시각화 및 정량하기 위해 형광 단백질을 사용하여 클라미디아 액포 성장 역학 살아있는 세포에서

요약

클라미디아를 함유한 세포 액포(내포물)를 조명하기 위한 살아있는 세포 형광 단백질 기반 방법이 설명되어 있습니다. 이 전략을 사용하면 샘플에서 클라미디아 감염성을 빠르고 자동으로 측정할 수 있으며 개재물 성장 역학을 정량적으로 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

초록

세포 내 세균인 클라미디아(Chlamydia)는 전 세계 공중 보건에 큰 부담을 안겨주고 있습니다. C. 트라코마티스(C. trachomatis)는 성병의 주요 세균 원인이자 전 세계에서 예방 가능한 실명의 주요 원인입니다. 클라미디아에 의한 숙주 세포의 성공적인 감염을 위한 필수 결정 요인은 인포물(inclusion)이라고 하는 새로운 액포 구획 내에서 숙주 세포 신호를 조작하는 박테리아의 능력입니다. 내포물 내에서 클라미디아는 2-3일의 발달 성장에 필요한 영양소를 획득하고, 액포막의 세포질 표면과 숙주 세포질로 효과기 단백질 패널을 추가로 분비합니다. 그러나 클라미디아 생물학에 대한 이해의 격차는 이 세포 내 구획을 시각화하고 분석하는 데 상당한 어려움을 제시합니다. 최근에는 숙주 세포를 발현하는 GFP를 사용하여 내포물을 시각화하기 위한 역이미징 전략이 설명되었습니다. 이 접근 방식은 GFP와 같은 큰 분자에 대한 개포막의 고유한 불투과성을 합리적으로 이용합니다. 이 연구에서는 클라미디아 내포물의 후속 시각화를 위해 GFP 또는 mCherry 발현 숙주 세포가 어떻게 생성되는지 설명합니다. 또한, 이 방법은 비용이 많이 드는 항체 기반 계수 방법을 효과적으로 대체하는 것으로 나타나고, GFP 발현 클라미디아와 같은 다른 형광 표지와 함께 사용할 수 있으며, 다양한 클라미디아 종 및 균주에서 개포막 성장에 대한 주요 정량적 데이터를 도출하는 데 활용될 수 있습니다.

서론

세포 내 세균의 클라미디아의 종에 의해 발생하는 감염성 질환은 성병, 골반 염증성 질환, 실명, 폐렴 가능성이 동맥 경화 ^1-4을 포함하여 세계 보건에 큰 부담을 유도. 액포 내에서, 숙주 세포와 상호 작용하는 클라미디아의 능력 (포함 되나), 숙주 세포의 성공적인 감염 중요한 결정 요인이다. 포함은 클라미디아 성장을 가능하게하고 동적으로 클라미디아 ^5의 전체 2~3일 발달주기에 걸쳐 수정 된 새로운 병원성 구획입니다. chlamydiae의 의무적 세포 내 성격은 직접 포함의 독특한 생물학을 연구, 특히 연구 커뮤니티에 많은 과제를 제시한다. 주요 장애는 효율적으로 세포 내 클라미디아 또는 형광 접근하여 그들의 포함를 시각화하는 무능력하고있다살아있는 세포에서 말이지. 최근의 발견은 마지막으로 GFP C를 표현을 생성하는 방법을 공개했다 트라코마 티스 ^(6); 그러나,이 연구 결과는 아직 포함 특정 라벨을 주도하지 않았습니다. 일부 기술은 박테리아 나 개재물 ^7,8의 표시에 대해 기재되었지만, 이러한 photobleaching에 비 - 특이 조로 감수성과 같은 단점을 겪는다. 우리 그룹에 의해 중요한 발견은 숙주 세포 ....

