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방법 논문

포유류의 핵 수용체 잔류를 확인하기 위해 효모 두 하이브리드 시스템을 반전하는 리간드 및 / 또는 길항제와 상호 작용

12.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51085

⸱

2013년 11월 15일

 ,  ,  , 
1Department of Genetics, Albert Einstein College of Medicine , 2Shanghai Key Laboratory of Complex Prescription and MOE Key Laboratory for Standardization of Chinese Medicines, Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

케토코나졸은 프레그난 X 수용체(PXR) 활성화에 결합하고 길항합니다. PXR 돌연변이의 효모 고처리량 스크리닝은 케토코나졸 결합을 위한 고유한 영역을 정의합니다. 이 효모 기반 유전 방법은 표면 결합 부위와 관련된 리간드와 새로운 핵 수용체 상호 작용을 발견합니다.

초록

약물 대사 및 염증의 중요한 조절 제로, Pregnane X 수용체 (PXR)는, 대사 및 염증 (예, 간 지방증) 1,2 연결 질병 병태 생리에서 중요한 역할을한다. PXR에 대한 효능 리간드의 식별에 많은 진전이 있었다, 그러나, 마약과 같은 길항제 및 PXR 3,4,5 그들의 결합 부위의 제한에 대한 설명이 있습니다. 중요한 장벽을 효율적으로 PXR는 1998 년에 복제 및 특징되었다는 사실에도 불구하고 길항제와 구조 연구에 대한 전체 길이의 단백질을 정화하는 무능력이다. 우리 연구소는 PXR 6 잔류 물을 결합, 길항제, 케토코나졸의를 정의하는 기반으로 소설 높은 처리량 효모 두 하이브리드 분석을 개발했다. 우리의 방법은 케토코나졸과 상호 작용 할 것으로 예상 PXR의 AF-2면에 하나의 돌연변이의 효과를 구출 할 돌연변이 라이브러리를 만드는 작업이 포함됩니다. 구조 또는 "기능 획득"세코ND 돌연변이 PXR에 케토코나졸의 유전 적 상호 작용과 표면 잔기 (들)에 관한 결론이 실현 가능하도록 만들어 질 수있다. 따라서, 우리는 그것의 보조 활성화, SRC-1과 상호 작용 PXR 돌연변이의 높은 처리량을 두 하이브리드 효모 화면을 개발했다. 효모는 항진균제, 케토코나졸의 연구를 수용하기 위해 수정 된이 방식을 사용하여, 우리는 케토코나졸에 바인딩 할 수 없습니다 클론 풍부한 PXR의 특정 변이를 설명 할 수 있습니다. 반대 논리에 의해, 우리는 원래의 잔류 케토코나졸과의 직접적인 상호 작용 잔류 있다는 결론을 내린다. 이 분석은 소설, 핵 수용체 길항제 표면에 결합 부위에 대한 화면으로 다루기 쉬운 유전자 분석을 나타냅니다. 이 분석은 효모뿐만 아니라 표준 구조 생물학 또는 단백체 기반 방법을 사용하여 연구 할 수없는 세포 단백질 (들)에 관계없이 세포 독성 가능성의 약물에 적용 할 수 있습니다. 잠재적 인 함정은 데이터의 해석 (보완적인 방법으로 유용), 신뢰성을 포함단일 Y2H 방법, 효모 처리 또는 효모 두 하이브리드 분석을 수행하는 전문 지식 및 분석 최적화에 ANCE.

서론

효모 2-하이브리드(Y2H) 분석은 단백질-단백질 상호 작용을 발견하는 데 널리 사용되며 최근에는 단백질-단백질 상호 작용 복합체 7, 8, 9, 10, 11을 방해하는 새로운 소분자를 발견하는 데 널리 사용됩니다. 그러나, 약물 발견 또는 "히트"에 사용되는 이 분석법의 기존 접근법은 단백질-단백질 표면 내에서 화학 화합물의 알로스테릭 상호 작용 잔류물을 검출할 수 없으며, 이는 변경될 때 여전히 상호 작용하고 변경된 잔기(11)에 대한 조사를 허용합니다. 실제로, 이러한 방법을 개발할 수 있다면 단백질-단백질 상호 작용 중단에 중요한 알로스테릭 상호 작용 잔류물의 높은 처리량 평가를 위한 다루기 쉬운 효모 시스템을 가능하게 할 것입니다. 신약 개발의 맥락에서 화합물과 단백질의 상호 작용을 확립하는 가장 직접적인 방법은 구조적 결정(예: 단백질 억제제 복합체의 결정화)을 포함합니다. 이러한 방법은 번거롭고 정교한 리소스를 사용하며 모든 단백질에 대해 구조 연구를 수행하는 것은 기술적으로 실현 가능하지 않습니다.

