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방법 논문

라이브 일차 전지에 G3BP 스트레스 과립 역학의 시각화

18K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51197

⸱

2014년 5월 21일

 , 
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535

이 논문에서

요약

스트레스 과립 (SGS는) 실속 리보 입자 (RNP들), 각종 스트레스에 대한 세포 반응에 중요한 포함하는 세포질 RNA 과립이다. SG를 역학 스트레스 후 형질 일차 전지에있는 SG를의 태그 구성 요소의 현지화를 시각화하여 살아있는 세포에 따라 할 수있다.

초록

SGS는 특정 단백질의 구성 요소 또는 폴리 A +의 mRNA의 면역 염색에 의해 세포를 시각화 할 수 있습니다. SGS는 매우 동적이며 자신의 조립과 운명의 연구는 스트레스에 대한 세포 반응을 이해하는 것이 중요합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)과 같은 SG를 주요 요인의 결핍 생쥐와 중추 신경계의 변화에​​ 발달 결함이 발생합니다. 유기체, 1 캔 문화의 기본 세포에서 세포의 SG를의 역학을 연구하고 SG를의 형질 태그 구성 요소의 지역화를 수행합니다. 우리는 마우스 배아 섬유 아 세포의 G3BP1 함유 SG를 (MEFs)을 관찰하기 위해 시간 경과 실험을 설명합니다. 이 기술은 또한 최근 이러한 SG를가 알츠하이머 병 같은 신경 퇴행성 질환의 발병에 형성되어 도시되었을 결정적이다 라이브 뉴런 G3BP 함유 SG를 연구하는 데 이용 될 수있다. 이 방법은 임의의 다른 셀룰러 바디 및 과립 단백질 성분에 적응하고, 수행 될 수있다형질 전환 동물,이 과립의 특정 인자의 부재하에, 예를 들면 과립 역학 라이브 연구를 허용한다.

서론

스트레스 과립 (SGS는) 같은 높은 온도, 산화 스트레스, 저산소증, 삼투압 충격, 자외선 조사, 포도당 박탈, 또는 바이러스 감염 1과 같은 환경 스트레스에 대한 세포 보호 반응으로 형성된 비 막 세포질 초점입니다. 이들은 산화 스트레스를 유발 나트륨 아비 산염과 같은 화합물로 처리함으로써 화학적으로 유도 될 수있다. SG를 실속 번역 체포 메신저 리보 (mRNPs)를 축적하면 번역 기계에서의 mRNA를 금속 이온 봉쇄, 2 단지, 자신의 어셈블리 eIF2α의 인산화 (진핵 개시 인자 2 α)에 의해 트리거 될 수 있습니다. SGS는 P-시체 같은 polysom​​es 및 다른 과립과 구성 요소를 교환 동적 구조입니다. 그들은의 mRNA가 정렬하고 안정적인 비 polysomal의 mRNPs 3로 번역, 재개시, 저하 또는 포장 중 하나에 대해 처리하는 "우선 순위 구분 센터"를 구성. SG를 조립 빠른 B입니다유타는 큰 과립으로 뭉쳤다 초기 다수의 작은 골재와 점진적 과정이다. 미세 소관을 중단 시키거나 안정화 화학적 억제제의 사용은 미세 소관 네트워크가 조립 합체 및 분해 공정 등 SG 역학 필요하다는 것을 보여준다.

SG를의 동적 어셈블리는 TIA-1 (T-세포 내부 항원-1)과 같은 특정 RNA 결합 단백질 (RNA-BP)의 집계에 의해 추진됩니다 TIAR 이량 할 수 있습니다 (TIA-1 관련 단백질), SGS 및 4에 polysome 분해의 mRNA의 경로를 촉진합니다. G3BP (RasGAP SH3 도메인 결합 단백질)의 세포가 아비 산염 또는 고온 강조하고, 탈 인산화 G3BP의 과발현이 SG를 어셈블리 (5)를 유도 할 수있을 때 SG를에 지역화와 같은 RNA-BP입니다.

