방법 논문

종합 달팽이 프로테옴을 확인하는 상향식 (bottom-up)과 샷건 단백질 체학 (Proteomics)

DOI:

10.3791/51186

⸱

2014년 3월 7일

 , 
1Department of Otolaryngology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

막 단백질을 분리하고 식별하기 어렵 기 때문에 인공 감각 상피 세포의 프로테옴 분석 인해 작은 크기와에 도전하실 수 있습니다. 막과 용해성 단백질 모두 고해상도 질량 분석법과 함께 체류 분취 방법 및 분리 기술을 조합하여 식별 될 수있다.

초록

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단백질 체학은 복잡한 생물학적 시스템에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다 일반적으로 사용되는 방법입니다. 인공 감각 상피 세포는 말초 및 중추 신경 시스템에 의해 처리 전기 화학 에너지로 소리의 기계적 에너지를 형질 도입 수용체가 포함되어 있습니다. 여러 프로테오믹스 기술은 두 가지 차원의 차이 겔 전기 영동 (2D-DIGE), 항체 마이크로 어레이 및 질량 분석 (MS)와 같은 인공 내이 (内耳)를 연구하기 위해 개발되었다. MS는 단백질 체학에서 가장 포괄적이고 다양한 도구와 분리 방법과 함께 생체 시료에 대한 심층적 인 프로테옴을 제공 할 수 있습니다. MS와 결합 분리 방법은, 단백질 시료를 농축 저분자 및 소수성 단백질을 검출하고 프로테옴 동적 범위를 감소시킴으로써 낮은 풍부한 단백질을 식별 할 능력이있다. 다른 소화 전략은 펩티드 및 단백질 바로 전체 용해질 또는 분획 된 단백질 용 해물을 적용 할 수있다시퀀스 범위. 강한 양이온 교환 (SCX), 역상 (RP) 및 겔 용출 액체 분획 포착 전기 영동 (GELFrEE) 등 다른 분리 기술의 이용은 단백질 식별 전에 MS 분석으로 샘플의 복잡성을 줄이기 위해 적용될 수있다.

서론

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단백질 체학은 단백질 발현, 기능, 수정 및 상호 작용 1을 분석하여 복잡한 생물학적 시스템의 연구이다. 여러 가지 방법 항체 마이크로 어레이 2, 이차원 전기 영동 3-5 및 DIGE 6 등의 내이 (内耳)의 프로테옴 분석에 이용되어왔다. 그러나, 단백질의 단지 제한된 수의 확인 된 및 내이 11,12에서 식별 10,000 이상의 유전자 발현 서열 태그 (EST를)에 비해 2,7-10을 특징으로, MS는 가장 일반적으로 사용되는 기술이다 포괄적 단백질 특성 분석을위한 단백질 체학에서. 같은 달팽이관과 같은 복잡한 단백질체 시료의 분석, 도전하실 수 있습니다. 그러나, MS와 여러 분리 기술의 조합으로 인해 증가 된 동적 농도 범위 및 최대 용량 (13)에, 펩티드 및 단백질의 더 큰 개수의 식별을 가능하게한다. 다차원 chromatograPHY는 상이한 흡착 메카니즘의 사용을 허용하여 매우 복잡한 단백질 혼합물을 감소시킨다. 두 일반적으로 사용되는 MS 프로테옴 분석 방법, 산탄 총과 상향식 (bottom-up) 단백질 체학이 있습니다. 샷건 프로테오믹스에서 그대로 단백질의 혼합물 효소 소화 강한 양이온 교환 크로마토 그래피 역상 액체 크로마토 그래피 (RPLC) 14, 15 다음에 (SCX)와 다차원 크로마토 그래피를 이용하여 분리된다. 분리 된 펩티드는 탠덤 MS의 대상 및 데이터베이스 (15)를 찾고 있습니다. 이 기술의 주요 이점은 단백질 수천 번의 분석으로 식별 될 수 있고, 기술은 막 단백질에 더 적합하다는 것이다.

