Beispiel Drift Korrektur Nach 4D Konfokale Zeitraffer-Imaging
Summary
Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht die Visualisierung von Entwicklungsprozessen. Wachstum oder Drift der Proben während der Bildaufnahme reduziert die Fähigkeit, genau zu verfolgen und zu messen Zellbewegungen während der Entwicklung. Wir beschreiben die Verwendung von Open-Source-Bildbearbeitungssoftware für dreidimensionale Probe Drift über die Zeit zu korrigieren.
Abstract
Die Erzeugung des vierdimensionalen (4D) konfokale Datensätze; bestehend aus 3D-Bildsequenzen über die Zeit; bietet eine hervorragende Methode, um Zellverhalten in Entwicklungsprozessen beteiligt zu erfassen. Die Fähigkeit zu verfolgen und folgen Zellbewegungen wird durch Probenbewegungen, die durch die Probe während der Bildaufnahme treiben oder, in einigen Fällen das Wachstum auftreten beschränkt. Tracking-Zellen in Datensätzen durch Drift und / oder Wachstums betroffen, diese Bewegungen in jede Analyse von Zell-Position zu übernehmen. Dieser kann aus der scheinbaren Bewegung des statischen Strukturen innerhalb der Probe führen. Daher vor der Zellverfolgung sollte jede Probe Drift korrigiert werden. Mit dem Open-Source-Distribution Fidschi 1 von ImageJ 2,3 und die einge LOCI Werkzeuge 4 des richtigen 3D-Drift-Plug-in, entwickelten wir zu fehlerhaften Probenbewegung in der konfokalen Datensätze zu entfernen. Dieses Protokoll effektiv kompensiert Probeübersetzung oder Änderungen in der Brenn position durch die Verwendung Phasenkorrelation zu jedem Zeitpunkt von einer vier-dimensionalen Datensätzen konfokalen registrieren und gleichzeitig die Fähigkeit, über längere Zeitraffer-Experimente visualisieren und messen Zellbewegungen.
Introduction
Die konfokale Bildgebung ist weit verbreitet in Zell-und Entwicklungsbiologie, Zell Bewegungen und Veränderungen in der Morphologie zu folgen. Erfassen einer Reihe von optischen Schnitten in verschiedenen Brennebenen ermöglicht die Erzeugung einer dreidimensionalen (3D) Modells der Probe, die dann durch die Schaffung eines Zeitserien von 3D-Datensätzen in vier Dimensionen (4D) verlängert werden können. Die Generation von 4D-Datensätzen ermöglicht die detaillierte Messung von Zellbewegungen und Verhaltensweisen. In Langzeit-Zeitraffer-Experimente ist es üblich, Probenbewegung zu beobachten. Dies kann durch kleine Ungenauigkeiten in der Hardware-Steuerung Bühne und Fokuspositionen verursacht werden. Während in anderen Fällen ist ein Ergebnis der Driftbewegungen Probe Wachstum oder Flexibilität in der Probenmontage Medien induziert. Methoden existieren, um auszugleichen oder zu begrenzen, diese Bewegungen einschließlich der Verbesserung Hardware Fokussiersysteme und erhöhte Steifigkeit der Montage Medium. Jedoch sind diese Ansätze können in vielen Fällen aufgrund der Abbildungs s angewendet werdenet up erforderlich, geeignete Bedingungen für die Proben Wartung und Wachstum. Open-Source-Software-Lösungen nicht für die Korrektur der Bewegung in 2D über die Zeit vorhanden ist, durch den Einsatz der STACKREG und TURBOREG (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) 5 Plugins in ImageJ oder Fidschi, aber diese kann nicht 4D Datensätze angewendet werden.
Um für die Probe Drift zu korrigieren haben wir eine Plug-in (Richtiges 3D-Drift), um die Open-Source-Bildverarbeitungsplattform, Fidschi 1 nutzen entwickelt. Unser Plug-in ist in der Lage, Phasenkorrelation Registrierung durchzuführen, um eine Bewegung, die als Ergebnis der Probendrift im dreidimensionalen Zeitraffer-Experimente erfolgt korrigieren. Phase 6 ist eine Korrelation Rechen effiziente Methode zur Übersetzung zwischen den Bildern zu bestimmen. Die hier beschriebene Plug-in nutzt die Phasenkorrelation Bibliothek von Preibisch et al. 7 entwickelt. Der Mehrkanal-Experimenten die Steck nutzt einen Kanal zur Bestimmungne die erforderliche Korrektur. Diese Korrektur wird dann auf zusätzliche Kanäle, was zu der Eintragung der 4D-Datensatz angelegt.
Im Zebrafisch-Modell-System ist es möglich, Zeitraffer-Bildgebung über einen Zeitraum von vielen Stunden oder sogar mehrere Tage 8. Eine gängige Methode für die Montage des Zebrafisch ist es, die betäubt Live-Embryo in niedrig schmelzender Agarose (0,8-1,5%) einbetten, die Beschränkung ihrer Bewegung 11.09. Während Bewegung eingeschränkt ist noch Wachstum der Probe auftritt, was in den Zellen innerhalb des Sichtfeldes Schaltposition. Um die Bewegung der Zellen innerhalb des Embryos zu folgen ist es notwendig, zuerst für die Bewegung der gesamten Probe zu korrigieren. Dieses Protokoll wurde mit Zebrafisch-Proben entwickelt und hat zu Bild 12 Somitenentwicklung verwendet worden kann aber zu jedem 4D konfokalen Datenmenge angewendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Unsere Fähigkeit, Post-Processing-Software verwenden, um Probendrift von Datensätzen aus erweiterten Zeitraffer-Mikroskopie Experimente abgeleitet korrigieren wird durch eine Reihe von Faktoren eingeschränkt. Die Fähigkeit, gegenüber Drift Wanderungs einer Probe zu erkennen ist abhängig von den zellulären Marker verwendet. Cellular Marker, die entweder weit innerhalb einer Probe ausgedrückt sind oder während der Bildaufnahme nicht in Migrations Veranstaltungen beteiligt bieten die beste Quelle für Driftkorrekt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Gaby Martins und die Organisatoren der EMBO2010 3D Imaging Entwicklungs Werkstatt, in der diese Arbeit begann und alle von den Beitragszahlern der Fidschi und ImageJ Projekte danken.
Materials
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (Tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 |
| Low gelling temperature agarose | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Dumont #4 Forceps | Electron Microscopy Sciences | 0208-4-PO |
| Disposable 3mL graduated | Samco | 212 |
| Polyethylene transfer pipette | ||
| 9cm bacterial grade Petri dishes | Greiner Bio One | 632180 |
| Fluorinated ethylene propylene (FEP) tubing | Bola | S1815-04 |
| Zeiss LSM-710 Confocal microscope | Zeiss | |
| W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC Objective | Zeiss | 421452-9600-000 |
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