일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.
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이 논문에서
요약
초록
이동은 살아있는 세포의 주요 특성이며 정상적인 발달, 면역 반응 및 암 전이 및 염증과 같은 질병 과정에 중요합니다. 세포 이동을 조사하는 방법은 암 생물학, 면역학, 혈관 생물학, 세포 생물학 및 발생 생물학과 같은 광범위한 생물 의학 연구에 매우 유용하고 중요합니다. 여기에서는 종양 세포 이동 및 침입을 예로 사용하고 이러한 과정을 측정하기 위해 일반적으로 사용되며 쉽게 액세스할 수 있는 방법을 설명하기 위해 두 가지 관련 분석을 설명합니다. 첫 번째 방법은 세포 배양 상처 폐쇄 분석(cell culture wound closure assay)으로, 이 분석에서는 융합 세포 단층에 스크래치가 생성됩니다. 상처 봉합 및 세포 이동의 속도는 여러 시간 간격으로 일반 도립 현미경으로 스냅샷 사진을 촬영하여 정량화할 수 있습니다. 보다 자세한 세포 이동 행동은 타임 랩스 현미경 시스템을 사용하여 문서화할 수 있습니다. 이 논문에서 설명한 두 번째 방법은 트랜스웰 세포 이동 및 침입 분석법으로, 화학 유인 구배에 대한 세포 운동성 및 침습성의 용량을 측정합니다. 우리의 목표는 기본적인 세포 생물학 설정만으로도 연구 실험실에서 절차를 성공적으로 수행할 수 있도록 이러한 방법을 이해하기 쉬운 방식으로 설명하는 것입니다.
서론
운동성 생균의 필수적인 특징이다. 세포 이동은 생활, 배아 발달, 면역 반응 및 암의 전이와 염증 1-9 많은 병적 인 프로세스의 개념에 참여하고있다. 따라서, 세포 이동성 행동을 연구하는 방법은 생명 과학, 생물학, 생명 공학 및 관련 분야의 분야의 광범위한 매우 유용한 연구 도구입니다.
암 환자에서 사망의 주원인은 전이 진행과 관련 될 때 암 연구에서 세포 이동의 연구는 특히 중요하다. 몸 전체에 확산 보급하는 암에 대한 위해, 암 세포가 이주해야하고 intravasate 혈액 순환에, 세포 외 기질 (ECM)을 통해 침입, 먼 사이트에 연결하고, 마지막으로 먼 초점 1,10-12을 형성하는 extravasate. 각종 생물학적 방법에서는 이러한 이벤트를 연구하는데 이용 될 수있다. 세포 배양 상처 폐쇄D 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석 널리 과학계 1,10에 사용됩니다. 이 테스트는 특정 세포 유형이 자발적으로 마이그레이션 또는 화학 - 유인에 반응하고 방향성을 향해 마이그레이션 할 수 있습니다 얼마나 잘 이해를 허용 할 수 있습니다 필요한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 여러 철새 표현형은 설명 하였다. 세포는 중간 엽 또는 아메바 같은 운동이나 13 스트리밍 집단 이주 또는 셀을 표시 다세포 움직임으로 볼과 같은 단일 셀 형태로 마이그레이션 할 수 있습니다. 운동성 전지에 사용 운동의 방법은 쉽게 세포 배양 상처 봉합 분석을 이용하여 관찰 될 수있다.
세포의 이동을 연구하는 여러 가지 방법 중, 세포 상처 봉합 분석은 간단한 중 하나입니다. 이 방법은 전체 세포 덩어리의 이동 능력을 결정하는 데 유용합니다. 한 단계 더 촬영하면 이주 14시 개별 세포의 형태 학적 특징을 관찰 할 수 있습니다. 상처 봉합의 분석을 다음과 같은 여러 표현형은 공개 할 수있다. 컨트롤에 비교할 때 시간이 지남에 따라 폐쇄 된 거리를 측정하는 것은 특정 마이그레이션 변경 또는 이전에 알려지지 않은 장애인 철새 표현형을 보여줄 수 있습니다. 또한, 단일 세포 lamellipodium 형성, 꼬리 후퇴 및 방향 움직임은 관심 (14)의 세포에 손상 또는 향상 될 수 있습니다 무엇에 대한 단서를 제공 할 수 있습니다.
트랜스 웰 이주 및 침윤 분석법은 방향성 그들이 케모카인, 성장 인자, 지질, 또는 뉴클레오티드 4,5,8,15,16 여부 여러가지 항암 화학 유인 제에 응답하는 단일 세포의 능력을 분석하기 위해 사용될 수있다. 또한 인해 1,14 수용체의 과발현으로 차동 이동성 능력을 평가할 수있다. 이러한 분석은 또한 작은 GTPases 2 RHO 가족 같은 세포 이동의 주요 레귤레이터를 식별하고 특성화하기 위해 사용될 수있다. 액세서 쉽게이 짧고 다음sible 검사, 세포 이동의 모드와 3-D 행렬로 침입하는 세포의 능력이 또한 결정될 수있다.