상향식 접근법에서, 단백질 혼합물은 보통 하나 또는 이차원 전기 영동으로 분리하고, 각각의 단백질 밴드 또는 스폿은 대개 여러 펩티드의 결과, 트립신과 같은 효소로 잘라 소화. 그러나, 또 다른 최근의LY는 상향식 (bottom-up) 단백질 체학에 사용, 전기 접근 방식을 개발, GELFrEE입니다. 이 기술은 액상 단백질 샘플을 fractionates 전에 분석하기가 덜 복잡합니다. 이 기술은, 재현성 높은 단백질 복구를 제공하고, 복합 단백질 시료 (16)에서 높은 풍부한 단백질의 분포를 감소시킨다. 분리 된 단백질로부터 생성 된 펩티드, 데이터베이스는 17-19을 검색하기위한 태그 서열을 생성하기 위해, 펩티드 질량 지문 또는 탠덤 MS (MS / MS)를 사용하여, MS에 의해 분석된다. 상향식 접근법을 사용의 주요 이점 중 일부는 고해상도 분리 및 단백질의 광범위한 커버리지를 획득 할 수있는 능력이다. 상향식 (bottom-up) 단백질 체학은 단백질 체학 (20)에서 가장 널리 사용되는 기술이다, 따라서, 여러 생물 정보학 도구를 사용할 수 있습니다. 또한, 단백질은 소화 전에 복잡한 혼합물에서 분리 될 수 있으므로, 식별 큰 기회가있다.

주요 과제 중 하나프로테오믹스 분석 내이 (内耳)를 사용하여 작은 크기, 제한된 접근성, 세포 유형의 다양성 (21)이다. 또, 이온 채널, 전송기 및 수용체로서의 기능을 구별 키 단백질은, (22)을 분리하기 어려울 수 멤브레인 단백질이다. 따라서, 필터 원조 샘플 준비 (FASP)은 단백질 추출을 위해 제한됩니다 조직의 단백체 분석에 유리하고 막 (23)을 용해하기 위해 세제를 필요로하는. 이러한 필터링은 막과 용해성 단백질의 MS 분석 및 저 분자량 오염물 23,24로부터 펩티드를 분리 할 수있는 능력을 허용한다.

본 프로토콜은 합하고 수용성 및 멤브레인 단백질 모두를 분석하여 인공 와우 감각 상피에서 단백질 ID의 수를 최대화하기 위해 수정되고 일반적으로 사용 프로테오믹스 방법을 설명한다. 우리는 FASP 멀티 소화와 샷건 프로테오믹스를 사용하여 설명합니다이온, 이온 교환 크로마토 그래피, 고해상 MS 및 데이터 분석. 또, GELFrEE, FASP 멀티 소화 고해상도 MS, 데이터 분석 상향식 프로테오믹스 설명한다.

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프로토콜

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윤리 정책

건강의 국립 연구소의 지침에 따라 명시된 마우스 조직을 사용하여 실험은 사우스 플로리다 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (프로토콜 3931R, 3482R)에 의해 승인되었다.