G3BP는 처음 RasGAP P (라스 - GTPase의 활성화 단백질과의 상호 작용을 특징으로 한 진화 적으로 보존 된 RNA-BP입니다(120) 6); 그러나 이러한 상호 작용은 최근 7을 재 방문했다. G3BP 제품군은 두 개의 포유류의 회원, G3BP1 (G3BP이라 함)과 G3BP2 8이 포함되어 있습니다. 세포가 스트레스를 9을 실시 할 때 두 단백질은, SGS에 colocalize. 정식 RNA 인식 모티프 (RRM)를 보존 RNP1 및 RNP2 모티브 : G3BPs는 N-말단 NTF2 도메인 프롤린 리치 (PxxP) 모티프 다음에 자신​​의 현지화 및 올리고머를, 영향을 제안 구성, 다음 C-말단 모티브는 RNA 바인딩과 관련된 , 아르기닌 - 글리신 리치 (RGG) 상자 하였다. 흥미롭게도, EGFP 융합 다른 도메인을 구성하여 단백질의 상이한 부분을 분석 한 NTF2 같은 도메인 및 RNA-결합 도메인이 가장 효율적 이량의 특성의 중요성을 제안하는, SGS 모집 및 RNA는 바인딩 것으로 나타났다 SG를 조립. 다양한 모델은 체외 10-13에서 G3BP 단백질의 다른 기능을 공개했다.생쥐 G3BP가 중단 발달 성장과 생존 14,뿐만 아니라 공간 작업 기억 (15)에 운동 장애와 결함을 특징으로 중추 신경계 (CNS)에 G3BP의 중요한 역할이 단백질의 중요성을 보여 주었다. G3BP 결핍은 SG 형성 및 신경 퇴행성 질환 (15) 사이의 직접 링크를 설정, 변경된 신경 가소성과 칼슘 항상성에 이르게한다. 이 신경 세포와 같은 일차 전지에있는 SG를의 역학을 연구 할 수있는 것이 중요하다.

이 프로토콜은 아비 산염 처리에서 일차 전지에 G3BP1 함유 SG를 조립을 관찰 할 수있는 간단한 방법을 제공합니다. 그것은 스트레스의 예를 다른 종류의 서로 다른 조건에서 SG를 조립을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 또한 SG를 다른 과립 또는 다른 성분으로 구성 될 수있다. 사실,이 프로토콜은 G3BP1에 초점을 맞추고 있지만, TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2와 같은 다른 스트레스 과립 마커가있다FMRP (허약 한 X 정신 지체 증후군 단백질) 16, TDP-43 (transactive 응답 DNA 결합 단백질 43) (17) 또는 슈타우펜 18. 특히, TIA-1 / R과 같은 단백질이 과발현되면 다른 SG를 형성 기능, 규제와 관련된 성적에 차이가있다하더라도, SGS 어셈블리를 유도 할 수 RNA 결합 단백질을 핵, G3BP 같은입니다. SG를 이러한 핵심 구성 요소의 일부 또는 nucleators의 형광 - 태그 버전의 형질 이미지 특정 SG를 조립 및 역학을 수행 할 수 있습니다.

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프로토콜

이 프로토콜의 모든 동물의 절차 11 월 24 일 1986 (86-609/EEC)의 유럽 공동체위원회 지침의 가이드 라인을 엄격하게 준수하고 있습니다. 물과식이 허용 그룹의 집은 마우스,. 12 시간 빛 : 어두운주기 (오전 7:00에 빛) 12 시간과 통제 된 환경 (22 ± 1 °의 C, 55 ± 5 %의 습도)에서 그들을 유지합니다.

1 쥐과 차 전지의 문화 :. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)

  1. 얇은 집게뿐만 아니라 곡선 포셉 및 해부 가위를 압력솥. 멸균 용기에 보관합니다. 멸균 D-PBS (둘 베코 인산염 완충 식염수)를 사용합니다. 완전한 MEFs 매체를 준비 : 10 % 소 태아 혈청 (FBS), 1 ㎜의 L-글루타민, 1 mM의 피루브산 나트륨, 1 % 비 필수 아미노산, 및 0.5 mM의 2 - 머 캅토 에탄올이 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM) / F12 37 ° C에서 따뜻한
  2. 13.5 일 후 교미 (DPC에서 임신 한 마우스 (안락사)) 자궁 전위에 의해. 90 % EtOH로 소독 한 마우스에서 자궁 뿔을 제거합니다. 살균하고 깨끗한 후드에서 37 ° C에서 배아와 뿔을 배치는 D-PBS를 데워진. 뿔, 장소를 엽니 다 100mm 멸균 플라스틱 페트리 접시에있는 태아는 탯줄 자료에서 그들을 청소하고 혈액의 과잉을 제거하는 따뜻한 D-PBS로 세척. 양안에서 태아의 사지, 내장을 제거하고 뇌를 포함하는 헤드의 상부.
  3. 새로운 배양 접시에서 말하다 무균 수술에 아주 작은 조각으로 배아 잎 가위 (최소 1 분). 다른 유전자형의 배아의 경우, 각각의 페트리 접시에 각각의 배아를 넣어 유전자형의 꼬리 또는 위쪽 머리를 유지하기 위해주의해야합니다.
  4. 1X 트립신-EDTA (0.25 % 트립신, 1 ㎜ EDTA)와 배아를 커버. 30 분 37 ° C의 배양기에서 1 시간 동안 품어. 전체의 10 ML을 추가트립신 반응을 정지 MEFs 매체. 피펫은 위아래 모두 집계를 제거합니다. 10 분 (완전 배지로 가득) 50 ㎖ 튜브에 세포 현탁액을 앉아 보자, 상온에서 300 XG에서 5 분 동안 뜨는을 원심 분리기. 완전 배지 (1 배아 6 ml)에 펠렛을 Resuspend. 가능한 유핵 세포는 트리 판을 사용하여 계산 될 수있다 푸른 (약 5 × 106 세포는 한 배아로부터 예상 될 수있다.) 60mm 페트리 접시 당 플레이트 3 ㎖.
  5. 다음날 매체를 변경하고 세포가 성장하도록 허용 요리는 컨 플루 언트 될 때까지. 많은 세포 유형은 알 수있다, 하지만 섬유 아 세포는 계대 배양을 살아남을 것입니다.
  6. 세포를 분리하고이 형질에 대한 50~70% 자랄 때까지, 유리 바닥 (시간 경과 실험에 대한 중요한)와 35mm 요리에서 성장 할 수 있습니다. 마이코 플라즈마와 마우스 병원균에 대한 검사.