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프로토콜
1. 세포 배양 상처 봉합 분석
- 트립신-EDTA 용액 0.25 %를 이용하여 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리. 원심 분리하여 15 ML 원뿔 관에서 펠렛 세포는, 뜨는을 대기음, 문화 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 24 시간에 100 % 합류에 대한 6 - 웰 플레이트에 세포의 적절한 수의 접시.
주 : 시험 (예를 들어, 1 × 106 B16F10 흑색 종 세포의 우물에 시딩 의한 세포 분류와 잘 사용되는 크기로 100 % 합류점을 달성하기 위해 시간 및 셀의 개수를 결정하기 위해 필요할 수있다 6 잘 플레이트 전에 상처 발생 24 시간). 대안 적으로, 12 - 웰, 24 - 웰 플레이트가 사용될 수있다.
참고 : 가능한 경우, 세포는 상처 프리 캐스트를 만드는 처리 조직 배양 접시에 문화 삽입 (ibidi LLC부터)에 접종 할 수 있습니다. 문화 - 삽입 피펫 팁에 의해 손상으로부터 조직 배양 판의 표면을 보호 할 수 있습니다. 문화 삽입은 생략 단계를 사용하는 경우1.2. - 무균 환경에서 (일반적으로 바이오 안전성 후드) 조직 배양 플레이트의 상단에 단단히 눌러 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신속하게 세포 단일 층을 통해 아래로 수직으로 상처를 확인합니다. 다른 크기의 피펫 팁이 요망되고 상처 크기를 만들기 위해 사용될 수있다. 그것은 표면에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁으로 조직 배양 플레이트에 과도한 힘을 사용하지 마십시오. 상처 프리 캐스트의 경우,이 단계는 생략 될 수있다.
- 조심스럽게 미디어와 세포 파편을 대기음. 천천히 웰의 바닥을 커버하고 추가적인 세포를 분리 피하기 위하여 잘 벽에 대해 충분히 배양 배지를 추가한다. 상처의 생성 및 검사에 따라 초기 사진이 촬영해야합니다. 적절한 온도와 CO 2 농도 설정 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다 (일반적으로 37 ° C와 5 % CO 2).
- 여러 시점에서, 3 시간마다 예를 들면, incubat에서 플레이트를 분리또는 및 스냅 샷 사진을 촬영하고 상처 폐쇄를 확인하기 위해 거꾸로 현미경 아래에 배치합니다. 시간 경과 현미경을 사용할 수있는 경우 언제든지 온도 기간 및 CO 2 제어 챔버의 사진보기 (일반적으로 5 분마다 시작) 분마다 X 번호를 가지고. 세포의 종류에 따라, 상처 마감 시간이 다를 수 있습니다.
- 스냅 사진의 결과를 분석하기 위해 눈금 막대를 사용하여 다른 상처의 일측의 거리를 측정한다. 산점도 또는 막대 그래프, 예를 들어 그림 1을 사용하여 분석하고 시간이 지남에 분명히 존재하는 상처 폐쇄.
- 시간 경과 사진을 분석하기 위해 비디오를 만들기 위해 (http://rsb.info.nih.gov/ij/에서 자유롭게 사용 가능) ImageJ에 소프트웨어로 사진을 가져옵니다. 이 오픈 ImageJ에 작업을 수행하려면, 가져 오기를 클릭하고 이미지 시퀀스. 사진과 함께 파일을 찾기 파일의 첫 번째 사진을 클릭합니다. , 파일을 선택하여 동영상을 저장으로 저장되고, AVI. 단일 마이그레이션 세포 체인지에 관찰 할 수있다방향 움직임을 cterize. 또한, 이러한 lamellipodia는 형성과 후연 철회 등의 형태 학적 특성 (그림 2와 보조 비디오)뿐만 아니라 공부를 할 수있다.
2.없이 Transwell 세포의 이동과 침략 분석
- 무균 환경 (일반적으로 생물 안전성 후드)에서 비 - 효소 적 세포 탈퇴 버퍼 또는 0.25 % 트립신-EDTA 용액, 펠렛 세포를 원심 분리에 의해를 사용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리하고, 기존의 미디어 펠렛 세포를두기 대기음. 0.1 % BSA (소 혈청 알부민)을 함유하는 무 혈청 세포 배양 배지에서 세포를 다시하는 것은 일시 중지.
참고 : 트립신-EDTA 인해 세포 표면 (17)에 다양한 수용체의 분열로 세포 이동 및 침윤에 영향을 미칠 수 0.25 %를 조사중인 세포주에 따라.