1. 단백질 추출

  1. C. ° -80 16 30 일 이전 (P30) CBA / J 마우스 및 저장소에서 인공 감각 상피를 분리
  2. 실험 당일, 1X 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 500 μL와 조직을 세척 하였다. 1,000 XG에 3 분 동안 원심 분리하고, 상층 액을 제거합니다. 총 3 회 세척을 반복합니다.
  3. 에 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 120 mM의 NaCl을, 50 mM의 불화 나트륨, 5 mM의 EDTA, 500 ㎍ / ㎖의 AEBSF, 10 ㎍ / ㎖의 류 펩틴, 100 μg을 / 포함 용해 버퍼 100 μL에서 얼음에 30 초 동안 초음파 처리 조직 소닉 dismembrator (; 써모 피셔 모델 100)를 사용하여 펩 스타틴 ㎖, 2 ㎍ / ㎖의 아프로 티닌, 0.5 ㎍ / ㎖의 microcystin. 얼음 시원한 해물각 초음파 사이에 1 분. 배의 총 초음파 처리.
  4. 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거합니다. 얼음에 30 초 동안 초음파 처리에 의해 용해 완충액 50 μL에 펠렛을 추출합니다. 2 분 동안 4 ° C에서 750 XG에서 추출물을 원심 분리기. 60 분 동안 4 ° C에서 28,600 XG에 해물과 원심 분리기를 모두 결합합니다. 새로운 마이크로 튜브에 뜨는을 제거하고 펠릿에 0.1 % ASB-14를 포함하는 20 ㎕의 용해 버퍼를 추가합니다. 소용돌이 1 분, 4 ℃에서 60 분 동안 배양
  5. 60 분 동안 4 ° C에서 냉각 한 후, 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 가열한다. 10 분 동안 25 ° C에서 16,000 XG에서 원심 분리에 따릅니다. 상층 액을 수집하고 새로운 튜브로 전송할 수 있습니다.
  6. 5 분 동안 4 ° C에서 16,000 XG에 현탁액을 원심 분리기와 소화에 뜨는을 유지합니다.

2. FASP를 사용하여 전체 해물 더블 트립 틱 단백질 소화

  1. 30 μ 추가4 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)를 포함하는 인공 단백질 추출물,의 (400μg의 ≤) L 나누어지는, 100 MM 트리스 - 염산, 직접 30K 스핀 필터의 pH 7.6와 0.1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)과 8의 200 μL와 혼합 트리스 - 염산에있는 M의 요소. 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
  2. 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석.
  3. 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 요소 용액에 10 배 요오도 아세트 아미드 (IAA)의 10 μl를 추가합니다. 10 분 동안 14,000 XG에서 원심 분리 어두운 실온 (RT)에서 20 분 동안 스핀 필터를 배양한다.
  4. 15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에서 농축에 8 M 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 50 mM의 중탄산 암모늄 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기 (ABC) 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
  5. 1:100에서 트립신의 0.4 ㎍ / ㎕의 추가 (W / W) 효소에단백질 비율이 37 ℃에서 하룻밤 (O / N)를 배양
  6. 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 장치와 원심 분리기를 필터링하는 50 mM의 ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  7. 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 % 포름산 (FA)로 산성화.
  8. 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
  9. 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후
  10. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가하여 다이제스트 번째부터 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  11. 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 %에 FA로 산성화.
  12. 샘플을 표준으로 BSA를 사용하여 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다.

3. FASP를 사용하여 전체 해물 엔도의 lysC 및 트립 틱 단백질 소화

  1. 직접 30K 스핀 필터 4 % SDS, 100 MM 트리스 - 염산, pH를 7.6 및 0.1 M DTT를 포함하는 인공 단백질 추출물의 30 μL 나누어지는 (400μg의 ≤)를 추가하고 트리스 - 염산 8 M 요소의 200 μL와 혼합 . 15 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
  2. 15 분 동안 14,000 XG에 8 M의 요소 솔루션 및 원심 분리기 200 μL로 농축 물을 희석.
  3. 1 분에 대한 필터와 소용돌이에 집중할 8 M 우레아 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가합니다. 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 스핀 필터를 부화 후 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기.
  4. 8 M의 요소 졸 100 μl를 추가합니다15 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 집중의 ution. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
  5. 1:50 (W / W) 효소로 단백질의 비율로 엔도의 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다
  6. 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  7. 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 소화를 중지 1.0 %에 FA로 산성화.
  8. 8 M 요소의 40 μL와 필터 장치를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
  9. 50 mM의 ABC 용액 100 μL와 필터 유닛의 3 배를 씻으십시오. 최종 세척에 트립신의 0.4 ㎍ / μl를 추가 한 후 1:100 효소 - 투 - 프로TEIN 비율과 37 ℃에서 O / N을 품다
  10. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 부 및 원심 분리기에 50 mM의 ABC 용액 40 μl를 첨가함으로써 트립신 펩티드를 용출. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  11. 10 분 동안 14,000 XG에 필터 장치와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 트립신 펩티드를 포함하는 여과 액을 전송하고 1.0 % FA로 산성화.
  12. 샘플은 표준으로 BSA를 가진 마이크로 비색 분석을 사용하여 정량 할 수있다.

