라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

요약

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

초록

SGS는 특정 단백질의 구성 요소 또는 폴리 A +의 mRNA의 면역 염색에 의해 세포를 시각화 할 수 있습니다. SGS는 매우 동적이며 자신의 조립과 운명의 연구는 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 중요합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)과 같은 SG를 주요 요인의 결핍 생쥐와 중추 신경계의 변화에​​ 발달 결함이 발생합니다. 유기체, 1 캔 문화의 기본 세포에서 세포의 SG를의 역학을 연구하고 SG를의 형질 태그 구성 요소의 지역화를 수행합니다. 우리는 마우스 배아 섬유 아 세포의 G3BP1 함유 SG를 (MEFs)을 관찰하기 위해 시간 경과 실험을 설명합니다. 이 기술은 또한 최근 이러한 SG를가 알츠하이머 병 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 형성되어 도시되었을 결정적이다 라이브 뉴런 G3BP 함유 SG를 연구하는 데 이용 될 수있다. 이 방법은 임의의 다른 셀룰러 바디 및 과립 단백질 성분에 적응하고, 수행 될 수있다형질 전환 동물,이 과립의 특정 인자의 부재하에, 예를 들면 과립 역학 라이브 연구를 허용한다.

서론

스트레스 과립 (SGS는) 같은 높은 온도, 산화 스트레스, 저산소증, 삼투압 충격, 자외선 조사, 포도당 박탈, 또는 바이러스 감염 ^1과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 보호 반응으로 형성된 비 막 세포질 초점입니다. 이들은 산화 스트레스를 유발 나트륨 아비 산염과 같은 화합물로 처리함으로써 화학적으로 유도 될 수있다. SG를 실속 번역 체포 메신저 리보 (mRNPs)를 축적하면 번역 기계에서의 mRNA를 금속 이온 봉쇄, ² 단지, 자신의 어셈블리 eIF2α의 인산화 (진핵 개시 인자 2 α)에 의해 트리거 될 수 있습니다. SGS는 P-시체 같은 polysom​​es 및 다른 과립과 구성 요소를 교환 동적 구조입니다. 그들은의 mRNA가 정렬하고 안정적인 비 polysomal의 mRNPs ^3로 번역, 재개시, 저하 또는 포장 중 하나에 대해 처리하는 "우선 순위 구분 센터"를 구성. SG를 조립 빠른 B입니다유타는 큰 과립으로 뭉쳤다 초기 다수의 작은 골재와 점진적 과정이다. 미세 소관을 중단 시키거나 안정화 화학적 억제제의 사용은 미세 소관 네트워크가 조립 합체 및 분해 공정 등 SG 역학 필요하다는 것을 보여준다.

SG를의 동적 어셈블리는 TIA-1 (T-세포 내부 항원-....

프로토콜

이 프로토콜의 모든 동물의 절차 11 월 24 일 1986 (86-609/EEC)의 유럽 공동체위원회 지침의 가이드 라인을 엄격하게 준수하고 있습니다. 물과식이 허용 그룹의 집은 마우스,. 12 시간 빛 : 어두운주기 (오전 7:00에 빛) 12 시간과 통제 된 환경 (22 ± 1 °의 C, 55 ± 5 %의 습도)에서 그들을 유지합니다.

1 쥐과 차 전지의 문화 :. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)

1. 얇은 집게뿐만 아니라 곡선 포셉 및 해부 가위를 압력솥. 멸균 용기에 보관합니다. 멸균 D-PBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용합니다. 완전한 MEFs 매체를 준비 : 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM의 피루브산 나트륨, 1 % 비 필수 아미노산, 및 0.5 mM의 2 - 머 캅토 에탄올이 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / F12 37 ° C에서 따뜻한
2. 13.5 일 후 교미 (DPC에서 임신 한 마우스 (안락사)) 자궁 전위에 의해. 90 % EtOH로 소독 한 마우스에서 자궁 뿔을 제거합니다. 살균하고 깨끗한 후드에서 37 ° C에서 배아와 뿔을 배치는 D-PBS를 데워진. 뿔, 장소를 엽니 다 10....

결과

스트레스 과립 형성 스트레스 아폽토시스 방지 연결된 클리어 할 때까지, 스톨 번역문 셀룰러 적응을 허용, 스트레스에 셀의 반응에서 중요하다. 이 분석은 허가 키의 SGS 단백질 구성 요소의 현지화 (그림 1)에 따라, 일차 전지에있는 SG를 공부합니다. G3BP, SGS 어셈블리의 핵심 요소는, 배양 MEFs 또는 뉴런 (그림 2A의 A와 C)의 세포질에 오히려으로 확산 존재하고, 명확하게 MEFs에서 아비 산염의 치료뿐만 아니라 신경 세포 (그림 2A의 B에서 분리 된 과립에 존재하고있다 D). 일차 전지는, 예를 들면 자신의 구성 요소 중 하나의 부재에 응력 과립의 연구를 허용하는 형질 전환 마우스 모델에서 얻을 수있다. 흥미롭게도, 마우스에 G3BP1의 결핍, 중추 신경계의 심각한 결함에 특히 ataxic P 리드과 공간 작업 기억의 변경 (사지 물림쇠 테스트,도 2b에서와

토론

프로토콜 우려 형질 조심스럽게 세포 독성을 낮추기 위해 모니터링 할 필요가 더 많은, 특히 시간 경과 인수에서 가장 중요한 단계.

일차 세포의 배양 한 멸균 조건이 유지되고,주의가 절개 및 세포 분리 단계 동안의 손상을 방지하기 위해 수행되는 한, 어려운 부분이 아니다. MEFs 초기 구절에서 냉동 보관하실 수 있습니다. 칼슘과 함께 신경 세포의 형질이 잘 ²¹ 일을 표시 한이 프로토콜은 외 시아에서 적응. ^(20)가 형질 전환의 좋은 수준을 가능하게, 그러나 그것은 특정 세포 죽음을 유도 할 수있다. 이 용액의 pH를 확인하고 1 시간을 넘지 않아야 인산 칼슘 침전물 플라스미드와 뉴런의 인큐베이션을 모니터링하는, 배양 다음 몇 일 사이 뉴런 형질하는 것이 중요하다. 광학 현미경으로 확인하고 트란 제거sfection 매체 집계가 관찰되는 경우. DMEM으로 세척의 수는 증가 될 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12	Gibco	21331	37°C에서 예열; C
나트륨 피루브산	Gibco	11360
비필수 아미노산	Gibco	11140
L-글루타민	Gibco	25030
트립신	Gibco	15096
유리 바닥 B-35	Greiner	627860/627861	처리 여부(처리: 부착 세포의 부착 증가)
폴리-L-라이신	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	37°C에서 예열; C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	37°C에서 예열; C
2-메르캅토에탄올	Gibco	31350
펜치	Biotek	DU-110-A	매우 얇음, 팁 0.1 mm (수막 제거에 유용)
곡선형 펜치	Biotek	P-110-BUF	매우 얇음, 팁 0.1 mm
작은 가위	Biotek	CM-85-BS	제거하는 데 유용할 수 있습니다
	Ozyme	101-10	MEFs 트랜스펙션, 순방향 프로토콜 따르
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