우리는 뇌척수액 (CSF)에서 마이크로 RNA 프로필 실시간 PCR의 프로토콜을 설명합니다. RNA 추출 프로토콜을 제외하고, 절차는 다른 체액, 배양 된 세포 또는 조직 표본에서 추출한 RNA로 확장 될 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로 RNA (의 miRNA)는 자신의 번역 억압을 조절함으로써, 결과적으로의 mRNA에있는 사이트를 대상으로하는 RISC를 안내하여 유전자 조절의 강력한 층을 구성한다. miRNA의 발현의 변화는 모든 주요 복잡한 질병의 발달에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 최근의 연구 결과는의 miRNA가 세포 외 환경을 분비하고 높은 안정성을 순환 할 수있는 혈액 및 기타 체액을 입력 할 수 있음을 보여 주었다. 이러한 순환의 miRNA의 기능은 크게 애매 남아 있지만, 이러한 miRNA의 프로파일 배열과 같은 체계적인 높은 처리 방법은, 신경 퇴행성 질환 및 암의 여러 종류 등 여러 가지 병적 인 상태에서의 miRNA 서명의 식별로 이어질있다. 이러한 맥락에서, 뇌척수액에서의 miRNA 발현 프로파일의 식별은, 우리의 최근의 연구에보고 된, 바이오 마커 분석의 miRNAs 매력적인 후보가 있습니다. _content ">와 같은 마이크로 어레이와 같은 마이크로 RNA를 프로파일 링 할 수있는 몇 가지 도구가 있습니다, 정량 실시간 PCR (qPCR에), 깊은 시퀀싱. 여기에서, 우리는 정량 실시간 PCR에 의해 뇌척수액의 마이크로 RNA를 프로필에 민감한 방법을 설명합니다. 우리 Exiqon 마이크로 RNA 즉시 사용 PCR 인간의 패널을 사용하는 I와 수 II V2.R, 742 독특한 인간 마이크로 RNA의 검출. 우리는 세중 실행의 배열을 수행하고 우리가 제넥스 프로 5 소프트웨어를 사용하여 데이터를 처리하고 분석했다.
이 프로토콜을 사용하여, 우리는 성공적으로 세포 선 및 일차 전지, CSF, 플라즈마, 포르말린 고정 파라핀 조직의 다양한 종류의 마이크로 RNA를 프로파일했다.
서론
마이크로 RNA는 이후 전사적으로 유전자 발현을 조절하는 RNA를 비 암호화 (길이 NT 21-23) 소규모의 가족에 속한다. 마이크로 RNA들이 비교적 안정적인 것으로 나타나는 세포 외 공간으로 분비 될 수있다. miRNA의 발현의 변화를 결정하는 miRNA의 프로파일을 수행하고 많은 양의 데이터를 처리, 생체 식별 향한 중요한 단계 일 수 있지만 위협 할 수있다.
여기, 우리는 민감한 실시간 PCR에 의한 (기타 체액에 적용) 뇌척수액에서의 miRNA 발현의 변화를 확인하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 또한 통계 분석 결과의 그래픽 표현을 포함하여, 데이터 분석을위한 소프트웨어의 사용을 설명한다. 전체 절차는 비교적 쉽고 간단하며, 프로파일 및 실시간 PCR 기계의 수를 사용할 수 있습니다, 또한 상대적으로 빨리 할 수있는 샘플의 수에 따라 달라집니다. 실험 부분은 처리의 정확성을 필요로384 - 웰 플레이트에 RNA와 피펫, 제넥스를 사용하여 데이터 분석 섹션 정보학 및 통계의 몇 가지 기본 지식을 필요로하는 동안.
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프로토콜
다음 프로토콜은 준비 PCR 플레이트를 사용하여 CSF 및 프로필 마이크로 RNA에서 RNA를 분리하는 표준 절차를 설명합니다. 유기 상 추출은 선택 사항이며, 캐리어 RNA가 RNA의 최대 회수를 보장하는 동안 추출 시료에 첨가되어 있습니다. 결과적으로, RNA를 정량화 할 필요가 없다.
cDNA를가 (약 2 시간) 전날 합성하면 전반적으로, 6 ~ 8 판의 평균 하루에 실행할 수 있습니다. 모든 샘플은 프로파일 및 소프트웨어에로드 된 경우 데이터의 분석을 수행한다. 비교를위한 샘플 / 개 또는 그들의 조합의 수에 따라, 데이터 분석은 하나에서 여러 시간에 필요할 수도있다.
1. RNA 추출
RNA 추출이, CSF 샘플에서 수행 된 저장 분석까지 분량 씩 -80 ° C에 냉동. 이 절차 mirVana 파리 격리 키트 제조업체의 악기에 따라 사용총 RNA의 분리를위한 ctions. 작은 RNA 종에 대한 농축이 키트와 함께 가능하지만,이 단계가 완료되지 않고 RNA 추출 절차는 총 RNA의 분리 단계 이후에 종료,주의하시기 바랍니다. (다른 상업적으로 이용 가능한 RNA 분리 키트 등) mirVana 파리 분리 키트는 유기 추출을 필요로하지....
