방법 논문

형광에 의한 신경 조직의 영구 DNA 바이러스의 게놈 및 성적 증명서의 검출 현장에서 하이브리드 면역 염색과 결합

DOI:

10.3791/51091

⸱

2014년 1월 23일

 ,  ,  , 
1Virus and Centromere Team, Centre de Génétique et Physiologie Moléculaire et Cellulaire, CNRS UMR 5534, 2Université de Lyon 1, 3Laboratoire d'excellence, LabEX DEVweCAN, 4Institut de Virologie Moléculaire et Structurale, CNRS UPR 3296, 5Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon, INSERM U1052, CNRS UMR 5286

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 동물 모델의 조직 섹션 내의 영속 DNA 바이러스 게놈의 검출을 위해 현장 하이브리드 프로토콜에 형광등을 설치했다. 이 프로토콜은 바이러스 게놈의 codetection, 자사의 RNA 제품, 단일 세포 내에서 바이러스 또는 세포 단백질에 의해 감염 과정을 연구 할 수 있습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

유전자의 단일 세포 codetection, 그 RNA 제품 및 세포 조절 단백질의 유전자 발현 조절을 연구하는 것이 중요합니다. 이 바이러스학 분야의 도전, 특히 핵 복제 지속적인 DNA 바이러스에 대한 자신의 연구를위한 동물 모델을 포함하는. 단순 헤르페스 바이러스 1 형 (HSV-1) 말초 신경에있는 평생 잠복 감염을 확립한다. 잠재 바이러스가 재 활성화하고 새로운 포진 에피소드를 유도있는 저수지 역할을합니다. HSV-1 대기 세포 생물학 의한 동물 모델에서 반응계에서 HSV-1 게놈을 검출하는 방법의 부족 부분에서 제대로 이해 남아있다. 우리는 접근 방식이 효율적으로 감염된 동물 모델에서 신경 조직의 섹션 내에서 낮은 복사 바이러스 게놈을 검출하는 현장 하이브리드 화 (물고기)의 DNA 형광을 설명합니다. 이 방법은 열 기반의 항원 마스크 해제에 의존 직접 표시 집에서 만든 DNA 프로브, 또는 상업적으로 이용 가능한 프로브. 우리는 트리플 스테인레스로 개발닝 방법, 각 염색의 요구 사항을 수용하기 위해 과산화 효소 기반의 신호 증폭을 사용하여, RNA-FISH 및 면역과 DNA-FISH를 결합. 주요 개선은 공 초점 현미경과 넓은 필드 종래의 표면 형광에 의해 고해상도로 영상화 할 수있는 10 μm의 조직 섹션, 낮은 배경 신호 내에서 획득 할 수있는 기능입니다. 또한, 트리플 염색은 세포 및 바이러스 단백질에 대한 항체의 다양한했다. 전체 프로토콜은 조직 내에서 항체 프로브의 침투를 수용하기 위해 2.5 일이 소요된다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

단순 포진 바이러스 타입 1 (HSV-1)은 복제하고 확산하기 위해 주기적으로 재 활성화되는 말초 신경계의 삼차 신경절 (TG)의 뉴런에서 장기 잠재 감염을 수립, 지속적인 인간의 신경성 바이러스입니다. HSV-1 유전자는 숙주 세포의 게놈 1,2에 통합하지 않는 다중 사본 chromatinized 플라스미드를 유지 호스트 신경 세포의 핵에있는 1백50킬로바이트 dsDNA의 지역화입니다. 대기 시간 동안, HSV-1 증식하는주기 유전 프로그램은 강력하게 억제하고, 유전자 발현이 지연 설립에서 재 활성화 3 개시의 지연에 관련된 성적 증명서 (LAT) 현장에 제한됩니다. LAT는 주요 2킬로바이트 안정 올가미로 처리 긴 8.5 KB 비 암호화 RNA, 그리고 몇 가지의 miRNA 4-7을 생산하고 있습니다. HSV-1 지연 따라서 바이러스 게놈 DNA, LAT의 RNA, 및 검출 증식하는주기 단백질의 부재의 존재에 의해 특징입니다.

