SmGM2LonzaCC-4149평활근 매체
HUVECInvitrogenC-003-5C인간 정맥 내피 세포
HyStem글리코산/ Biotime
이소프로필 알코올VWR InternationalBDH1133-4LP
TrypsinCorning Cellgro25-053-C1
PBSGibco14287-072
FBSGibco16140-071
Specific Equipment
Filter paperAhlstrom 6310-0900 
부흐너 퍼널 시그마 알드리치 Z247308 
UpCell 플레이트 수녀 2014-11년 
자외선 JelightCompany UVO 클리너 No.42

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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