최적화 및 활용 아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산는 담배

요약

아그로 박테리아는 (담배 모자이크 바이러스 계는) 백신 항원과 치료 단백질을 생산하기 위해 신속하고 경제적 인 방식 발사 벡터를 들고있는 진공 침투에 근거 된 담배 식물에서 과도 단백질 생산. 우리는 절차를 간소화하고, 세균의 배양 조건을 최적화 호스트 종을 선택하고 RNA 침묵 억제를 공동 도입하여 대상 축적을 개선.

초록

식물체에서 아그로 박테 리움 - 매개 변이 단백질 생산을 단시간 내에 백신 항원 및 치료 용 단백질을 생산하는 유망한 접근법이다. 그러나,이 기술은 이제 막 극복되고 수직 확장 대규모 생산 많은 기술적 장애물에 적용되기 시작한다. 여기, 우리는 아그로 박테리아가 시작 벡터를 들고와는 담배 식물의 진공 침투를 기반으로 산업 규모의 과도 단백질 생산을위한 간단하고 재현성있는 방법을 보여줍니다. AB 매체에있는 아그로 박테 리움 재배의 최적화는 침투 과정을 단순화, 밀리 Q 물에있는 세균의 문화를 직접 희석을 할 수 있습니다. 는 담배, N.의 세 가지 시험 종 중 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana는) 때문에 침투의 용이성에 가장 유망한 호스트로 선정되었다, 고 기자 단백질 생산 수준, 약 2-F통제 된 환경 조건에서 오래된 높은 바이오 매스 생산. 아그로 같은 아세토 시린 곤 및 단당류로서 화학 약품을 사용 pBID4-GFP (담배 모자이크 바이러스 계)를 은닉의 유도는 단백질 생산 수준에 영향을 미치지 않았다. 30 일 또는 60 초 동안 50 ~ 100 밀리바에서 침투 식물은 식물 잎 조직의 약 95 % 침투의 결과. 아그로 박테 리움 실험실 변형 GV3101와 침투는 아그로 박테리아 실험실 변종 LBA4404 및 C58C1 및 야생 형 아그로 박테리아가 at77와 A4, AT10, AT6를 균주에 비해 가장 높은 단백질 생산을 보여 주었다. N.에서 바이러스 성 RNA 침묵 억제, P23 또는 P19, 공동 식 benthamiana는 표적 단백질 (인플루엔자 바이러스의 헤 마글 루티 닌) 이전 축적과 생산 증가 (15~25%)였다.

서론

식물은 이제 이종 재조합 바이오 의약품 및 산업용 단백질 ^{1-3의 제조,} 안전 신뢰성, 확장 성 및 저렴한 플랫폼으로 인식하고 미생물 및 동물 세포 발현 시스템 ^4에 중요한 장점을 가지고있다. 식물은 조립 된 다중 체 항체 ^5-7 등의 번역 후 변형, 제대로 접힌 단백질을 표현 할 수 있습니다. 여러 식물 유래 재조합 의약품 단백질은 임상 평가 ^8을 겪고있다. 이러한 비호 지킨 림프종 ^9, 헤 마글 루티 닌 기반 유행성 계절 독감 백신 후보는 ^{10, 11} (커밍스 등., 백신에 제출), 안티 - 연쇄상 구균의 표면 항원 I의 치료를위한 환자 특정 재조합 이디 백신 (scFv를)를 포함 / 치아 우식증 ^(12)의 치료, 당뇨병 ^(13)의 치료를위한 인간의 인슐린 II 항체. 또한, 인간의 RECO고셔병 환자에서 효소 대체 요법에 대한 mbinant glucocerebrosidase 이스라엘과 미국에서 승인 된 제품으로, 미국 ^{(14, 15)의} 외부로 확장 된 액세스 프로그램에 따라 제공된다.