"ontent> 동물 모델을 주로 쥐와 토끼, 인간의 대기 시간의 몇 가지 기능을 recapitulating 실험 모델입니다. 그 모델의 주요 관심사 중 하나는 그들이 면역 호스트에서 HSV-1 대기의 생리 학적 측면을 연구 할 수 있다는 것입니다. 지난 수십 년 동안 이러한 유전자 변형....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 방법은 이전에 22 일 발표 된 연구에 사용되었다. ISH, IF 및 FISH에 대한 일반적인 배경과 기존의 조작의 설명을 위해, 우리는 다음과 같은 사용 가능한 문학 (23)를 제안한다.

1. 동물 감염

실험 동물과 관련된 모든 절차는 비전있는 연구를위한 협회와 안과 연구에서 동물의 사용 (ARVO) 문에서 윤리적 인 문제에 준거하고, 유럽 공동체에 따라 UPR-3296-CNRS의 지역 윤리위원회에 의해 승인되었습니다 위원회 지침 86/609/EEC. 모든 동물은 음식과 물에 대한 무제한 액세스를 받았다.

HSV-1 아래 설명과 마우스 감염의 방법은 이전에 24 일부터 26 일 발표 된 연구에 이용되고있다.

  1. 시작하기 전에 준비하기 위해 다음과 같은 솔루션을 준비 :

    HSV-1 바이러스 원액
    솔루션을 마취 - Ketamine-100 ㎎ / kg 자일 라진 및 10 ㎎ / kg
  2. 0.1 μL / 초를 제공 또는 마이크로 펌프 장치에 연결 5 μL 유리 또는 마이크로로 바이러스의 1 μL (10 <....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

광범위한 테스트의 몇 개월 후, 우리는 열 기반의 화학 마스크 해제는 현장 하이브리드 화에 형광에 대한 잠재 HSV-1 게놈 사용할 것을 발견했다. 프로세스 동안, 우리는 다양한 마스크 제거 절차를 시도하고, 단지 열 기반 치료법 (즉, 전자 레인지에 서브 비등점까지 가열 부) 효율적인 나타났다. 우리는 일상적으로 0.01 M의 pH를 6.0 구연산 버퍼 (우리는 우리의 연구에 사용 된), 1X PBS, 1mM의 EDTA, 0.1 M 등의 항원 결정기 (31, 32)를 검색하기 위해 면역 조직 화학 (IHC)과 전자 현미경에 사용되는 여러 소금 버퍼를 테스트 트리스 - 염산 pH 7.4의 증류수. EDTA 버퍼가 조직을 손상하는 경향이 있지만, 다른 모든 버퍼는 신경 세포의 핵 내에 같은 하나 또는 여러 개의 반점 (그림 2A, 이러한 조직이 고도의 자동 형광 일부에 표시되어 있습니다 나타납니다 HSV-1 검출에 적합한했다 cytop에 균일 한 .......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 프로토콜은 쥐 신경 조직 섹션의 뉴런 사이 HSV-1 잠상 게놈의 검출을 허용한다. 바이러스 유전자 발현을 조절하는 경로에 대한 우리의 이해는 신경 조직 내에서 동일 반응계에서 HSV-1 게놈 DNA를 검출하는 방법의 부족에 의해 제한되었다. 게놈 복사 번호 감염된 신경 세포의 비율에 대한 정보는 해리 신경 세포 (11, 12)에 대한 PCR 분석을 주로했다. HSV-1 대기의 역할에 호스트 세포의 핵 구조를 해명에서, 우리는 잠재적으로 감염된 쥐의 신경 세포의 핵 내에 DNA-FISH에 의한 잠재 HSV-1 게놈의 현지화를 결정하기 위해 설정합니다. 우리는 DNA-FISH 프로토콜 및 조직 치료의 다양한 테스트 및 바이러스 DNA-FISH 검출의 필수 단계로 열 기반 "에피토프 마스크 해제"를 발견했다. 이러한 치료는 정기적으로 면역 조직 화학 염색을 위해 파라핀 섹션 내에서 단백질 항원을 표시하는 데 사용됩니다. 그것은 거의 보편적으로 사용되지만병리, 그.......

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 HSV-1에서 샘플을 제공 N. 사우 (신시내티 아동 병원 의료 센터, 신시내티, 오하이오, 미국), S. Efstathiou (영국 케임브리지 대학)와 제임스 힐 (LSU 건강 과학 센터, 뉴 올리언스, 미국) 감사 각각 생쥐와 토끼를 감염 및 시약, 도움이 토론 H. 마스 모토 (카즈 사 DNA 연구소, 치바, 일본)와 S. Khochbin (문화원 알버트 Bonniot, 그르노블, 프랑스).

