신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션을 포함하여 뇌의 발달 이벤트는 높은 체외. 프로세스를 조율하고 생체 내에서 이러한 이벤트에 참여 경로를 식별하기 위해 심도있는 특성을 허용 분석된다. 개발 소뇌에서 파생 된 소뇌 과립 뉴런 (CGNs)의 형태 학적 분석을 위해 수있는 이상적인 모델 시스템이다. 다음, 우리는 유전자 CGNs를 조작하는 방법에 대한 방법과 방법을 개별 뉴런의 axono 및 dendritogenesis를 공부하는 방법에 대해 설명한다. 이 방법으로 RNA 간섭, 과발현 또는 작은 분자의 효과는 신경 세포를 제어하는 비교 될 수있다. 또한, 쥐의 소뇌 피질은 지배적 인 출생의 개발로 인해 생체 시스템에 쉽게 액세스 할 수 있습니다. 우리는 또한 유 전적으로 조작을 소뇌 현상 및 후속 소뇌를 설명하는 생체 전기 천공 기법을 제시하는 것은 신경 세포 모폴로지를 평가하는 분석ND 마이그레이션.
서론
소뇌는 축삭의 성장과 이동의 메커니즘을 연구 할 수있는 훌륭한 시스템입니다. 소뇌는 신경 과학 (1)의 새벽부터 해부학 적 연구의 대상이되고있다. 현대 현미경과 면역 조직 화학 기술은 크게 확대와 산티아고, 라몬,과를 Cajal 2-4으로 초기 발견을 정제했다. 마우스 유전학과 분자 연구는 소뇌 과립 뉴런 (CGNs) 5-7를 포함하여 신경 세포의 다른 유형의 적절한 배선에 필요한 중요 사건의 더 큰 이해를 주도, 소뇌 개발의 제어에 필수적인 성장과 전사 인자를 발견.
소뇌는 개발 후뇌 8 rhombomere 1의 유도체이다. 제 4 뇌실의 지붕 부분 마름모꼴 립은에서 대부분의 수많은 신경 세포 집단을 구성하는 것이다 소뇌 과립 신경 전구 세포로 일으킨다성인 소뇌 9. 주동이의 이동에 따라, 그들은 소뇌 anlage에 정착. 여기에, 과립 신경 세포 전구체의 유사 분열은 설치류에서 출생 후에 일어나는 외부 세분화 층 (EGL)의 극적인 확장으로 이어집니다. EGL에서 뉴런은 조롱박 세포 층이 궁극적으로 내부 과립 층 (IGL 2)에 거주를 데리고 과거, 분자 층 (ML)를 통해 안쪽으로 마이그레이션을 시....
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프로토콜
CGNs 어느 생후 (P) 5 마우스 새끼 또는 P6 래트 새끼로부터 제조 할 수있다. 우리는 postmitotic CGNs (13)를 선택하는 유사 분열 억제제를 사용 Bilimoria 및 동료에 의해 기술 된 프로토콜을 따르십시오.
윤리 문 :
살아있는 동물을 포함한 모든 실험은 낮은 작센, 독일의 "Verbraucherschutz 싶게 Lebensmittelsicherheit"의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 수행되었다.
시험 관내 분석에서 :
1. 칼슘 인산염 형질 방법에 대한 DNA 플라스미드, 미디어 및 버퍼의 준비
- 무균, 내 독소가없는 물에 플라스미드 DNA를 녹이고 DMEM (높은 혈당), 2.5 M 염화칼슘을, 배 HBSS는 (4g의 NaCl, 0.1775 g의 KCl, 0.095 g 2 HPO 4 • 7H 2 O, 0.675 g의 포도당 나 용해합니다 2.5 g을 250 ㎖의 초순수의 HEPES 및 7.05, 7.08, 7.11)로 산도를 조정합니다. 참고 : 준비 할 때배 H....
