방법 논문

Polysom​​e 프로파일에 의한 스트레스 조건에서 번역 개시 분석

DOI:

10.3791/51164

⸱

2014년 5월 19일

 ,  , 
1Department of Molecular Biology, Medical Biochemistry, and Pathology, Faculty of Medicine, Laval University, 2CHU de Quebec Research Center

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

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여기, 우리는 조건을 강조하는 응답 진핵 세포의 mRNA의 번역 개시의 변화를 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비 번역 리보솜에서 리보솜을 번역 자당 기울기의 속도 분리에 근거한다.

초록

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mRNA의 번역의 정확한 제어는 특히 생리 학적 및 병리학 적 스트레스에 대한 응답으로, 진핵 세포의 항상성을 위해 필수적입니다. 이 프로그램의 변경은 암 발달의 특징, 또는 신경 퇴행성 질환에서와 같이 조기 세포의 죽음에 손상된 세포의 성장으로 이어질 수 있습니다. 병진 제어를위한 분자 기초 관련된 알려진 정보의 대부분은 밀도 구배 분별 시스템을 사용 polysom​​e 분석으로부터 수득되었다. 이 기술은 선형 자당 기울기에 세포질 추출물을 원심 분리에 의존합니다. 스핀이 완료되면, 시스템은 다른 번역에 대응하는 원심 분리 영역 분별하고 정량화 따라서 polysom​​e 프로파일의 결과 인구 리보솜 허용한다. polysom​​e 프로파일의 변화는 스트레스의 여러 유형에 대한 응답으로 발생 번역 개시의 변화 또는 결함을 나타내는 수 있습니다. 이 기술은 또한 일을 평가 할 수 있습니다전자 번역 개시에 특정 단백질의 역할, 특정의 mRNA의 번역 활동을 측정 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 정상 또는 스트레스도 성장​​ 조건에서 진핵 세포와 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 polysom​​e 프로파일을 수행하기 위해 프로토콜을 설명합니다.

서론

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진핵 세포는 지속적으로 빠른 적응 세포 반응을 필요 유해한 생리 학적 및 환경 스트레스 조건의 범위를 발생. 세포 스트레스 반응은 안티 - 생존과 프로 생존 행동 요인 사이의 정확한 균형을 포함한다. 이 균형을 방해하는 것은 암과 신경 퇴행성 질환 등 인간의 병리의 개발을 선도하는 돌이킬 수없는 결과를 초래할 수 있습니다. 스트레스 반응의 제 1 단계를 실시하는 동안, 세포는 mRNA의 번역 수준에서의 유전자 발현의 변화의 조정 제어를 포함하는 계의 생존 경로를 활성화.

진핵 생물의 mRNA의 번역은 번역 개시 인자 (EIFS), 특정 RNA 결합 단백질 (RBDS), 그리고 RNA 분자에서 1 사이의 조정의 상호 작용을 포함하는 복잡한 세포 과정이다. 개시, 신장, 및 종료 : mRNA의 번역은 세 가지 단계로 구분된다. 모두 3 단계 REGU 대상이지만병진 제어 메커니즘 따라서이 단백질 합성의 속도 - 제한 단계를 구성하는 대부분의 번역 개시 위상을 표적 곡선 띠의 외곽에 있음을 주목 메커니즘.

번역 개시 내가 사전 개시 복합체의 형성에 선도적 인, 삼원 복잡하고 40S 리보솜 서브 유닛에 그 이후의 바인딩을 만난

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프로토콜

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프로토콜 지침을 따른다 라발의 윤리 심사위원회의 승인을.

1. 세포 배양의 준비 및 뇌 조작

  1. 포유류와 초파리 세포
    1. 미국 타입 컬쳐 컬렉션에서 권장하는 헬라에게 자궁 경부암 세포와 슈나이더 초파리 배아 세포를 성장. 낮은 통로에서 세포와 함께 작동합니다.
    2. 80 % 합류에게 실험 일에 도달하기 위해 플레이트 세포. 최상의 결과를 위해, 각각의 실험 조건에 대한 세포의 ~ 12 × 10 6를 사용합니다. polysom​​e 분석을 위해 추출을하기 전에 적어도 90 분 동안 신선한 완전 배지를 추가하여 변환을 자극한다.
  2. 뇌의 분리 : 생후 9, 16 일 사이에서 나이 든 쥐에서 뇌를 분리합니다. 안락사는 마취 및 자궁 경부 탈구 후 CO 2 흡입을 포함한다. 희생에 따라, 전체 뇌와 어느 장소를 격리 나T -80 ° C에서 직접 즉시 사용할 차가운 PBS 1X로 전송합니다.