4. 스핀의 열을 사용하여 탈염 펩티드

  1. 1 분 1,100 XG에서 아세토 니트릴 (ACN) 및 원심 분리기 500 μl를 추가하여 C 18 MacroSpin 열을 활성화합니다. 원심 분리 후 흐름을 통해 폐기하십시오.
  2. 1 분 1,100 XG에서 0.1 % FA 원심 분리기 500 μL에 열을 평형. 흐름을 통해 폐기하고이 단계 1X를 반복합니다.
  3. 펩티드의 500 μL를 추가 열을 소화1 분 1,100 XG에 D 원심 분리기. 샘플 부피는 500 μL보다 큰 경우,이 단계를 반복한다.
  4. 1 분 1,100 XG에서 500 0.1 % FA ㎕의 원심 분리기와 열을 씻으십시오. 흐름을 통해 폐기하십시오. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  5. 1 분 1,100 XG에 열 및 원심 분리기 90:10 ACN - 투 - 물 비율을 250 μl를 추가합니다. 탈염 펩타이드를 포함하는 용출액을 수집하고 새로운 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  6. 진공 원심 분리기의 탈염 펩타이드 샘플을 건조 완전히 샘플 건조시키는 마십시오.

5. 이온 교환 크로마토 그래피

  1. 펩티드를 분리하는 200 X 2.1 mm, 5 μm의의 SCX 칼럼 (Polysulfoethyl A)에 소화 된 단백질 시료의 50 ~ 100 μg을 주입한다.
  2. 250 μL / 분의 유속으로 50 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 솔벤트는 5 MM의 암모늄 포름산, 25 % 아세토 니트릴의 pH 3.0 및 75 %의 DDH 2 O입니다 용매 B는 500 MM의 암모늄 포름산, 산도입니다6.0 25 %의 ACN 75 %의 DDH 2 O.
  3. 280 nm에서 펩티드 분수를 모니터링하고 일부 컬렉터를 사용하여 2 분 간격으로 분수를 수집합니다.
  4. 염 제거를 지원하기 위해 5 % FA를 포함 DDH 2 O의 50 % 아세토 니트릴 500 μL에서 진공 농축기와에 resuspend 드라이 분수.
  5. -80 ° C에서 Redry 분수 및 저장 나노 LC-MS/MS 분석을 위해 사용할 준비가 될 때까지.

6. 아세톤 강수량

이전 GELFrEE 분리에 인공 단백질 상층 액을 탈염해야합니다. 아세톤 침전 단백질을 탈염 및 농축 할 수있다.

  1. 인공 상층 액에 얼음처럼 차가운 아세톤의 세 볼륨을 추가합니다. 부드럽게 와동 -20 ° CO / N. 부화
  2. 4 ° C에서 15 분 동안 15,000 XG에서 샘플 혼합물을 원심 분리기 및 뜨는을 제거합니다.
  3. 4에서 5 분 동안 14,000 XG에서 냉장 아세톤 및 원심 분리기와 단백질 펠릿의 3 배를 세척° C.
  4. 펠렛을 건조시킨 18 MΩ 물 112 μL에 용해.
  5. 마이크로 비색 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정한다.