참고 : ML 당 세포의 수는 세포의 크기에 달려있다. 또한 테스트는 프로 시드의 밀도를 찾기 위해 필요할 수있다최상의 결과를 Vides의. 24 잘 삽입 트랜스 웰을 사용하는 경우 일반적으로 1 X 10 6 세포 / ML은 대부분의 세포 유형을위한 좋은 출발점이 될 것입니다. 트랜스 웰 인서트 크기들의 범위 및 추가 셀의 개수는 적절하게 조정되어야있다. - 플레이트 (100) 트랜스 웰 인서트의 필터 멤브레인 위에 셀 솔루션의 μL와 37 ° C에서 10 분 동안 배양하고 5 % CO 2 세포가 정착 할 수 있도록.
주 : 사용 된 트랜스 웰 막의 특정 기공 크기는 샘플에서 세포의 개별 크기에 의존한다. 세포가 너무 작은 경우, 예를 들어, 그들은 이동을 용이하게 할 필요없이 구멍을 통과하거나이 너무 큰 경우 그들은 세공을 맞지 않을 수도있다. 여러 트랜스 웰의 3 μm의 범위 기공 크기와 삽입, 5 μm의 및 세포 이동의 분석 8 μm의가 있습니다. 트랜스 웰 인서트는 코닝 같은 회사에서 상업적으로 이용 가능하다.
참고 : 트랜스 웰의 M을igration 분석은 쉽게 세포 침입 분석을 수행하기 위해 수정 될 수 있습니다. 이렇게 트랜스 웰 막 위에 세포 외 기질 (ECM) 물질을 추가 한 다음 ECM의 상단에 셀을 추가합니다. 예를 들어, 매트 리겔은 해동하고 얼음에 액화 한 후 마트 리젤 30-50 μL가 삽입 트랜스 웰 24 웰에 첨가하고, 얇은 겔층을 형성하기 위하여 15-30 분 동안 37 ° C의 배양기에서 고화. 세포 용액을 세포 외 기질을 통해 침입을 시뮬레이션하는 마트 리겔 코팅의 상부에 첨가된다.
참고 : 트랜스 웰의 세포 이동 및 트랜스 웰의 세포 침입 분석 사이에 뚜렷한 차이가 있습니다. 트랜스 웰의 세포 이동 분석은 화학 - 유인을 향한 세포의 화학 주성 능력을 측정합니다. 트랜스 웰 세포 침윤 분석은, 그러나, 일반적으로 세포 외 매트릭스와 암전 또는 배아 발달에서 발견되는 프로세스를 세포 주 화성 세포의 침윤을 모두 측정한다. - 피펫을 사용하여, 매우 carefully 24 웰 플레이트의 하부 챔버의 바닥으로 원하는 화학 - 유인의 600 μl를 추가합니다. 트랜스 웰 인서트를 이동하지 않고 화학 - 유인을 추가하고 거품을 생성하지 마십시오. 바닥 잘 화학 - 유인 액 화성 그라데이션을 형성하는 상부 잘 막과 접촉하게 확인하십시오. 배양 시간은 세포의 종류와 사용되는 화학 - 유인에 따라 달라집니다.
참고 : 또한 테스트 잠복기를 결정하기 위하여 필요할 수있다.
참고 : 부착 세포를 들어, 이주 세포 멤브레인 1,8의 타측에 부착된다. 이주 된 세포의 정량화는 단계 2.4 (2.4-2.8가 무균 환경에서 수행 할 필요가없는 단계) 2.8 다음을 행할 수있다. 비 부착 세포의 경우, 이주 된 세포는 하부 챔버의 미디어에 떨어질 것이다. 이주 된 세포의 수는 혈구 계를 이용하여 계산 또는 5 흐름 cytometer 수있다. - 플레이트에서 트랜스 웰 삽입물을 분리. 필요에 따라 신중하게 손상시키지 않고 멤브레인의 상단에서 마이그레이션되지 않은 미디어와 남아있는 세포를 제거하기 위해 여러 번 면봉을 사용합니다.
- 24 웰 플레이트의 우물에 70 % 에탄올 600 ~ 1,000 μl를 추가합니다. 세포 고정을 할 수 있도록 10 분 동안 70 % 에탄올로 트랜스 웰 인서트를 놓습니다. 24 - 웰 플레이트에서 트랜스 웰 인서트를 제거하고 세포막의 상단에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 면봉을 사용합니다. 트랜스 웰의 막 (10-15 분) 건조하도록 허용합니다.
- 24 - 웰 플레이트의 우물에 0.2 % 크리스탈 바이올렛의 600 ~ 1,000 μl를 추가하고 염색을 위해 그것으로 막을 놓습니다. 5 ~ 10 분 실온에서 알을 품다.