이종 단백질을 안정적으로 변형 (유전자 변형 또는 Plastid 형질 전환) 또는 일시적으로 형질 전환 식물에서 생산 될 수있다. 과도 단백질 생산은 식 ⁽¹⁶⁾ 및 ^축적을 달성하기 위해 짧은 시간 포함한 형질 전환 식물에서의 생산에 비해 여러 가지 장점을 제공하고, 식물 조직 ^{(4) 내에} 세균 이진 벡터 또는 재조합 식물 바이러스 벡터를 도입함으로써 달성 될 수있다. 가장 진보 된 일시적인 발현 시스템은 식물 바이러스 및 이진 플라스미드의 성분을 배합하고, agroinfiltration ^17,18 의해 전달되는 '발사 벡터'의 사용에 기초한다. 담배 모자이크 바이러스 (TMV)에 기초하여 발사 벡터의 Agroinfiltration 성공적 실험실에서 적용된이러한 인간 유두종 바이러스 ^19, 예 르시 니아 페스티 ²⁰ 병원균에 대한 백신의 항원을 생산하기 위해 확장, 인플루엔자는 ^{21, 22,} 탄저균 ²³ 바이러스 및 N.에 천연두 바이러스 ⁽²⁴⁾ benthamiana 잎. 아그로 박테 리움 매개 일시적 발현은 여러 단백질 ^2,25-27의 동시 생산을위한 유망한 방법이다. 예를 들어, 식물, 일시적인 발현 시스템은 종양 특정 재조합 항체 ^28,29, 표피 성장 인자 수용체 ^(30)에 대하여 당화 재조합 항체 및 탄저균 방어 항원에 특이 ^31,32 모노클로 날 항체를 생산하는 데 사용되었다. 표적 유전자 및 향상된 표적 단백질의 발현 ^{33, 34의} 유전자 침묵 결과의 회로 부착 된 담배의 benthamiana 공장의 공동 침투.

Agroinfiltration 균일 introdu을위한 일반적인 방법입니다식물에 관심의 유전자를 숨겨의 cing 박테리아는 ^35-37를 조직. 그대로 공장에서 일시적인 유전자 발현에 나뭇잎 아그로 박테 리움의 진공 침투 형질 전환 식물 ^{38 ~ 41을} 생성 할 필요없이 외래 단백질의 생산을위한 신속한 확장 성, 유용한 방법입니다. 진공 agroinfiltration 동안, 식물이 거꾸로 뒤집 및 공중 부분은 아그로 박테 리움 현탁액에 잠긴. 그런 다음 진공 가스가 기공을 통해 잎의 세포 간 공간에서 철수하는 원인이 적용됩니다. 잎에 아그로 박테 리움 현탁액의 주입에 진공 결과의 신속한 재 가압 다음 릴리스. 아그로 박테리아의 진공 침투에 따라, 식물은 더 이상 재배 및 목표 표현이 모니터링됩니다. 표적 발현의 가장 높은 수준은 전형적으로 2-3 일 이후 발현 수준은 일반적 decrea 발사 벡터와 이진 벡터 및 4-7 dpi로, 함께 침투 (DPI)을 남기 관찰SES ^17,18,42-45. 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스는 단백질 생산을위한 식물에 관심 유전자를 전달하기위한 가장 널리 사용되는 수단이다. Agroinfiltration는 N.에 매우 잘 작동합니다 benthamiana하지만 상대적으로 저조한 애기 장대 ^(46)를 포함하여 대부분의 다른 식물에서.

본 연구에서는 5 ~ 6 주 된 N.에 과도 단백질 생산을위한 간단하고 효율적이며 경제적 인 방법을 개발 benthamiana는 A.를 사용하여 침투를 투메 파시 엔스. agroinfiltration 기술의 산업 스케일링의 주요 단점은 '수확 박테리아 및 4'-히드 록시-3을 함유하는 배지에서 세균 펠릿 재 부유 원심 분리하고, 5'-디메 (아세토 시린 곤), 단당류, 및 2 - (N-모르 폴리 노) - 에탄 설 폰산 (MES) 비르 유전자의 유도를위한 버퍼. 우리는 아그로 박테 리움을 최적화함으로써 이러한 문제를 극복 할 수 있었다 AB 매체 (최소 배지)의 성장은 직접 밀리 Q 물과 침투 기간 및 조건을 제어하여 희석 하였다. 우리는 또한 야생형 담배 숙주 종 N.에서 목적 단백질의 생산을 비교 한 benthamiana와 N. 입시뿐만 아니라 하이브리드 N.에 excelsiana.

프로토콜

1. 식물 성장

이후 agroinfiltration 위해 우리는 두 개의 야생형 된 담배 종 실내 시설에서 암면에 수경 재배 (N.의 benthamiana와 N. 입시) 및 하이브리드 (N.의 excelsiana)을 평가 하였다.

1. 식물 비료 용액에 암면 슬라브를 적시십시오.
2. 야생 형 N.의 씨앗을 뿌리다 benthamiana, N. 입시 및 N. 영양소에 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana의 하이브리드) 암면의 표면을 적신.
3. 에 대한 통제 된 조건 (24 ° C 및 40~65% 상대 습도)에서 씨앗에서 식물과 (130 ~ 150 μE 미터의 조명과 14 시간의 빛과 10 시간의 어둠, ^-2 초 ^-1) 긴 일 광주를 성장 N.에 대한 4~5주 benthamiana와 N. excelsiana 및 N.에 대한 5-6주 엑셀.