이 작품은 (PL, http://www.cnrs.fr에 ATIP 프로그램) 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique (CNRS)에서 교부금, 프랑스의 국립 연구 기관 (ANR) (ANR-05-MIIM -에 의해 투자되었다 008-01, CENTROLAT, http://www.agencenationale-recherche.fr ), FINOVI 재단 ( http://www.finovi.org/:fr:start ), LabEX DEVweCAN (ANR-10-LabX에-61 ) Université 드 리옹, 프로그램 내에서 "InvestissemenTS 디 Av....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Balb/c 마우스Janvier, France6주 된 암컷
HSV-1 균주SC16 균주(야생형) 참조:Labetoule, M. et al. Invest. 안과. Vis. Sci 44, 217– HSV-1 균주 및 바이러스 재고 준비에 대한 자세한 내용은 225 (2003)
케타민 염산염SigmaK2753케타민(100mg/kg)과 자일라진(10mg/kg)을 함유한 용액의 복강 내 주사
SigmaX1251
파라포름알데히드(PFA)시그마158127물 90ml에 PFA 4g을 현탁합니다. 50 µ를 더합니다. 1N NaOH의 l, 60 °에서 가열; C 교반과 함께 수조에서. PFA는 약 30분 안에 용해됩니다. 10x PBS 10ml를 추가합니다. 이 용액은 미리 준비하고 -20°C로 보관할 수 있습니다. 5ml 튜브에 C. 주의. 흄 후드 아래에서 조작하십시오.
생리학적 식염시그마07982-100TAB-F
1x PBS, pH 7.4 (멸균)Life Technologies10010-015 
설탕시그마841001x PBS에 20% 자당 용액을 준비합니다.
냉동 절제 임베딩 매체 - Tissue-Tek OCT CompoundSAKURA4583 
대형 벡터 DNA 정제 키트Qiagen12462HSV-1 게놈을 포함하는 Cosmid 또는 BAC 벡터를 정제하고 -20°C에 저장합니다. C
Nick 번역 키트Roche Applied Sciences10 976 776 001 
Cy3-dCTPGE 헬스케어PA53021빛으로부터 보호
0.5 M EDTA시그마E6758 
G50 미니 스핀 칼럼GE 헬스케어27-5330-01 
연어 정자 DNA 10 mg/mlInvitrogen Life Technologies15632-011 
에탄올 분자 생물학 등급Sigma8704770% 용액 준비
연어 정자 DNAInvitrogen Life Technologies15632-011 
포름마미드 분자생물학 등급시그마F9037주의. 흄 후드 아래에서 조작하십시오.
HSV-1 비오틴화 상업용 프로브 엔조 생명과학ENZ-40838 
ImmEdge 소수성 펜Vector LaboratoriesH-4000 
20x 식염수 구연산나트륨(SSC)SigmaS6639ddH20에서 2x SSC 용액을 준비합니다.
Triton X-100SigmaT878710% 원액을 물에 넣고 +4°C에서 보관합니다. 사용 직전에 1x PBS에 0.5% 용액을 준비합니다.
10mM 구연산나트륨 pH 6.0SigmaS1804100mM 원액(10x)을 준비합니다. 구연산 10.5g(MW 210.14)의 무게를 잰다. 주의, 자극성 및 독성이 있으므로 적절한 마스크와 장갑을 착용하고 400ml의 물에 녹입니다. 6.0N NaOH로 pH를 1로 조정합니다(주의, 자극성, 장갑 착용). 증류수와 함께 500ml로 조정하십시오. 사용하기 전에 증류수에 10배 희석하십시오.
아세트산시그마320099 
메탄올, 분자 생물학 등급시그마322415 
덱스트란 황산염 - MW 500,000EuromedexEU0606-A 
Denhardt의 솔루션 (100x)Euromedex1020-A 
고무 시멘트 "FixoGum"Marabut290110000 
DNA 정제 키트  - Qiaquick PCR 정제 키트Qiagen28104 
T7 in vitro 전사 키트Ambion Life TechnologiesAM1314 
비오틴-16-UTP로슈 응용 과학11388908910 
RNA 정제 미니컬럼Qiagen73404 
리보뉴클레오시드 바나딜 복합체뉴잉글랜드 바이오랩스S1402S 
H2O2SigmaH3410증류수에 3% 용액을 준비합니다. +4 °에 저장하십시오. C는 빛으로부터 보호하십시오.
효모 tRNAInvitrogen15401011RNAse 무료 물에 10 mg/ml 용액을 준비합니다
