체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

요약

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

초록

이동은 살아있는 세포의 주요 특성이며 정상적인 발달, 면역 반응 및 암 전이 및 염증과 같은 질병 과정에 중요합니다. 세포 이동을 조사하는 방법은 암 생물학, 면역학, 혈관 생물학, 세포 생물학 및 발생 생물학과 같은 광범위한 생물 의학 연구에 매우 유용하고 중요합니다. 여기에서는 종양 세포 이동 및 침입을 예로 사용하고 이러한 과정을 측정하기 위해 일반적으로 사용되며 쉽게 액세스할 수 있는 방법을 설명하기 위해 두 가지 관련 분석을 설명합니다. 첫 번째 방법은 세포 배양 상처 폐쇄 분석(cell culture wound closure assay)으로, 이 분석에서는 융합 세포 단층에 스크래치가 생성됩니다. 상처 봉합 및 세포 이동의 속도는 여러 시간 간격으로 일반 도립 현미경으로 스냅샷 사진을 촬영하여 정량화할 수 있습니다. 보다 자세한 세포 이동 행동은 타임 랩스 현미경 시스템을 사용하여 문서화할 수 있습니다. 이 논문에서 설명한 두 번째 방법은 트랜스웰 세포 이동 및 침입 분석법으로, 화학 유인 구배에 대한 세포 운동성 및 침습성의 용량을 측정합니다. 우리의 목표는 기본적인 세포 생물학 설정만으로도 연구 실험실에서 절차를 성공적으로 수행할 수 있도록 이러한 방법을 이해하기 쉬운 방식으로 설명하는 것입니다.

서론

운동성 생균의 필수적인 특징이다. 세포 이동은 생활, 배아 발달, 면역 반응 및 암의 전이와 염증 ^1-9 많은 병적 인 프로세스의 개념에 참여하고있다. 따라서, 세포 이동성 행동을 연구하는 방법은 생명 과학, 생물학, 생명 공학 및 관련 분야의 분야의 광범위한 매우 유용한 연구 도구입니다.

암 환자에서 사망의 주원인은 전이 진행과 관련 될 때 암 연구에서 세포 이동의 연구는 특히 중요하다. 몸 전체에 확산 보급하는 암에 대한 위해, 암 세포가 이주해야하고 intravasate 혈액 순환에, 세포 외 기질 (ECM)을 통해 침입, 먼 사이트에 연결하고, 마지막으로 먼 초점 ^1,10-12을 형성하는 extravasate. 각종 생물학적 방법에서는 이러한 이벤트를 연구하는데 이용 될 수있다. 세포 배양 상처 폐쇄D 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석 널리 과학계 ^1,10에 사용됩니다. 이 테스트는 특정 세포 유형이 자발적으로 마이그레이션 또는 화학 - 유인에 반응하고 방향성을 향해 마이그레이션 할 수 있습니다 얼마나 잘 이해를 허용 할 수 있습니다 필요한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 여러 철새 표현형은 설명 하였다. 세포는 중간 엽 또는 아메바 같은 운동이나 ^{13 스트리밍....}

프로토콜

1. 세포 배양 상처 봉합 분석

1. 트립신-EDTA 용액 0.25 %를 이용하여 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리. 원심 분리하여 15 ML 원뿔 관에서 펠렛 세포는, 뜨는을 대기음, 문화 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 24 시간에 100 % 합류에 대한 6 - 웰 플레이트에 세포의 적절한 수의 접시.
   주 : 시험 (예를 들어, 1 × ¹⁰⁶ B16F10 흑색 종 세포의 우물에 시딩 의한 세포 분류와 잘 사용되는 크기로 100 % 합류점을 달성하기 위해 시간 및 셀의 개수를 결정하기 위해 필요할 수있다 6 잘 플레이트 전에 상처 발생 24 시간). 대안 적으로, 12 - 웰, 24 - 웰 플레이트가 사용될 수있다.
   참고 : 가능한 경우, 세포는 상처 프리 캐스트를 만드는 처리 조직 배양 접시에 문화 삽입 (ibidi LLC부터)에 접종 할 수 있습니다. 문화 - 삽입 피펫 팁에 의해 손상으로부터 조직 배양 판의 표면을 보호 할 수 있습니다. 문화 삽입은 생략 단계를 사용하는 경우1.2.
2. 무균 환경에서 (일반적으로 바이오 안전성 후드) 조직 배양 플레이트의 상단에 단단히 눌러 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신속하게 세포 단일 층을 통해 아래로 수직으로 상처를 확인합니다. 다른 크기의 피펫 팁이 요망....