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결과
상술 한 바와 같이 서로 다른 배양 조건에 따라 CGNs의 형태를 분석하기 위해, 우리는 DIV 0에 신경을 형질 전환. 형질 전환 후, 우리는 전체 매체 (BME, 10 %의 혈청, 2 mM의 PSG, 25 밀리미터의 KCl) 및 최소 배지 포함 인슐린에 또 다른 세트 (BME, 25 mM의 포도당, 2 ㎜ PSG, 10 ㎍ /로 뉴런의 한 세트를 배치 ML 인슐린). 우리는 DIV 1, 2에서 GFP의 항체를 이용한 면역 세포 화학에 신경을 실시, 3 만 세트 2 세트 1 축삭에 축삭과 수상 돌기를 측정 하였다. 성장 인자 및 모방 신경 활성 각각 축삭 및 수상 돌기를 제공하는 혈청의 KCl, 부하 때문에 개발되고 (도 4A) 표시 시간 창에 걸쳐 급속하게 증가 하였다. 2 개 세트 축삭의 성장은 주로 고유 자극의 결과이고, 따라서 훨씬 감소. 모 수석은 그러나 덴 드라이트 (dendrite) 성장 (그림 (b))를 자극의 부족 혈청 및 KCl을, 때문에 제대로 .......
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토론
장점 및 시험 관내 및 생체 내 방법에 기술의 한계 :
마우스와 쥐에서 배양 CGNs은 동일하게 형태 학적 분석을 위해 적합합니다. 쥐의 소뇌의 큰 크기 때문에, 쥐 새끼에서 CNGs의 수율은 마우스 새끼 3 배의 초과합니다. 이외에도 CGNs에서, 대뇌 피질 및 해마 뉴런뿐만 아니라 배양 시스템으로 사용될 수있다. 인산 칼슘 방법은 개별 뉴런의 형태를 분석하기 위해 요구되는 최저 (0.01 %) 형질 전환 효율을 초래한다. 다른 친 유성 형질 전환 방법도 사용하지만, 더 이득없이 지나치게 비싼 수 있습니다. 높은 효율이 매우 어려운 개별 프로세스를 구별하는 것 같은 CGNs 같은 고밀도 문화의 바이러스 성 형질 전환 방법은 피해야한다. CGNs, 우리는 일반적으로 체외에서 형질 전환 효율과 일의 상관 관계를 찾을 수 있습니다. 신경 세포가 배양 된 이상덜 영향을받는 그들은 형질 전환에 의한 스트레스로 될 것입니다. 결과적으로 형질 전환 효율이.......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 통계 분석과 도움, 우수한 기술 지원을 C. 망치와 S. Papiol를 N. Schwedhelm-Domeyer 감사합니다. 우리의 작업은 막스 플랑크 협회, 도이치 Forschungsgemeinschaft, 나노 현미경을위한 센터, 뇌의 분자 생리학 (CNMPB), 괴팅겐, 독일 괴팅겐 대학의 GGNB 주니어 그룹 장학금으로 후원된다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Gibco | 11960-044 | |
| BME | Gibco | 41010-026 | |
| 인슐린 | 시그마-알드리치 | Si-1-4011 | |
| 폴리-L-오르니틴 | 시그마-알드리치 | P-2533 | |
| CaCl2 | Appli-Chem | A3652 | |
| 이소플루란 | Actavis 독일 | ||
| Tissue-Tek OCT | Sakura | ||
| ECM 830 및 트위저트로드 | Harvard Apparatus | ||
| Epifluorescence 현미경 및 카메라 | Nikon | ||
| SP2 컨포칼 현미경 | Leica | ||
| ImageJ | NIH | ||
| Imaris 7.4.2 | Bitplane, Inc. | ||
| GraphPad 프리즘 | GraphPad 소프트웨어, Inc. | ||
| MS Excel | Microsoft | ||
| 로딩 팁 1-200 µ l | Costar | 4853 | |
| 피펫 팁 200 µ l | Sarstedt | 70.760.502 | |
| Microlance 3 바늘, 30 G | BD | 302200 | |
| 50 µ l 가스타이트 주사기 1705 | Hamilton | ||
| Glass coverslips | Thermo Scientific Menzel Glaeser | CB00120RA1 |
참고문헌
- Cajal, S. R. Histology of the nervous system of man and vertebrates. , Oxford University Press. (1995).
- Altman, J., Bayer, S. A. Development of the cerebellar system : in relation to its evolution, structure, and functions. , CRC Press. (1997).
- White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R.,....
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재인쇄 및 허가