7. 달팽이 감각 상피의 GELFrEE 분별

  1. 5 배 샘플 버퍼 30 μl를 추가 (0.25 M 트리스 - 염산의 pH 6.8, 10 % (W / V) SDS, 50 % 글리세롤, 0.5 % (W / V) 브롬 페놀 블루) 18 MΩ 112 μL에 현탁 탈염 단백질 물.
  2. 단백질 이황화 결합을 줄이기 위해 5 분 동안 95 ° C에서 8 개월 DTT ㎕의 열을 추가합니다. 가열 한 후 실온으로 냉각 할 수 있습니다.
  3. 양극 저수지에 버퍼를 실행하는 8 ㎖, 수집 챔버를 샘플 버퍼를 실행 150 μL 및 음극 저수지에 버퍼를 실행 6 ㎖를 추가합니다.
  4. 피펫을 사용하여 샘​​플 로딩 챔버로 유입 된 수있는 버퍼를 제거합니다.
  5. 인공 단백질 혼합물의 하중 150 μL (≤ 1 ㎎)을, 샘플 로딩 챔버로 8 % TR을 사용3.5-150 kDa의의 질량 범위 카트리지 - 아세테이트이다.
  6. 실행을 시작하는 하부 전극 주변 기기의 뚜껑.
  7. 악기의 첫 번째 일시 정지시에 음극 저수지에 버퍼를 실행 2 ㎖를 추가하고 실행을 다시 시작합니다.
  8. 기기의 각 일시 정지 구간에서 피펫을 사용하여 시료 채취 실에서 샘플을 수집하고 갓 표시된 마이크로 튜브에 추가합니다. 버퍼를 실행 150 μL로 수집 챔버의 2 배를 씻어 버린다.
  9. 시료 채취 실에 신선한 실행 버퍼 150 μl를 추가하고 실행을 다시 시작합니다. 150 μL / 분획의 총 부피에서 2.6 시간의 기간 동안 단백질 분획을 수집한다.

8. GELFrEE 분수의 1 차원 젤 전기

1D 겔 전기 영동 전에 효소 소화와 MS 분석에 GELFrEE 분획으로부터 결과를 시각화 할 수있다. GELFrEE 단백질 분획 4-15% 트리스 - 염산 겔상에서 분리 될 수있다.

  1. (샘플 버퍼에 350 mM의 DTT) 샘플 희석 버퍼의 5 μl를 각 GELFrEE 분율의 5 μL 나누어지는 혼합.
  2. 3 분 동안 95 ° C에서 샘플을 가열한다.
  3. 실온으로 냉각 샘플.
  4. 개인 겔 레인과 마지막되지 않는 차선의 분자량 표준의 부하 5 μL의 각 GELFrEE 분율의 부하 10 μL.
  5. 염료 전면 겔의 바닥에 도달 할 때까지 1.5 시간 동안 125 V에서 젤을 실행하거나.
  6. 조심스럽게 젤을 제거하고 단백질 분리를 시각화하는 실버 스테인 플러스와 얼룩.

9. FASP 사용 GELFrEE 분획의 단백질 소화

변성 FASP 절차 GELFrEE 분획 세제 제거 및 분해하는 데 사용된다.