다루기 쉬운 유전 약물 스크리닝 시스템은 박테리아1, 2 및 포유류의 2 하이브리드와 같은 다른 모델 시스템에서 확립되었습니다. 그러나 이러한 시스템은 최적화가 필요하며 Y2H와 같은 대체 시스템은 여전히 신약 개발에서 가장 많이 테스트되었습니다. 단수 방법(13)을 사용하는 상호작용의 낮은 민감도 및 신뢰성을 포함하는 제한 사항이 있지만, 단일 Y2H 분석은 상호 작용 잔류물에 관한 특정 질문에 답하기 위해 수정될 수 있습니다. 핵 수용체 연구 분야에서, Y2H는 상호 작용하는 단백질을 정의하는 데 사용되었지만(14), 이러한 단백질 상호 작용은 리간드/길항제가 핵 수용체-단백질 복합체와 상호 작용하는 특성을 정의하는 데 거의 사용되지 않았습니다. 따라서 우리 실험실은 특히 단백질체학 기반 방법에 쉽게 순응할 수 없는 수용체 단백질에 대한 방법을 정의하는 데 노력을 집중했으며, 이는 역 Y2H 기반 발견 플랫폼을 사용하여 새로운 리간드/길항제 상호 작용 잔기를 발굴할 것입니다.

케토코나졸이 PXR과 그 활성제 SRC-1을 파괴한다는 이전 발견을 바탕으로 PXR6에서 케토코나졸 상호 작용 잔기를 정의하고 조사할 수 있는 새로운 역 Y2H 시스템을 개발했습니다. 우리의 방법은 DNA 결합 및 전사 활성화를 담당하는 분리 가능한 도메인으로 구성된 효모 GAL4 단백질의 특성을 기반으로 합니다. PXR LBD 단백질은 LexA DNA 결합 도메인(DNA-BD)에 대한 융합으로 발현되는 반면, 전장 공동 활성화제 SRC-1(스테로이드 수용체 공동 활성제 1) 단백질은 GAL4 활성화 도메인(AD)에 대한 융합으로 발현됩니다. PXR과 SRC-1 융합 단백질 간의 상호 작용은 효모 게놈에 통합된 리포터 유전자 β-LacZ를 포함하는 GAL4 결합 부위의 전사 활성화로 이어집니다. PXR 길항제인 케토코나졸은 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하며, 15, 16, 17 X-gal 활성을 위해 필터에 콜로니를 염색한 후 케토코나졸의 유무에 따라 PXR과 SRC-1의 상호작용을 감지할 수 있습니다. Y2H의 원리는 그림 1에 나와 있으며 실험 절차는 그림 2에 요약되어 있습니다.