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결과
이 연구 결과는 이전에 1 발표되었다. geNorm 응용 프로그램을 사용하여 후보 참조 마이크로 RNA의 분석 1은 결과를 그림. 따라서,이 마이크로 RNA, 미르 - 622 미르-1266은 표준 발현 유전자로서 식별하고, miRNA의 값을 정규화하기 위해 사용되었다.
CSF의 연구를 위해 우리가 샘플의 세 그룹을했다 : HIV-(N = 10), HIVE 뇌염없이 (N = 4), 그리고 HIV + (HIV +, N = 5). 두 그룹은 HIVE 및 HIV +는, 제어 HIV-그룹과 비교 하였다. 통계 분석 후 (2.3.3 절) 열한 마이크로 RNA의 발현 수준이 1 통계적으로 유의. 2이 열한 마이크로 RNA의 상자 플롯을 나타내는 그림 발견, 미르-1203-1224.......
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토론
마이크로 RNA는 번역 억제 및 / 또는 mRNA의 분해 2를 촉진하여 유전자 발현을 조절하는 작은 비 암호화 RNA를합니다. 때문에 세포가없는 조건에서 높은 안정성, 마이크로 RNA는 많은 체액에서 검출되었다. 또한, 마이크로 RNA의 서로 다른 발현 양상은 인간의 암 3-9의 다양한 단계 및 / 또는 진행과 상관 관계가있다.
고전 칩 배열하거나 최신 깊은 시퀀싱 기술을 포함한 마이크로 RNA 프로필에 사용할 수있는 여러 가지 도구가 있습니다. 그러나, 우리는 RNA를 최소한의 양을 요구하는 추가적인 장점을 갖는다 고감도의 qPCR 플랫폼 (10), (11)을 이용하기로했다. miRCURY LNA 범용 RT 마이크로 RNA PCR 프로토콜은 (40)은 전체 두 패널 배열 겨, 20 μL의 cDNA 합성 반응 당 총 RNA를 겨 (20)를 사용하도록 최적화되어 있습니다. valuabl 다룰 때 RNA의 소량을 사용하는.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
정신 건강의 국립 연구소에서 : 설명이 프로젝트는 보너스 번호 R01MH079751 (F. PERUZZI PI)에 의해 지원되었다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 정신 건강의 국립 연구소 또는 건강의 국립 연구소의 공식 견해를 대변하지 않습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
표 3. equipment. | |||
| Finnpipette Novus Multichannel Pipetter | Thermo Scientific | HH05279 | |
| Finntip 피펫 팁 | Thermo Scientific | 9400613 | |
| Thermal Cycler C1000 | Biorad | ||
| 0.2 ml Low Profile, 투명 PCR 튜브 | Biorad | TLS0801 | |
| Flat Cap Strips | Biorad | TLS0803 | |
LightCycler 480 Real-Time PCR System | Roche | ||
LightCycler 480 씰링 포일 | Roche | 04 729 757 001 | |
| 냉장 원심분리기 5804R | Eppendorf | ||
| 스윙 버킷 로터, 4개소 | Eppendorf | A-4-44 | |
| 벤치탑 미니 원심분리기 | Fisher | 05-090-100 | |
| Bench-Top Vortex | Fisher | ||
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 튜브, 멸균 | Fisher | 02-681-5 | |
| Matrix Reagent Reservoir, 25 ml | Thermo Scientific | 8093 | |
| Thermomixer Confort | Eppendorf | ||
Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15 | Sigma | ||
| Bench-Top Vortex | Velp Scientifica | F202A0173 | |
표 4. 시약 목록. | |||
| Universal c-DNA synthesis kit, 16-32 rxns | Exiqon | 203300 | |
| SYBR Green master mix, Universal RT, 25 ml | Exiqon | 203400 | |
| Ultrapure Distilled Water Dnase, Rnase free | Invitrogen | 10977-015 | |
| MicroRNA 바로 사용 PCR 인간 패널(I+II) V2.R | Exiqon | 203608 | |
mirVana miRNA 분리 키트, 40개 분리 | Ambion | AM1556 < | |
| p>MS2 RNA 운반체 | Roche Applied Science | 10165948001 | |
2-메르캅토에탄올 98% | 시그마 알드리치 | M3148-25ml | |
| 에탄올 100% | Carlo Erba | 64-17-5 | |
| Nuclease free water | Qiagen | 1039480 | |
RNAse Zap | Ambion | AM9780 |
참고문헌
- Pacifici, M., et al. Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis. J. Cell. Physiol. 10, (2012).
- Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (20....
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