Agroinfiltrat에 대한 벡터의 2. 건설이온

1. 인플루엔자 바이러스 (HAC1)의 A/California/04/2009 변형에서 합성 리포터 유전자 (녹색 형광 단백질 [GFP), 전체 길이의 헤 마글 루티 닌 (HA)를 삽입하고, 재 설계 lichenase 효소 (LicKM) ¹⁸ 개별적으로 발사 벡터 pBID4-GFP, pBID4-HAC1 각각 pBID4-LicKM, ^{18,32,41,47을} 얻기 위해 ¹⁸ (TMV 기반 벡터) pBID4.
2. A.의 electrocompetent 세포로 10 ~ 50 GFP를 들고 pBID4의 NG 또는 HAC1 소개 A.의 electrocompetent 세포로 변형 GV3101과 LicKM을 투메 파시 엔스 튜메 파시 엔스는 유전자 MicroPulser의 electroporator와 GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 및 A4를 변종.
3. 별도의 언급이없는 한 침투 실험을 위해 변환 된 아그로 박테리아를 사용합니다.

3. 된 담배 식물에 아그로 박테 리움의 침투를 진공 청소기로 청소

1. A. 성장 튜메 파시 엔스는 LB 매체 YEB 메드에서 (O / N) 하룻밤 변종IUM 또는 AB 매체는 200 ~ 250 rpm에서 진탕 28 ° C에서 카나마이신 50 ㎎ / L로 보충.
2. 4,000 ×에서 LB 또는 YEB 또는 AB 성장 0.5 원심 분리기 아그로 박테 리움 세포의 600 nm에서 광학 밀도 _(600)에 밀리 Q 물에 아그로 박테리아를 희석 4 ° C에서 10 분 동안 G는 0.5의 ₆₀₀ 유도 매체 (1X MS 소금, 10 밀리미터 MES, 200 μM 아세토 시린 곤, 2 % 자당 [MMA])에 다시 일시 중지, 1-3 실온에서 교반 시간,하지 않는 한 그렇지 않으면 지적했다.
3. 아그로 박테 리움 현탁액 된 담배 공장 공중 조직을 잠수함이 잠수, 30 또는 60 초 동안 50 ~ 400 mbar의 진공을 적용하여 진공 챔버에 식물을 침투. 최적의 침투는 정기적으로 60 초 동안 50 ~ 100 mbar에서 적용됩니다.
4. 진공이 깨진되면, 진공 챔버에서 식물을 제거 물에 씻어, 사전 침투 성장에 사용되는 것과 동일한 성장 조건에서 5-7일에 성장.
5. 효능을 테스트하려면아그로 박테 리움 VIR 유전자, 아세토 시린 곤의 상이한 농도 (0, 100, 200 또는 400 μM)을 유도하는 화학 물질은 침투 완충액 아그로 박테리아 (1X MS, 10 mM의 MES에, 2 % 글루코스)에 첨가 하였다. 비르 유전자, 포도당 (0, 1, 2 또는 4 %)의 다른 비율의 유도에 단당류의 효과를 침투 버퍼 (1X MS, 10 밀리미터 MES, 200 μM 아세토 시린 곤)에 현탁 아그로 박테리아에 추가되었습니다. N.은 단계 3.3 및 3.4)에서 전술 한 바와 같이 benthamiana 식물이 침투 하였다.
6. 아그로 박테 리움 연구소는 ₆₀₀ 0.5. N.에 밀리 Q 물에 희석 GV3101, C58C1 및 LBA4404 및 야생형 균주 A4, At06, AT10, 그리고 At77 pBID4-LicKM 벡터를 숨겨을 변종 benthamiana 공장은 단계 3.3 및 3.4에서 위에서 언급 한 바와 같이 각각의 특정 변형에 침투했다.

