4D 共聚焦延时成像后的样本漂移校正

摘要

延时显微镜可实现对发育过程的可视化观察。在图像采集过程中，样品的生长或漂移会降低准确追踪和测量发育期间细胞运动的能力。本文介绍了利用开源图像处理软件对样品随时间发生的三维漂移进行校正的方法。

摘要

生成四维（4D）共聚焦数据集（即随时间变化的三维图像序列）是一种用于捕捉发育过程中细胞行为的优秀方法学。  对细胞运动进行追踪的能力受限于样本在成像过程中因漂移或某些情况下的生长所引起的移动。在受漂移和/或生长影响的数据集中追踪细胞，会将这些样本运动引入对细胞位置的任何分析中，可能导致样本中静态结构出现虚假移动的假象。因此，在进行细胞追踪之前，应先校正样本漂移。利用开源的 Fiji 版本 ¹  ImageJ ^2,3 及其集成的 LOCI 工具 ⁴，我们开发了 Correct 3D drift 插件，用于消除共聚焦数据集中的错误样本移动。该方案通过相位相关法对四维共聚焦数据集的每个时间点进行配准，有效补偿样本的平移或焦平面位置的变化，同时保持在长时间延时实验中可视化和测量细胞运动的能力。

引言

共聚焦成像技术广泛应用于细胞生物学和发育生物学中，用于追踪细胞运动及形态变化。通过在不同焦平面上获取一系列光学切片，可构建样本的三维（3D）模型，并进一步通过生成一系列时间推移的3D数据集，扩展为四维（4D）图像。4D数据集的建立使得对细胞运动和行为的详细测量成为可能。在长期的时间推移实验中，常可观察到样本发生位移。这种位移可能由控制载物台和焦平面位置的硬件存在微小误差所致；而在其他情况下，则可能是由于样本生长或封片介质本身的柔韧性所引起的移动。目前已有一些方法可用于补偿或限制此类位移，例如改进硬件聚焦系统或提高封片介质的刚性。然而，在许多情况下，这些方法无法应用，因为成像系统需满足维持样本生存和生长所需的特定条件。已有开源软件可通过ImageJ或Fiji中的StackReg和TurboReg（http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/）⁵插件实现对时间序列中二维图像的运动校正，但这些方法无法应用于4D数据集。

为了校正样本漂移，我们开发了一个插件（Correct 3D drift），用于开源图像处理平台Fiji¹。该插件能够执行相位相关配准，以校正三维延时实验中因样本漂移引起的运动。相位相关⁶是一种计算效率较高的方法，用于确定图像之间的平移关系。本文所述插件采用了Preibisch et al. ⁷开发的相位相关算法库。在多通道实验中，该插件利用一个通道来确定所需的校正参数，然后将该参数应用于其他所有通道，从而实现对四维数据集的配准。 

在斑马鱼模型系统中，可以进行持续数小时甚至数天的延时成像⁸。一种常用的斑马鱼样品固定方法是将麻醉后的活体胚胎包埋于低熔点琼脂糖（0.8–1.5%）中，以限制其运动^9–11。尽管运动受到限制，样品仍会继续生长，导致视野中的细胞发生位置偏移。为了追踪胚胎内细胞的运动，必须首先校正整个样品的整体位移。本方案最初针对斑马鱼样本开发，已用于体节发育的成像研究¹²，但也可应用于任何4D共聚焦成像数据集。

方案

1. 4D 时间序列成像实验

图像采集所使用的设置将根据所用设备的不同而有所差异。共聚焦显微镜对样品进行光学切片的能力取决于多个因素：激发光波长、针孔大小、物镜的数值孔径、样品本身的折射率以及样品所处介质的折射率。所选择的共聚焦针孔大小将决定所采集光学切片的厚度。较小的针孔可产生更薄的光学切片，从而提高z轴分辨率，但会减少捕获的光量；较大的针孔则会增加光学切片的厚度，降低z轴分辨率，但可增加捕获的光量。

在进行校正之前采集 4D 数据时，还需考虑以下因素：

1. 优化扫描速度，以消除或限制在单个时间点采集过程中的漂移。因此，图像采集所需时间应仅为时间点之间间隔的一小部分。
2. 完全重复的结构或网格不适合作为配准的参考结构，因为无法确定所需的校正量。随机分布的微珠或不规则结构可实现明确无误的配准。
3. 若预期存在漂移，应扩大扫描区域以及上下焦距范围，以确保感兴趣区域始终保留在图像序列中。
4. 除确保具备适当的空间分辨率以分辨目标结构外，还应设置采样率，以提供对所研究动态事件的时间分辨率。
   注意：因此，图像时间点之间的时间间隔至少应为周期性重复事件时间间隔的一半，对于非周期性事件则应进一步缩短。