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프로토콜

1. 효모 벡터에서 PXR 및 SRC-1 융합의 구성

  1. Human PXR LBD(107-434 아미노산) 및 Human SRC-1 full length(1-1401 아미노산)의 PCR 증폭.
    1. pSG5-hPXR 플라스미드8을 PXR LBD 템플릿으로 사용하고, pCMX-SRC1 플라스미드를 SRC-1 템플릿으로 사용합니다.
    2. PCR SuperMix, DNA 템플릿 및 프라이머(재료 참조)를 얼음에 보관하여 해동합니다.
    3. 0.25 μg/μl DNA 템플렛 1 μl, 10 mM 프라이머 쌍 각각 2 μl, PCR SuperMix 45 μl를 추가하고 H2O를 추가하여 총 부피를 50 μl로 만듭니다.
    4. PCR을 94°C에서 2분 동안 1사이클, 94°C에서 30초 동안 20사이클, 55°C에서 30초, 72°C에서 2분 동안 설정한 다음 72°C에서 1사이클로 10분 연장을 설정합니다. 1% 아가로스 겔로 PCR 산물을 확인합니다.
  2. Y2H 벡터로 복제하는 PCR 산물.
    1. 1% 아가로스 겔에서 PCR 산물을 정제합니다. BamHI 및 SalI를 사용하여 PXR, LBD, PCR 및 Y2H 벡터 pSH2-1을 분해합니다. NotΙ 및 SalΙ를 사용하여 SRC-1 PCR 및 Y2H 벡터 pGADNOT을 분해합니다. 이를 위해 DNA 1μg, 10x 반응 완충액 3μl, 제한 효소 1μl, 마지막으로 H2O를 추가하여 총 부피를 30μl로 만듭니다.
    2. 분해 샘플을 37°C 수조에 1시간 동안 넣고 1% 아가로스 젤로 실행하여 분해를 확인합니다.
    3. 1% 아가로스 겔에서 분해 샘플을 정제하고, 분해된 PCR 산물 및 Y2H 벡터를 접합하고, DH5α 수용 세포로 변형합니다.
    4. 콜로니를 선택하고 플라스미드 DNA를 분리합니다.
  3. BamHI/SalI 분해로 pSH2-1-PXR 플라스미드 DNA를 식별하고, NotI/SalI 분해로 pGADNOT-SRC-1 플라스미드 DNA를 식별합니다. 염기서열분석을 통해 모든 양성 플라스미드 DNA를 확인합니다.

2. 효모 2 하이브리드 분석

  1. 효모 균주를 5ml YPAD에 접종하고 지속적인 교반(30°C에서 220rpm)으로 밤새 배양합니다. 참고: Saccharomyces cerevisiae 균주는 CTY10-5d(MATa ade2 trp1-901 leu2-3,112 his3-200 ga l4-gal80- URA3::lexA-lacZ)였으며, 이는 lexA 연산자10과 통합된 GAL1-lacZ 유전자를 포함합니다. 케토코나졸에 내성이 있는 생존 가능한 효모 세포를 얻기 위해18-20 아졸 내성의 원인으로 수송체 변형을 일으키지 않는 세포를 얻기 위해 먼저 ERG3 ( erg3Δ )를 삭제한 다음 상동 재조합에 의해 ERG11 ( erg3Δ/erg11Δ) 유전자에 추가 결실을 도입하여 CTY10-5d 효모의 새로운 균주를 얻었습니다. 시공 세부 사항은 이전에 출판된 원고6 에 설명되어 있습니다.
  2. 다음날(아침) 5ml YAPD에 효모(1:20)를 접종하고 배양하여 일정한 교반(30°C에서 220rpm)으로 OD600 ~0.2를 얻습니다.
  3. 마이크로 원심분리기에서 2,000rpm으로 세포를 2분 동안 펠렛화하고 상등액을 버립니다. 그런 다음 펠릿을 오토클레이브 물로 두 번 세척하고 0.1M LiAc로 한 번 세척합니다.
  4. 최종 세척 후, 상등액을 버리고 세포 펠렛에 다음 시약을 첨가하십시오 : 240 μl PEG 3500 50 % w / v, 36 μl 1 M LiAc, 50 μl 2 mg / ml 삶은 연어 정액 ssDNA, H2O 34 μl. 와류를 혼합하려면 1 μg pSH-PXR 및 1 μg pGADNOT-SRC-1 DNA를 첨가하고 혼합하십시오.
  5. 혼합물을 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브로 옮기고, 변형을 교반하고, 30분 동안 혼합(30°C에서 220rpm)합니다. 튜브를 42°C 수조로 옮기고 추가로 30분 동안 배양합니다.
  6. 튜브를 2,000rpm에서 2분 동안 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 고압증기멸균된 물로 펠릿을 한 번 씻으십시오.
  7. 100 μl의 멸균수를 튜브에 피펫팅하고, 부드러운 손가락 두드리기와 피펫팅으로 세포를 다시 현탁시킨 다음, -His/-Leu Dropout Medium(1리터 -His/-Leu Dropout Medium당 제형: 20 g 포도당, 1.7 g YNB, 0.67 g CSM-His/-Leu, 5 g 황산암모늄, 1.5% 한천) 플레이트에 플레이트를 삽입하고 3-4일 동안 30°C에서 배양하여 형질전환체를 분리합니다.