바이러스 성 침묵의 억제 4. 공동 agroinfiltration 절차

1. 엠IX 1:1 GFP 유전자와 토마토 덤불 스턴트 바이러스 (TBSV)의 바이러스 성 침묵 억제 P19을 들고 밀리 Q 물 희석 된 아그로 박테 리움 GV3101 문화 2:1 3:1 4:1 비율. N. 침투 상술 한 바와 같이 benthamiana 공장.
2. N. 침투 두 밀리 Q 물 희석 된 아그로 박테 리움 GV3101 문화의 혼합물로 benthamiana 공장 : pBID4-HAC1 플라스미드를 전달하는 첫 번째와 침묵 진압 중 하나 들고 두 번째 - TBSV 또는 감귤 tristeza 바이러스의 P23의 P19, pCassp 플라스미드에서 ( pCassp19)와 35S 프로​​모터 비율 4:1에서 각각 (PGR-P23), 아래의 PGR 이진 플라스미드에.

5. 웨스턴 블롯 분석

1. N.에서 임의의 잎을 채취 benthamiana, N. 엑셀 또는 N. excelsiana의 4-7 dpi 해상도에서 식물과 미세 분말을 액체 질소에 분쇄.
2. 트리톤 0.5 %를 포함 1X PBS 버퍼의 세 볼륨을 추가X-100 각 샘플에.
3. 조심스럽게 4 ℃에서 15 분 동안 추출 된 샘플을 흔들
4. 5 분 동안 추출 스핀 깨끗한 에펜 도르프 튜브에 총 수용성 단백질을 수집합니다.
5. 1X PBS 추출 버퍼에 적절한 희석 (1시 50분 1:100)에 추출물을 희석하고, 5 × 샘플 버퍼 (250 MM 트리스 - 염산 [산도 6.8], 10 % SDS, 파랑 0.5 % 브로 모 페놀, 50 % 글리세롤을 추가 최종 1 × 농도에 부착 V / V 및 500 mM의 DTT).
6. 5 분 동안 삶아 샘플.
7. 10 % SDS-PAGE에 의해 분리 된 단백질은 Immobilon-P 전달 막에 전송하고, 0.5 %의 I-블록과 블록.
8. 1:5,000에서 토끼 다 클론 항-GFP 항혈청을 사용하고 HAC1 1 시간 동안 차단 솔루션에 1:1,000에서 마우스 항 - 폴리 히스티딘 단일 클론 항체를 사용하여 GFP를 감지합니다.
9. 차 항체 라벨링 한 후, 10 분간 1 × PBST-20 각의 세포막을 세 번 씻어 1:5,000의 복합 - 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (HRP) 항 토끼 항체 또는 HRP-공액과 부화1 GFP 및 HAC1 검출을위한 시간, 각각에 대한 1:10,000의 D 항 마우스 항체.
10. SuperSignal 웨스트 피코 화학 발광 기판을 사용하여 서양 말을 처리합니다.
11. 단백질의 밴드 강도를 분석하고 밴드 보정 양을 얻기 위해 GeneTools 소프트웨어를 사용합니다.

단백질 생산 (샘플의 교정 양의 X 희석) /로드 샘플의 양) 4 = ㎎ / ㎏을 x.
식 : 단백질 생산 (P), 교정 량 (C), 시료 (D)의 희석 및 적재 샘플의 양 (S).

6. Zymogram 분석

1. 수집 pBID4-LicKM - 침투 N. benthamiana 임의의 조직 샘플.
2. 웨스턴 블롯 분석을 위해 전술 한 바와 같은 방법을 사용하여 단백질을 추출하고 0.1 % lichenan으로 10 % SDS-PAGE에 의해 분석이 젤에 포함되어 있습니다.
3. 전기 영동 한 후, 100 mM 트리스 - 염산 [pH를 8.0] 0.1 % 트리톤 X보기 (세척 완충액에서 10 분마다 겔 두 번 씻어-100) 한 후 1 시간 동안 65 ° C에서 세척 버퍼에 품어.
4. 배양 후, 세척 완충액을 버리고, 실온에서 5 분 동안 0.5 % 콩고 레드로 겔을 염색.
5. 10 분마다 밀리 Q 물에 젤 세 번 씻어하고 lichenase 활동을 시각화하기 위해 1 M의 NaCl을 추가합니다. 정제 된 박테리아 lichenase 단백질은 효소 활성에 대한 양성 대조군으로 사용 하였다.

7. GFP 이미징

1. 휴대용 장파장 UV 램프를 사용하여 전체를 일시적으로 형질 전환 식물체에서 GFP 형광의 시각적 검출을 수행.
2. 사진은 일시적으로 노란색 (8)를 통해 디지털 카메라로 식물을 전환, 52 필터 (노출 시간, 15 초) ES.
3. 웨스턴 블롯 이미지를 구하는 것은 GeneGnome에 GeneSnap 소프트웨어를 사용하여 정제하여 GFP 표준을 기반 검량선과, GeneTools 소프트웨어를 사용하여 결과를 정량 분석​​한다.
4. purifi에 기초하여 검량선을 사용 HAC1 단백질 정량화인플루엔자 바이러스의 A/Indonesia/05/05 균주로부터 ED HAC 단백질 표준.
5. 3-4 평균 값을 계산하는 모든 실험에 복제합니다.