프로토콜

형광 숙주 세포 라인의 1 세대

1. / 잘 2 × 10 ⁶ 세포에서 6 웰 플레이트에 일 1. 플레이트 293T 세포 (또는 다른 레트로 바이러스 포장 라인) ~ 75 % 합류 다음날합니다. 원한다면, 각각의 레트로 바이러스에 대한 중복 웰 플레이트가 사용될 수있다.
2. 주 2. 대기음 세포 및 2를 가하여 신선한 성장 배지 (DMEM + 10 % FBS + 2 mM의 L- 글루타민). 리포 펙 타민 2000 또는 유사한 시약을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 5-8 μg의 레트로 바이러스 벡터 (GFP를 포함) 및 포장 벡터의 각 (예., pVSVg)와 세포를 형질.
3. 1 ml의 성장 매체와 매체를 교체 이후 37 ° C CO ₂ 배양기에서 4-6 시간 동안 DNA와 세포를 품어합니다.
4. 37 ° C CO _{2 배양기에서} 48 시간 동안 세포를 품어.
5. 일 3. 플레이트 표적 세포 (예., 헬라) ¹⁰⁵ 세포의 밀도로 대략 6 웰 플레이트 상 / 웰이 될 ~ 50 % 합류다음날. 거꾸로 현미경에 GFP의 형광을 모니터링하여 293T 세포에 긍정적 인 형질을 확인합니다.
6. 주 4. 수집 레....

결과

세포질 형광 단백질 (예를 들면, GFP)를 발현하는 포유 동물 세포는 살아있는, 감염된 세포 배양에서 클라미디아 흠의 조명을 사용하도록 설계 될 수있다. 클라미디아 감염시, 포함은 숙주 세포 (그림 1)에 검은 반점으로 쉽게 볼 수 있습니다. 형광 부족 개재물의 선명도는보기 및 / 또는 치료 (그림 1)의 여러 분야에 걸쳐 개재물의 자동 식별을 위해 이용 될 수있다. 형광 숙주 세포가 생성되면, 강력한 워크 플로우 실험 샘플에서 클라미디아 감염 수준의 빠른, 정량 분석​​에 사용할 수 있습니다. 하나의 주요 응용 프로그램은 라이브, 감염된 세포에서 클라미디아 포함 형성 단위 (IFU) (그림 2)의 결정이다. 이 실험 전략은 일상적 분야에서 사용되는 면역 절차에 대한 필요성을 제거 모두 시간과비용이 많이 드는.

기재된 촬.......

토론

여기에서 우리는 실시간으로 시각화 및 클라미디아 흠의 분석을위한 형광 숙주 세포를 생성하는 실험적인 전략을 설명합니다. 이 공포의 시각화 방법은 시간이 지남에 따라 단일 세포 세포의 인구를 통해 또는에서 클라미디아 개재물의 동적 특성을 조명 추적하고 정량적으로 측정 할 수있는 강력한 능력을 부여한다. 클라미디아 흠을 형광 단백질 표지 세포에서 눈에 띄게 잘 그들이 쉽게 식별되도록, 정의 추가 면역 처리 없이도. 또한,이 방법은 세포 및 포함 곡률 당 공포의 번호와 같은 다른 클라미디아 종과 변종이 소유한다는 서명 형태 학적 차이를 해결하기에 충분히 민감하다. 또, 촬상 소프트웨어가 자동 GFP 발현 숙주 세포에서 개재물을 식별하도록 구성 될 수있는 방법을 보여준다. 김정일에 대한 면역 형광 라벨 단계의 obviation클라미디아 개재물의 lumination는 포함 형성 단위 (IFU)의 결정으로 엔드 포인트 분석에 대해 사용자가 상당한 시간과 비용 절감을 초래한다. 감염된 세포의.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668
Opti-Mem	Invitrogen	31985
폴리브렌	시그마	H9268
0.45 µ m 필터	: Fisher	09-719D
G418	Invitrogen	10131
HBSS	Invitrogen	14025
DMEM	Invitrogen	11995
RPMI 1640	Invitrogen	11875
RPMI 1640, 페놀 레드 제외	Cellgro	17-105-CV
페니실린 G	Sigma	13752
Cycloheximide	Sigma	C7698
유리 바닥 접시	MatTek	P35G-1.5-14-C
챔버 슬라이드, Lab-Tek II	Nunc	154526, 154534