2. 打开共聚焦图像数据集

开源软件 Fiji 是 ImageJ 程序的一个发行版本，其中包含预安装的插件，可用于对显微镜实验采集的数据执行多种处理操作。该软件提供了更便捷的插件更新架构，并内置了本实验方案所使用的 Correct 3D drift 插件。通过使用开放显微镜环境（Open Microscopy Environment）的 Bio-Formats 导入插件，该软件支持导入多种专有的显微镜图像格式。

1. 安装 Fiji 程序（http://fiji.sc/Downloads）。
2. 使用 LOCI Bio-Formats 导入插件加载获取的数据集。
3. 如果数据集大于程序分配的内存，请在内存管理部分中选择 "使用虚拟堆栈选项"。

3. 在后期处理中校正三维物体的漂移

在长时间延时实验过程中，即使样品已被包埋，仍可能发生位移。为了校正任何移动，并使得所成像的迁移事件能够被分析，可对图像进行后期处理。所有图像后期处理步骤必须在基于本工作所开展的分析方法部分中予以明确描述。

1. 数据集加载完成后，运行“校正3D漂移”插件。
2. 如果存在多个图像通道，请选择用于图像配准的通道。理想情况下，该通道应代表样本中静态的结构，而非迁移性或可移动的成分。然而，若无法实现，则应选择移动最少的通道。
3. 如果用于分析的系统可用内存小于原始数据集大小的两倍，请勾选“使用虚拟堆栈”选项。这将使配准后的超堆栈以图像序列形式输出，而非保存在内存中。
   1. 选择插件输出单个校正后图像文件的文件夹。每个通道在每个z位置都将生成一个独立的图像文件。
4. 插件随后将对每个时间点进行两两相位相关分析，以确定所需的校正参数，并将其应用于整个数据集。

结果

在发育中的斑马鱼中，快肌细胞从受精后19小时（20体节期）开始融合形成多核肌纤维¹³。为了观察细胞核的移动及肌细胞的融合过程，我们利用一种转基因品系进行4D共聚焦延时成像，该品系在骨骼肌α-肌动蛋白启动子的驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP），以标记所有肌细胞¹⁴，同时注射编码红色荧光蛋白mCherry并携带核定位序列的RNA，以标记细胞核。将注射后的转基因胚胎包埋于低熔点琼脂糖中，每隔20分钟采集一次图像，每次获取71个光学切片，切片间隔为2.0 µm，持续成像2小时。在延时实验过程中观察到约7 µm的样本漂移，导致重叠图像模糊（图1A），并使细胞核在时间序列中呈现明显的位移（图1B）。应用该插件后可得到校正后的图像序列（图1C和图1D）。

讨论

我们利用后期处理软件校正长时间延时显微镜实验所获得数据集的样本漂移的能力，受到多种因素的限制。区分漂移与样本迁移运动的能力取决于所使用的细胞标记物。在样本中广泛表达、或在图像采集过程中不参与迁移事件的细胞标记物，是进行漂移校正的最佳依据。该插件使用单一通道来比对不同时间点之间的运动，并将此比对结果应用到所采集图像的所有其他通道中。因此，在感兴趣样本中使用两种荧光标记物可能更具优势：一种用于标记需要追踪的细胞或结构，另一种用于标记在实验过程中预期不会发生迁移（仅随整体漂移）的结构。虽然该配准方法也可应用于单通道数据集，但在这种情况下，图像中的大部分信号应为静止的，仅有小部分信号预期会发生移动。如果在不同时间点之间图像中有较大比例的区域发生移动，则这些移动将与漂移一同被校正，从而导致所测得的运动量被低估。

本方案假设在每个单独时间点的首尾光学切片之间不存在任何移动。若单个时间点内发生漂移，则无法在不假设被扫描物体形状的前提下进行校正。理想情况下，用于图像采集的实验参数应尽可能限制每个时间点内发生的移动。因此，采集图像序列所需的时间应尽可能短。单个时间点采集的总时长应远小于相邻时间点之间...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
甲磺酸三卡因（Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate, Tricaine）	Sigma-Aldrich	A5040
低凝胶温度琼脂糖	Sigma-Aldrich	A9414-25G
Dumont #4 镊子	Electron Microscopy Sciences	0208-4-PO
一次性 3 ml 刻度移液管	Samco	212
聚乙烯转移移液管
9 cm 细菌级培养皿	Greiner Bio One	632180
氟化乙烯丙烯（Fluorinated ethylene propylene, FEP）管	Bola	S1815-04
蔡司 LSM-710 共聚焦显微镜	Zeiss
W Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC 物镜	Zeiss	421452-9600-000