일반 염소 세럼InvitrogenPCN5000 
차 항체모든 공급업체결과 섹션에서 사용된 1차 항체는 다음과 같습니다: anti-mouse CENP-A (rabbit mAb C51A7, Cell Signaling Technologies) 및 anti-ATRX H-300 (Santa Cruz Biotechnology)
2차 형광 항체Invitrogen Life Technologies프로토콜에서 일상적으로 사용되는 형광 2차 항체는 Alexa Fluor labeled goat antibodies (IgG H+L)입니다. 결과 섹션에 사용된 항체는 Alexa Fluor 488(참조 A11001)로 분류된 항토끼 염소 항체입니다
티라미드 신호 증폭(TSA) 키트 - Streptavidin + Alexa Fluor 350(파란색 형광)Invitrogen Life Technologies#T20937TSA 키트는 Perkin Elmer
Tyramide Signal Amplification(TSA) 키트인 Streptavidin + Alexa Fluor 488(녹색 형광)Invitrogen Life Technologies#T20932
Hoechst 33342Invitrogen Life TechnologiesH35700.5 &마이크로를 준비합니다. 사용 직전에 1x PBS에 있는 g/ml 해결책. 남은 용액을 버리십시오.
22 mm x 50 mm 커버슬립. N&DEG; 1.5 유리전자 현미경 과학72204-04 
페이딩 방지제가 함유된 마운팅 매체 - VECASHIELDVector LaboratoriesH-1000또 다른 일반 제품은 Electron Microscopy Science Superfrost 유리 슬라이드의 Fluoromount G입니다
FisherScientific12-550-15 
장비 / 재료회사참조참고
: 감염유리 마이크로 피펫 열간 인발. 맞춤 제작.
해부 장비Moria, FranceMicrosurgical 가위 및 집게
연동 펌프Cole Palmer InstrumentsEasyload Masterflex
Microsyringe 펌프 장치 (나노 펌프)kdScientificKDS310 
크라이오스탯라이카 프랑스CM 1510-1 
-80 > C 냉동고산요울트라 로우 -80 ° C
가정용 전자 레인지 
드라이 블록 히터Eppendorf022670204 
인큐베이터 슬라이드 해자Boekel Scientific240000 
코플린 항아리도미니크 더처68512 
스테인링 글라스 용기Dominique Dutscher68506 
형광 현미경Zeiss결과 섹션에 제시된 이미지는 Zeiss AxioObserver를 사용하여 objective 40X LD NeoFluor N.A 0.6 및 100X PlanApochromat N.A 1.3으로 수집되었습니다. 필터 세트 #38, #43 및 #43. HXP 120 형광 광원. 광도 CoolSNAP HQ2 CCD 카메라. Zeiss AxioImager/AxioObserver 시리즈, Nikon Ti-E/Ni-E 시리즈 또는 Leica DM/DMI6000 시리즈와 같은 최신 고효율 현미경에서 신호를 더 쉽게 관찰할 수 있습니다
를 참조하십시오.수 . 1.에서도 사용할 수 있습니다. 용 바늘 .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Knipe, D. M., Cliffe, A. Chromatin control of herpes simplex virus lytic and latent infection. Nat. Rev. Microbiol. 6 (3), 211-221 (2008).
  2. Bloom, D. C., Giordani, N. V., Kwiatkowski, D. L. Epigenetic regulation of latent HSV-1 gene expression. Biochim. Biophys. Acta....

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

HSV 1 DetectionFluorescent In Situ HybridizationNeuronal Tissue AnalysisTrigeminal Ganglion SectioningHeat Based Antigen UnmaskingDNA RNA Protein Triple StainingConfocal Microscopy ImagingViral Genome LocalizationLatent Virus DetectionSingle Cell Codetection

관련 논문