2. 문화뉴런의 경우 daptations

  1. 문화 전날, 폴리-L-라이신 살균 청소 후드 (0.1 ㎎ / ㎖의 200 μL)과 함께 코트 35mm 유리 바닥 배양 접시 하룻밤 둡니다.
  2. 다음날 아침에 두 번 45 분에서 1 시간에 한번씩 5 분, 대한​​ 멸균 순수한 물로 씻어. 2 DMEM의 ML 플러스 10 % FBS 배지로 교체하고 37 ° C 배양기에서 유지.
  3. 18.5 DPC에서 배아를 해부하다. 살균하고 깨끗한 후드, 100mm 페트리 접시에 차가운 무균 HBSS (행크의 균형 소금 솔루션)에 배아와 뿔을 배치합니다. 신생아 새끼 또한 댐의 수명을 유지하고, 특히 얻기 어려울 수 형질 전환 동물의 경우에, 더 많은 자손을 생성 할 수있게하기 위해 배아 대신 사용될 수있다. 각각의 배양 접시에서 각 태아 또는 신생아을하고 가위로 머리를 잘라. 눈에 곡선 집게를 삽입하여 머리를 잡아 피부를 잘라 조심스럽게 뒷면에서 부드러운 두개골을 열헤드의 눈​​까지, 헤드의 각 측면에. 시신경과 뇌 줄기를 잘라, 뇌를 제거하고 HBSS를 포함하는 새로운 배양 접시에 넣어. 입체경에서 두 개의 얇은 집게를 사용하여 모든 수막을 제거합니다. 해마, 대뇌 피질 또는 연구하는 구조에 따라 두뇌의 다른 부분을 분리합니다.
  4. 차가운 HBSS 4.5 ㎖에 해부 뇌 구조를 담가 15 ML 튜브에 미리 준비하고 트립신 소화 될 때까지 얼음 계속. 2.5 % 트립신 0.5 mL를 넣고 20 분까지 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 소화 뇌 부분을 폐기 할 수 없음을 매우주의하고, HBSS와 트립신의 3 배를 씻어.
  5. 이 때까지 1 ㎖ 팁을 탑재 한 1 ㎖ 마이크로 피펫 1 ㎖ (피질) DMEM 플러스 10 % FBS 최대 피펫 아래로 여러 번에 500 μL (해마)에 재현 탁, 그 후에, 1 ㎖ 플러스 200 μL 팁 장착 눈에 띄는 집계하지 않습니다.
  6. 각 35mm 유리 BOTTO에 세포 현탁액 100 ~ 200 μl를 배포DMEM 플러스 10 % FBS를 포함하고 신경이 적어도 3 시간 동안 37 ° C에서 밀착시켜 m 접시. 데워진 신경 완전 배지로 교체 (Neurobasal 매체, 250 μM의 L-글루타민과 NS21 보충 첸 등. 19에 기술 된 바와 같이 제조) 및 신경 세포의 성장을 할 수 있도록 37 ° C에 둡니다. (DIV) (형질 전환 효율이 DIV하지만 시냅스 연결의 몇 가지 더 나은 7-10 사업부에서 설립 된 후에 높은) 체외에서 5~14일에서 신경 세포를 형질.