3. X-gal 필터 어세이

  1. 니트로셀룰로오스 멤브레인을 페트리 접시 부분 크기로 자릅니다. 방향을 표시하기 위해 니트로셀룰로오스 멤브레인에 레이블을 붙입니다.
  2. 효모 군집에 미리 표시된 니트로셀룰로오스 멤브레인을 놓고 멤브레인이 플레이트 매체의 표면과 접촉하는지 확인합니다.
  3. 멤브레인을 제거하고 3mm 여과지 위에 콜로니 면이 위로 향하게 놓고 멤브레인과 여과지를 -80°C에서 15분 동안 놓습니다.
  4. X-gal 솔루션을 만드십시오. 50 μl 20 mg/ml X-gal 및 15 μl β-메르캅토에탄올을 5 ml의 Z-버퍼에 추가합니다(1 L 버퍼는 16.1 g Na2HPO47H2O, 5.5 g NaH2PO4 H2O, 0.75 g KCl , 0.25 g MgSO4•7H2O 포함). Z Buffer를 4°C로 유지한 경우 이 시약을 추가하기 전에 실온에 두십시오.
  5. 페트리 접시에 3mm 여과지 두 원을 놓고 5ml X-gal 용액을 담근다. 페트리 접시에서 여분의 완충액을 배출하고 콜로니 면이 위로 향하도록 니트로셀룰로오스 멤브레인을 놓습니다.
  6. 뚜껑을 닫고 멤브레인이 여과지와 완전히 접촉하고 완전히 젖었는지 확인하십시오. 페트리 접시를 호일로 싸서 37°C에서 30분에서 하룻밤 동안 배양합니다.

4. 액체 β-gal 분석

  1. -His/-Leu Dropout 액체 매체에서 효모를 OD600 0.7로 성장시킵니다.
  2. 배지 1ml를 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브에 넣고 3,000rpm에서 2분 동안 원심분리기를 사용합니다. 상층액을 버립니다.
  3. Z 버퍼 1ml를 추가하여 펠릿을 재현탁시키고 3,000rpm에서 다시 2분 동안 원심분리합니다. 상등액을 버립니다.
  4. 150μl의 Z Buffer와 2ME를 추가하여 세포 펠릿을 재현탁시키고 50μl 클로로포름과 20μl 0.1% SDS를 혼합한 다음 추가합니다. 15초 동안 샘플을 격렬하게 소용돌이칩니다.
  5. 700μl의 ONPG 용액(Z 버퍼에 1mg/ml)을 추가합니다. 타이머를 설정하고 노란색이 발달할 수 있도록 충분히 오래 30°C에서 배양하고 총 반응 시간을 기록합니다.
  6. 500 μl의 1 M Na2CO3 를 첨가하여 반응을 중지하고 420 nm에서 흡광도를 측정합니다. 블랭크는 700 μl ONPG 용액과 500 μl 1 M Na2CO3 입니다.

밀러 단위 계산: 밀러 단위 = (Å420*1,000)/(Å600*min*ml)

Å420 : 420 나노 미터의 흡광도 단위; Å600 : 600 나노 미터의 흡광도 단위; min: 반응 시간(분)입니다. ml: 반응 부피(ml)