결과

여기에 제시된 상처 봉합 분석 및 트랜스 웰의 세포 이동 분석법이 모델 시스템으로 마우스 B16F10 흑색 종 세포를 이용하여 수행 하였다. 상처 봉합 분석에서, B16F10 세포를 10 - 웰 조직 배양 접시에 접종하고, 24 시간에 100 % 합류로 성장시킨다. 약 700 μm의 폭의 상처는 시간 경과 현미경을 사용하여 촬영 한 피펫 팁과 상처 봉합 (세포의 이동)를 사용하여 생성되었습니다. 또한, 상처 폐쇄는 시간 경과 현미경 ^1을 사용할 수없는 경우 서로 다른 시간 지점에서 스냅 샷 사진을 촬영하여 공부하실 수 있습니다. 포 0에서 시간 경과 시리즈에서 사진, 4, 8 및 12 시간 지점은도 1에 나타낸다. 상처의 폭에 기초하여, 우리는 40.42 μM에서 세포 이동의 이동 거리와 속도를 계산 / 시간 (그림 1B). 시간 경과 사진은 ImageJ에 프로그램 (부가 영상을 참조)를 사용하여 비디오로 조립 하였다. 일전자 동적 세포 이동 과정.......

토론

세포 이동은 암 연구에 연구하는 중요한 측면이며, 또한, 면역 발달 및 상처 치유의 연구에 적용될 수있다. 세포 배양은 폐쇄 분석 상처와 트랜스 웰의 세포 이동 및 침윤 분석 세포 이동성 행동의 자세한 정보를 공개하고 세포 이동 ^1,2,10,14의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 B16F10 흑색 종 세포주의 이동 속도 및 침윤 능력을 결정하기 위하여 이러한 세포 운동성 분석법을 사용 하였다.

셀 상처 봉합 분석은 세포의 합류 접시 제 상처 마이그레이션이어서 닫을 특정 세포주의 능력을 검사한다. 이 분석은 기본 장비와 기존의 방법에 비해 그룹에 매우 접근은 세포 이동을 측정하는 간단한 방법입니다. 상처 봉합 분석에서 일부 편차가 개별 처리 군에서 발견 될 수 있지만, 여러 단계가 있다는 매사추세츠Y는 그것을 줄이는 데 도움 취할. 편차를 줄이기위한 하나의 잠재적 인 방법은 합류 동기를 달성하고, 각 실험의 시작에서 건강한 세.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
둘베코' s modified Eagle medium (DMEM)	Gibco	11995-073
소 태아 혈청 (FBS)	Gemini	100106
소 혈청 알부민 (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503-50G
트립신 EDTA 0.25%	Gibco	25200-056
Dulbecco' s 인산염 완충 식염수 (DPBS)	Gibco	14190-250
크리스탈 바이올렛	시그마	C0775-100G	0.2%세포
분리 완충액	Gibco	13151-014
세포 배양 인큐베이터	Thermo Fisher Scientific		모델 # 3145
SterilGARD 생물안전 후드	The Baker Company, Inc.		모델 # VBM-600
EVOS Fl 도립 현미경	Thermo Fisher Scientific		모델 # AMF-4302-US
조직 배양 플레이트	Becton Dickinson	353046	카탈로그 번호는 배양 플레이트의 유형에 따라 다릅니다.
Corning Transwell insert	Fisher	07-200-150	카탈로그 번호는 멤브레인의 기공 크기에 따라 다릅니다

에서 물에 용해 .