EGFP-G3BP1 구문의 3. 형질

35mm 접시 당 정제 된 플라스미드의 3 μg을 사용하여, 형광 마커 (등 GFP, YFP) 융합 관심의 단백질의 cDNA를 (SG를의 구성 요소)를 포함하는 벡터로 세포를 형질.

  1. 제조자의 프로토콜 (자재 / 시약의 표 참조) 다음, 시판의 방법을 사용 MEFs를 형질.
  2. 칼슘과 함께 신경 세포를 형질. 시아 등 20 간단히에서 적응 인산 방법 :
    1. 솔루션을 준비 : DMEM 세척 : 25 밀리미터의 KCl을 포함하는 DMEM; 형질 솔루션 : 1X DMKY (HEPES 5 mm의 MgCl2를 10 mM의 페놀 레드)를 포함하는 DMEM 세척; 충격 솔루션 : HEBS 1X, 1X DMKY 및 DMSO 2 % (V / V) 37 ℃에서 보관하십시오
    2. 뉴런, 여과 액에서 용지를 제거하고, 37 ℃에서 보관 DMEM 세척으로 세척 한 후 형질 배지로 교체하고 인산 칼슘 플라스미드 DNA 침전물의 준비 기간 동안 37 ° C로 유지한다.
    3. 1.5 ML의 microcentrifuge 관에서, (이 순서대로) 브라운 물 (최종 부피 50 μL), 염화칼슘 2.5 M의 5 μL, 플라스미드 DNA의 3 μg을 추가합니다. 이미 둥근 바닥 폴리 프로필렌 튜브에 도입 HEBS 2 배의 50 μL에이 조합을 삭제합니다. 낙하와 함께 회전에 의해 튜브를 섞는다. 30 분 동안 실온에서 침전물 형태하자.
    4. precipitat 추가전자 뉴런에 적가하고 30 ~ 50 분 동안 37 ° C에서 둡니다.
    5. 1 분 동안 충격 솔루션으로 교체 한 후 DMEM 세척과 헹굼 마지막으로 미리 조정 매체를 재 도입. 37 ° C에서 세포를 유지

SG를 조립 및 역학을 포함하는 G3BP 4. 시각화

  1. 페놀 레드없는 매체에 의해 페놀 레드를 포함하는 세포의 매체를 교체합니다.
  2. 인수에 대한 형광을 갖춘 공 ​​초점 현미경을 사용합니다. 현미경 시스템을 켜십시오 : 수은 램프, 컴퓨터 및 레이저. 20 분 이상 인수를 시작하기 전에 37 ° C에 실을 따뜻하게.
  3. G3BP의 이상 발현은 SG를 유형의 자연 형성을 유도한다. 세포는 따라서 스트레스 유도없이 형질 전환 후 SG를 24 시간 오른쪽의 조립 관찰 할 수있다. 대안 적으로, 응력은 상기 SG를 조립을 유도하도록 유도 될 수있다. 0.5 ㎜의 아비산 나트륨과 별 추가오른쪽 화합물 (과립 확실히 1 시간 내에 형성 될 것이다)의 첨가 후 획득 t.
  4. 침지 목적에 기름을 추가 (40X 또는 63X 목표를 사용) 및 적응 35mm 현미경 홀더의 목적에 페트리 접시를 설치, 무대 홀더에 안정. 요리의 인수가 변경 될 것입니다 그렇지 않으면 평평한 지 확인합니다. 관련 형광 물질에 따라 형광 빛을 켜고 형질 전환 세포를 시각화. 그 세포는 표백 및 세포 독성을 최소화하기 위해 필드에 한 번 형광을 끕니다.
  5. "취득 탭"에서 태그 형광 (EGFP-태그 G3BP를 사용하여 우리의 프로토콜에있는 488 나노 미터)의 여기 파장에 따라 레이저를 선택하고 PMT에 대한 적응 방출 길이 (광전자 증 배관)을 선택합니다. 잡음 및 과포화뿐만 아니라 독성을 최소화하기 위해 레이저 파워 (통상 10 % 이상)을 조정하고, 이득을 설정하고 신호 대 잡음비를 수정 오프셋.레이저 박람회 기간 (라인 평균 2, 프레임 평균 1)을 최소화하기 위해 (1,000 Hz에서) 빠른 스캔합니다. 원하는 경우, Z 스택에 대한 매개 변수가 3D에서 이미지를 (1 ㎛의 Z 단계는 세포와 일반적으로 괜찮습니다) 재구성 할 수 있도록 설정. 각 인수 사이의 시간 간격을 결정 : 작은 간격은보다 일관된 영화를 얻을 수 있도록하지만이 광표백 및 독성 (20 초 간격이 기술 실험에 사용 된)를 유도 할 수 있습니다. 총 취득 기간은 스트레스의 유형에 따라 다를 수 있습니다. 많은 G3BP 함유 SG를이 아비 산염 처리에서 매우 빠르게 형성과 치료의 1 시간 후 잘 볼 수 있습니다됩니다 :이 경우에, 15의 인수의 총 지속 시간, 바로 스트레스 후 인수 필름 및 시작 빠르게 셀을 선택합니다 - 20 분 여러 SG를 조립을 준수 크게 충분.
  6. 사진을 저장하고 ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 스택과 영화를 재구성.