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결과

PXR과 스테로이드 수용체 공동활성제-1(SRC-1)의 결합을 비색법으로 검출할 수 있는지 확인하기 위해 분석을 수행하였습니다. 효모는 스테롤 생산량이 상당하므로, 추가적인 외인성 리간드 없이도 효모 내 lacZ 발현이 유도될 수 있음이 이전에 밝혀진 바 있습니다. 분석 결과, PXR과 SRC-1이 형질전환된 효모 균주에서 lacZ 발현(청색 콜로니)이 유도되었으나, 공벡터(empty vector)만 또는 PXR이나 SRC-1만 개별적으로 형질전환된 효모에서는 LacZ 발현(백색 콜로니)이 유도되지 않았음을 확인하였습니다(Figure 3). 케토코나졸(25 μM)이 효모 내 PXR과 SRC-1의 상호작용을 방해하는지 판단하기 위해, 케토코나졸이 포함된 복제 플레이트를 니트로셀룰로오스와 X-gal 필터로 적신 후, 리프트(lift) 및 β-갈락토시다아제 액상 분석을 수행하였습니다. 복제 필터의 모든 콜로니가 백색으로 변한 것(이는 액상 효소 분석에서 β-갈락토시다아제 활성이 현저히 감소한 것으로도 확...

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토론

수정된 Y2H 분석에서 PXR6에서 케토코나졸 상호작용에 대한 중요한 잔기를 확인했습니다. SRC-1은 공동활동제이기 때문에(그리고 pGADNot 벡터에 복제되었음), 우리는 또한 SRC-1이 pSH 벡터 시스템에 복제될 때 lacZ 발현을 활성화할 수 있는지 여부와 이것이 활성화 프로파일을 변경하거나 효모 2-하이브리드 분석의 누출에 영향을 미치는지 여부를 테스트했습니다. 재설계된 플라스미드를 사용하여 erg3Δ/erg11Δ 효모에서 2가지 하이브리드 분석을 수행했습니다. 이전과 마찬가지로, 우리는 lacZ 발현(파란색 콜로니)이 PXR 및 SRC-1로 형질전환된 erg3Δ/erg11Δ 효모 균주에서도 유도된다는 것을 보여줍니다. 그러나 빈 벡터, PXR 또는 SRC-1로 개별적으로 형질전환된 효모에서 LacZ 발현(백색 콜로니)의 유도는 없습니다(데이터는 표시되지 않음). 우리의 접근법은 기존의 구조 생물학 및/또는 단백질체 접근법에 순응할 ...

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립보건원(NIH) 보조금 CA127231 및 Damon Runyon Foundation Clinical Investigator Award(CI 1502)(S.M)의 지원을 받았습니다. 체코 공화국 Palacky University Olomouc의 Zdenek Dvorak 교수에게 이 기술을 기관에 이식하고 프로토콜의 표준화를 논의하는 데 도움이 되는 통찰력을 제공해 주신 것에 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
효모 균주 CTY10-5d erg3Δ/erg11Δ우리 연구실CTY10-5d 효모는 ERG3 및 ERG11 (erg3Δ/erg11Δ) 유전자6 .
YPD 성장 매체BD Biosciences630409
Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) w/o 아미노산 및 황산암모늄BD Biosciences233520
Bacto AgarBD Biosciences214010
CSM-His/-Leu Complete Supplement MixtureMP Biomedicals4250-412
ONPG (o-니트로페닐 &베타;-D-갈락토피라노시드).Sigma-AldrichN1127
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250
Luria Broth (LB)Sigma-AldrichL3022
X-GalFisherBP-1615
초음파 연어 정자 DNA 삶은 (10 mg/ml)Life Technology156-017
암피실린아크로스 유기물61177
케토코나졸시그마-알드리치K1003
N,N-디메틸포름아미드아크로스 유기물326871000
리튬 아세테이시그마-알드리치L4158
50% PEG-3350 용액, 필터 멸균시그마-알드리치P-3640
니트로셀룰로오스 멤브레인Whatman10402091
10cm 페트리 접시Fisher875712
5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'우리 연구소PXR LBD 포워드 프라이머 pSH2-1
5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'우리 연구소PXR LBD 리버스 프라이머 for pSH2-1
5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGGGACAGTTCATCC -3'우리 연구소SRC-1 포워드 프라이머 pGADNOT
5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'우리 실험실SRC-1 리버스 프라이머 pGADNOT
플래티넘 PCR 슈퍼믹스Invitrogen11306-016
BamHI우리 실험실R0136
SalI우리 실험실R0138
NotI우리 실험실R0189
트

참고문헌

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