- 부드럽게 피펫 팁이나 면봉으로 멤브레인의 상단에서 크리스탈 바이올렛을 제거합니다. 필요에 따라 매우 신중하게, 고정 된 세포를 세척 방지하기 위해 여분의 크리스탈 바이올을 제거하기 위해 여러 번 증류수로 막 찍어t. 트랜스 웰 막 건조 할 수 있습니다.
- 보기 거꾸로 현미경 아래 및 화학 - 유인 향해 막을 통해 이주 및 멤브레인의 밑면 (도 3)에 부착 한 세포의 평균 합계를 얻기 위해 뷰의 다른 분야에서 세포의 수를 센다.
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결과
여기에 제시된 상처 봉합 분석 및 트랜스 웰의 세포 이동 분석법이 모델 시스템으로 마우스 B16F10 흑색 종 세포를 이용하여 수행 하였다. 상처 봉합 분석에서, B16F10 세포를 10 - 웰 조직 배양 접시에 접종하고, 24 시간에 100 % 합류로 성장시킨다. 약 700 μm의 폭의 상처는 시간 경과 현미경을 사용하여 촬영 한 피펫 팁과 상처 봉합 (세포의 이동)를 사용하여 생성되었습니다. 또한, 상처 폐쇄는 시간 경과 현미경 1을 사용할 수없는 경우 서로 다른 시간 지점에서 스냅 샷 사진을 촬영하여 공부하실 수 있습니다. 포 0에서 시간 경과 시리즈에서 사진, 4, 8 및 12 시간 지점은도 1에 나타낸다. 상처의 폭에 기초하여, 우리는 40.42 μM에서 세포 이동의 이동 거리와 속도를 계산 / 시간 (그림 1B). 시간 경과 사진은 ImageJ에 프로그램 (부가 영상을 참조)를 사용하여 비디오로 조립 하였다. 일전자 동적 세포 이동 과정...
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토론
세포 이동은 암 연구에 연구하는 중요한 측면이며, 또한, 면역 발달 및 상처 치유의 연구에 적용될 수있다. 세포 배양은 폐쇄 분석 상처와 트랜스 웰의 세포 이동 및 침윤 분석 세포 이동성 행동의 자세한 정보를 공개하고 세포 이동 1,2,10,14의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 B16F10 흑색 종 세포주의 이동 속도 및 침윤 능력을 결정하기 위하여 이러한 세포 운동성 분석법을 사용 하였다.
셀 상처 봉합 분석은 세포의 합류 접시 제 상처 마이그레이션이어서 닫을 특정 세포주의 능력을 검사한다. 이 분석은 기본 장비와 기존의 방법에 비해 그룹에 매우 접근은 세포 이동을 측정하는 간단한 방법입니다. 상처 봉합 분석에서 일부 편차가 개별 처리 군에서 발견 될 수 있지만, 여러 단계가 있다는 매사추세츠Y는 그것을 줄이는 데 도움 취할. 편차를 줄이기위한 하나의 잠재적 인 방법은 합류 동기를 달성하고, 각 실험의 시작에서 건강한 세...
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 비디오 제작에 도움을 준 ECU Multimedia & Technology Services의 Mike Myles, Sam Saunders, C.W. Elton에게 감사를 표합니다. 노스캐롤라이나 생명공학 센터(North Carolina Biotechnology Center), 암에 맞서는 골퍼(Golfers against Cancer), 브로디 브라더스 기부 기금(Brody Brothers Endowment Fund), 미국 심장 협회(American Heart Association), ECU/비단트 암 연구 및 교육 기금(ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund, L.V.Y. 및 M.J.R.)의 보조금 지원에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 둘베코' s modified Eagle medium (DMEM) | Gibco | 11995-073 | |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Gemini | 100106 | |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | |
| 트립신 EDTA 0.25% | Gibco | 25200-056 | |
| Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (DPBS) | Gibco | 14190-250 | |
| 크리스탈 바이올렛 | 시그마 | C0775-100G | 0.2%세포 |
| 분리 완충액 | Gibco | 13151-014 | |
| 세포 배양 인큐베이터 | Thermo Fisher Scientific | 모델 # 3145 | |
| SterilGARD 생물안전 후드 | The Baker Company, Inc. | 모델 # VBM-600 | |
| EVOS Fl 도립 현미경 | Thermo Fisher Scientific | 모델 # AMF-4302-US | |
| 조직 배양 플레이트 | Becton Dickinson | 353046 | 카탈로그 번호는 배양 플레이트의 유형에 따라 다릅니다. |
| Corning Transwell insert | Fisher | 07-200-150 | 카탈로그 번호는 멤브레인의 기공 크기에 따라 다릅니다 |
참고문헌
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