  1. 8 M 트리스 - 염산의 요소와 25 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기 200 μL와 혼합, 직접 30K 필터 장치에 각각의 부분을 추가합니다.
  2. 요소 용액 200 μL로 농축 물을 희석12 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  3. 각 필터 유닛, 1 분 동안 소용돌이에 집중하는 요소 용액에 10 배 IAA의 10 μl를 추가하고, 어둠 속에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
  4. 15 분 동안 14,000 XG에 필터 유닛 및 원심 분리기에서 농축에 우레아 용액 100 μl를 추가. 이 단계의 2 배를 반복합니다. 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 용액 100 μl를 추가합니다. 이 단계의 2 배를 반복합니다.
  5. 필터 유닛에 1:50 (W / W) 효소에 단백질 비율로하여 lysC 0.1 ㎍ / μl를 추가하고 30 ℃에서 O / N을 품다
  6. 배양 한 다음, 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 100 ㎜ ABC 솔루션의 40 μl를 추가합니다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  7. 10 분 동안 14,000 XG에 스핀 필터와 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 새로운 마이크로 튜브에 각 스핀 필터에서의 lysC 펩타이드를 포함하는 여과 액을 전송하고 trifluoroac으로 산성화ETIC 산 (TFA).
  8. 8 M 요소의 40 μL와 스핀 필터를 세척 한 후 40 ㎕의 18 MΩ 물에 배를 세척한다.
  9. 스핀 필터는 50 mM의 ABC 용액 100 ㎕ 씩 3 배 씻으십시오. 최종 세척은 1:100 (w / w) 효소로 단백질의 비율로 트립신 0.4 ㎍ / μL를 추가하고 37 ℃에서 O / N을 배양 한 후
  10. 10 분 동안 14,000 XG에 50 mM의 ABC 솔루션 및 원심 분리기의 40 μl를 추가하여 각각의 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 용출한다. 이 단계의 1X를 반복합니다.
  11. 필터 유닛과 10 분 동안 14,000 XG에 원심 분리기에 0.5 M NaCl 용액 50 μl를 추가합니다. 신선한 모세관에 각 필터 유닛에서 트립신 펩티드를 함유하는 여액을 전송하고 TFA로 산성화.
  12. 진공 농축기에서 모두 소화 건조.

10. LC-MS/MS의 샘플 준비

  1. 재구성 건조의 lysC 및 트립 틱 펩타이드는 0.1 % FA와 소용돌이 20 ㎕에 분수를 소화.
  2. 10 20,000 XG에 원심 분리기 샘플분하고 새로운 샘플의 유리 병에 시료의 최고 95 %를 제거합니다.
  3. 염 및 오염 물질을 제거하고 75 μm의 × 10cm의 C 18 컬럼 크로마토 그래피 분리를 수행하기 위해 100 μm의 X 25mm 샘플 트랩에 펩타이드 분획의 5 μl를 주입한다.
  4. 200 NL / 분의 유속으로 100 분에 걸쳐 2-40%의 B의 구배를 사용한다. 용매는 95 % ddH2O 0.1 % FA를 함유 5 % 아세토 니트릴이다. 용매 B는 80 % ACN 0.1 % FA를 포함하는 20 % ddH2O입니다.
  5. 각 MS는 고해상도 질량 분석기에 스캔 열 텐덤 질량 스펙트럼을 수집한다. LTQ Orbitrap 질량 분석기는이 실험에 사용 하였다.

11. 단백질 확인

  1. 포워드 포함 UniProt의 마우스 데이터베이스를 사용하여 단백질을 확인하고 단백질 서열 및 일반 오염 물질을 역. 마스코트의 검색 엔진 MaxQuant 소프트웨어는 단백질 데이터베이스를 검색하는 데 사용됩니다.
  2. 사용할 수있는 검색 매개 변수를 포함, 고정 modific시스테인의 carbamidomethyl의 ATION는 메티오닌 산화 변수 수정, 단백질의 N-말단 아세틸 화, 2의 최대 분열을 놓쳤다. 식별을 위해 고려해야 할 최소 펩타이드 길이는 6 아미노산이다. ± 13 ppm으로 1.2 다 (질량 오류가 질량 분석기가 사용되는에 따라 달라집니다)의 조각 대량 관용의 펩티드 질량 농도의 오류를 입력합니다.
  3. MaxQuant 소프트웨어에서, 펩타이드 및 단백질 식별을위한 1 %의 거짓 발견 속도 (FDR)를 사용합니다. 단백질 식별은 유사한 펩티드 %의 단백질 서열에 따르면, 펩티드 서열의 개수와 함께 나열된다.