2. 밀도의 준비 그라데이션 분별 시스템

  1. 5 분 동안 0.1 % SDS와 튜브 시스템을 씻으십시오. ....

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결과

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전술 한 바와 같이, polysome 프로필은 스트레스 조건 하에서 번역 개시의 변화의 분석. 한 이전 번역 개시 복합체의 정렬 어셈블리를 포함하는 다단계 공정되는 바와 같은 번역 개시의 개략적 인도 허용한다. 정상적인 성장 조건에서 번역 개시 복합체는 그 검출 polysome 프로파일에 의해 활성 번역 개시 (; 처리되지 않은 그림 2)에 대한 증명 폴리 리보솜으로 변환됩니다. 스트레스 조건에서하지만, 번역 개시는 80S monosomes의 축적과 polysome 피크의 감소 (, 프로 테아 좀 억제제 그림 2)의 결과로 차단됩니다.

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토론

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수 크로스 구배에서 polysome 프로파일 분석은 세포 나 조직으로부터 분리 9,11-14 polysomes의 농도를 분석하여 번역 개시의 측정을 허용한다. 이 기술은 최고 접근 (없는 독특한 경우) 생체 내에서 번역 개시를 측정합니다. 이것은 세포주기 (15) 동안 세포를 성장의 병진 상태를 모니터링하고, 번역 개시에, 바이러스 감염, 저산소증 13,16, 방사선 (17), 화학 약물 요법에 사용되는 (18) 등의 스트레스의 다양한 유형의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 이 기술은 세포 배양과 같은 뇌 및 간 같은 특정 조직의 번역 개시를 평가하기 위해 잘 작동하는 동안 그러나, 그것은 병든 조직 및 종양 대 정상의 번역 개시를 비교하는데 사용될 수있는 경우에 설립 될 남아있다.

polysom​​e 프로파일의 변화는 번역 연신율을 변경 조건에서 발생할 수 있습.......

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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PA는 라발 대학의 의학부에서 장학금 "피에르 듀 런드"의 수상자이다. 이 작품은 polysom​​e의 분별이 RMR M 새로운 CIHR 조사 급여 상을 보유하고 혁신 보조금에 대한 캐나다 재단 (MOP - GF091050)를 통해 획득 한 RM은 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (MOP - CG095386)에 의해 지원되었다.

우리는 박사 부부에게 감사의 말씀을 전합니다. 도움이 조언 E. Khandjian, I. Gallouzi, S. 디 마르코와 A. Cammas.

....

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Cells
HeLa 자궁경부암 세포미국형 배양 컬렉션 (Manassas, VA; ATCC)CCL-2
Schneider Drosophila 배아 세포미국형 배양 컬렉션(버지니아주 매나사스; ATCC)CRL-1963
배양 배지 및 보충제
슈나이더' s Drosophila 중간시그마-알드리치SO146-500ml 
DMEM생명 기술11995-073 
FBS피셔 과학자과학자 SH30396-03 
페니실린/스트렙토마이신생명 기술15140122
자당 용액
D-수크로오스피셔 사이언티스트BP220-212 
글리세롤시그마-알드리치49767 
브로모페놀 블루피셔 사이언티스트B3925
용해 버퍼
트리스 HCl피셔 사이언티스트BP153-500
MgCl2Sigma-AldrichM2670-100G
NaClTekniscience3624-05 
DTT시그마-알드리치D 9779 
Nonidet P40 (Igepal CA-630 )MJS Biolynx19628 
SDS테크니사이언스4095-02 
RNase 억제제 (RnaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제)생명 기술10777-019 
안티프로테아제 (완전, 미니, EDTA 무료)Roche11,836,170,001 
RNA 추출
단백질분해효소 K생명 기술AM2542 
페놀 : 클로로포름피셔 과학자BP1754I-400 
클로로포름피셔 과학자C298-500 
글리코겐라이프 테크놀로지10814-010 
이소프로판올아크로스 유기물327270010 
항체
anti-FMRP 항체Fournier et al., Cancer Cell International, 2010 
스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 5 (10), 827-835 (2004).
  2. Jackson, R. J., Hellen, C. U. T., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation....

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