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결과

스트레스 과립 형성 스트레스 아폽토시스 방지 연결된 클리어 할 때까지, 스톨 번역문 셀룰러 적응을 허용, 스트레스에 셀의 반응에서 중요하다. 이 분석은 허가 키의 SGS 단백질 구성 요소의 현지화 (그림 1)에 따라, 일차 전지에있는 SG를 공부합니다. G3BP, SGS 어셈블리의 핵심 요소는, 배양 MEFs 또는 뉴런 (그림 2A의 A와 C)의 세포질에 오히려으로 확산 존재하고, 명확하게 MEFs에서 아비 산염의 치료뿐만 아니라 신경 세포 (그림 2A의 B에서 분리 된 과립에 존재하고있다 D). 일차 전지는, 예를 들면 자신의 구성 요소 중 하나의 부재에 응력 과립의 연구를 허용하는 형질 전환 마우스 모델에서 얻을 수있다. 흥미롭게도, 마우스에 G3BP1의 결핍, 중추 신경계의 심각한 결함에 특히 ataxic P 리드과 공간 작업 기억의 변경 (사지 물림쇠 테스트,도 2b에서와

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토론

프로토콜 우려 형질 조심스럽게 세포 독성을 낮추기 위해 모니터링 할 필요가 더 많은, 특히 시간 경과 인수에서 가장 중요한 단계.

일차 세포의 배양 한 멸균 조건이 유지되고,주의가 절개 및 세포 분리 단계 동안의 손상을 방지하기 위해 수행되는 한, 어려운 부분이 아니다. MEFs 초기 구절에서 냉동 보관하실 수 있습니다. 칼슘과 함께 신경 세포의 형질이 잘 21 일을 표시 한이 프로토콜은 외 시아에서 적응. (20)가 형질 전환의 좋은 수준을 가능하게, 그러나 그것은 특정 세포 죽음을 유도 할 수있다. 이 용액의 pH를 확인하고 1 시간을 넘지 않아야 인산 칼슘 침전물 플라스미드와 뉴런의 인큐베이션을 모니터링하는, 배양 다음 몇 일 사이 뉴런 형질하는 것이 중요하다. 광학 현미경으로 확인하고 트란 제거sfection 매체 집계가 관찰되는 경우. DMEM으로 세척의 수는 증가 될 수있다.

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

저자는 인수가 수행 된 몽펠리에 리오 영상 (MRI) 플랫폼을 인정하고 싶습니다. 그들은 프로토콜의 다른 부분에서의 도움을 이사벨 로페즈 크리스티나 메 지아, 알렉산드라 메츠, 이리나 Lassot, SOLANGE Desagher, 파비앙 Loust​​alot 및 버지니 Georget 감사합니다. 이 작품은 라 공들인 Médicale (FRM) (퀴프 FRM 2011-N ° DEQ20111223745는) 매그가 부어 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEM/F12Gibco2133137°C에서 예열; C
나트륨 피루브산Gibco11360
비필수 아미노산Gibco11140
L-글루타민Gibco25030
트립신Gibco15096
유리 바닥 B-35Greiner627860/627861처리 여부(처리: 부착 세포의 부착 증가)
폴리-L-라이신Sigma-AldrichP2636
DMEMGibco3196637°C에서 예열; C
HeBSSigma-Aldrich51558
NeurobasalGibco2110337°C에서 예열; C
2-메르캅토에탄올Gibco31350
펜치BiotekDU-110-A매우 얇음, 팁 0.1 mm (수막 제거에 유용)
곡선형 펜치BiotekP-110-BUF매우 얇음, 팁 0.1 mm
작은 가위BiotekCM-85-BS제거하는 데 유용할 수 있습니다
 Ozyme101-10MEFs 트랜스펙션, 순방향 프로토콜 따르
기 도립 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경LeicaSP5
해마 Polyplus transfection JetPEI 시약을

참고문헌

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  21. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
  22. Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
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