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결과

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인공 감각 상피의 가장 포괄적 인 프로테옴를 얻으려면 빠른 조직 절개 전에 단백질 추출 및 샘플 준비에 필요합니다. 두 프로테옴 기법, 산탄 및 상향식 프로테오믹스를 사용할 수있다. 도 1에 도시 된 바와 같이 샷건 프로테오믹스를위한 샘플을 준비하기 위해 FASP 분해 절차가 사용되었다. FASP 방법은 단백질의 농도, 세제의 제거, 여러 효소를 사용하여 단백질의 소화를 할 수 있습니다. 첫 번째는, 합동 18 분수에 SCX 칼럼에 분획 나노 LC-MS/MS 분석 하였다 트립신 두 번째 소화, 다음에 트립신 소화했다 사용되는 두 배의 소화 과정이 있었다. 본 실험 방법을 사용하여 단일 실행 LC-MS/MS를 수행 할 때 1,485 단백질의 총 1 % FDR로 확인되었다. 확인 된 단백질 중, 329 및 258 단백질 (그림 각각 미토콘드리아 플라즈마 막에 분류되었다2A). 두 번째 더블 소화 절차는 트립신 소화 다음의 lysC 소화으로 구성되었다. 각 다이제스트 개별...

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토론

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인공 감각 상피 세포에서 단백질 식별을 극대화하는 핵심 단계는 다음과 같습니다 소화 여러 endoproteinases의 1) 사용, 여러 분리 기술의 2) 사용 및 고해상도 질량 분석기의 3) 이용. 여러 효소의 적용은 펩티드의 수를 증가시키고, 단백질 서열 커버리지를 향상 따라서 인공 조직으로부터 확인 된 단백질의 수를 향상시킬 수있다. 트립신, 가장 일반적으로 사용되는 단백질 분해 효소는 MS의 이온화 및 분열에 좋은 펩타이드를 생성, 단백질을 효율적으로 특정 분열을 제공합니다. 그러나, 더 효율적 펩티드 절단을 제공 리신 잔기에서 절단하여도, lysC 내 등 종래 트립신 또 다른 효소를 사용. 그것은의 lysC / 트립신 소화로부터 생성 단백질의 서열 커버리지 트립신 / 트립신 다이제스트에서 단백질 서열 커버리지 단백질 서열 따르면 상대적 증가를 보여 주었다 관찰되었다.

"ove_content> 이전의 MS에 대한 다차원 분리의 구현은 샷건 프로테오믹스 접근 방식에 높은 인공 샘플의 복잡성...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 이익을 선언하지 않습니다.

감사의 글

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저자는 박사 켄트 실리,이 기능의 사용에 대한 사우스 플로리다 대학의 약 발견과 혁신을위한 센터 (CDDI) 프로테오믹스 핵심 시설의 이사 감사합니다. 이 작품은 BHAS에 NIH / NIDCD 보조금 R01 DC004295에 의해 지원되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
8% Tris-acetate 카트리지 단백질 발견42103
아세톤시그마-알드리치179124
아세토니트릴허니웰015-1L
AEBSFCalbiochem101500
암모늄 포름피셔 사이언티픽AC16861
아프로티닌Calbiochem616370
ASB-14 Calbiochem182750-5GM
소 혈청 알부민BioRad500-0112
C18 열 새로운 목표A2511275 μ m x 10cm 
DC 단백질 분석BioRad500-0116마이크로플레이트 분석 프로토콜
EDTASigma-AldrichE9884
Endoproteinase Lys-CSigma-AldrichP3428
FASP 단백질 소화 키트단백질 발견44250
포름산 Fluka94318
GELFrEE 분획 시스템단백질 디스커버42001GELFrEE 8100
류펩틴Calbiochem108975
MacroSpin 컬럼The Nest GroupSMM SS18V실리카 C18
MicrocystinCalbiochem475815
펩스타틴Sigma-AldrichP5318
Polysulfoethyl A 컬럼The Nest Group202SE0503
소듐 도데실 설페이트 (SDS)Sigma-AldrichL3771
Sonic Dismembrator Thermo Fisher15-338-53모델 100
트립신Sigma-AldrichT6567단백질체학 등급
리

참고문헌

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