결과

식물의 성장을위한 영양 요구 사항. 수경 식물 성장 배지 (암면) 및 영양 솔루션의 사용은 N.의 균일 성을 보장합니다 benthamiana 성장과 제거는 복잡성 (기계, 규제 및 효율성) 식물 재배를 위해 토양 사용과 관련된. 우리는 N. 증가 benthamiana 식물의 성장과 바이오 매스 축적을위한 최적의 조건을 결정하기 위해 상업적으로 이용 가능한 비료에 배어 암면 슬라브에. 우리는 95~100% 종자 발아를 관찰했다. 우리가 인 부족한 영양소 솔루션은 발아 N.의 성장을 지원하는 데 실패 것을 발견하기 때문에 하나는, 인 등의 발아를 달성하는 것이 중요 있음을 유의 benthamiana 씨앗 (그림 1A).

아그로 박테 리움의 성장과 식물의 건강과 단백질 생산에 침투 미디어의 영향. 우리는 t의 효율성을 최적화 할 수있는 여러 가지 미디어 조건을 테스트 한대규모 생산을위한 고 agroinfiltration 기법. 박테리아 (A.는 GV3101의 피로를 투메 파시 엔스) pBID4-GFP 구조를 숨겨은 다른 매체 조건 (YEB, LB 또는 AB)에서 O / N을 재배하고, 원심 분리 및 1 × 무라 시게 &를 포함하는 유도 매체 (MMA) (에 다시 중단 하나되었다 스쿡 [MS] 기초 소금 혼합물, 10 mM의 MES의 pH 5.6, 20g / L의 자당 200 μM 아세토 시린 곤) 또는 식물의 침투에 사용하기 전에 0.5의 ₆₀₀ 밀리 Q 물에 희석. 우리는 물에 희석 박테리아와 식물의 진공 침투 이전 보고서 ^42,48에 어떤 침투 미디어 달성 것과 비교 단백질 생산의 결과 것을 관찰했다. 대조적으로, YEB 또는 LB 미디어에서 성장 원액 아그로 박테리아와 침투 N. 완전히 시들고 귀착 AB 배지에서 성장 희석 아그로 박테리아가 침투 식물의 건강에 영향을 미치지 아니하는 동안 benthamiana는 DAT (이하 24 시간 후 침투에 나뭇잎) 도시하지 않음. 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 식물 YEB, LB 또는 AB 미디어에서 재배 및 밀리 Q 물 (1:5 ₆₀₀ 0.6 ~ 0.8 또는 1:10 ₆₀₀ 0.3 ~ 0.4의)가 보여 희석 아그로 박테 리움의 문화에 침투 증상과는 각각 1645, 1520 및 1839의 평균 GFP 생산을 나타내지 않았다. 아그로 박테리아가 (MMA)이 직접 밀리 Q 물에 희석 아그로 박테리아 (에 비해 단백질 생산의 증상과 유의 한 차이가 없음을 보여 주었다 원심 유도 매체에 다시 중단 각각 1671 ± 102, 1667 ± 131 ㎎ / kg). 따라서, 밀리 Q 물은 식물의 침투에 대한 아그로 박테 리움의 문화를 희석하는 것이 좋습니다 일상적 0.5의 _600을 달성하기 위해 다음 실험에 사용 하였다.

대상 표현에 아그로 박테 리움 현탁액 세포 밀도와 시간 코스의 효과. 우리는 다음에 조사하면 세균의 세포 밀도침윤 및 목표 발현 수준의 효율에 영향을 미친다. 이 목적을 위해, 우리는 pBID4-GFP, 2.0 _(600), 0.5, 0.1 및 0.05를 운반 아그로 박테 리움의 네 가지 세포 현탁액 밀도를 평가 하였다. 다음 침투, N. benthamiana 공장은 4, 7, 10 dpi 해상도에서 샘플을 수집하여 눈에 보이는 증상의 개발 및 목표 표현의 시간 경과에 대한 감시했다. 4 dpi로, 우리는 아그로 박테 리움의 다른 세포 현탁액의 밀도 침투와 식물 사이에서 GFP의 형광의 눈에 띄는 차이 (더 GFP 발현이 0.05 _(600)에서 관찰되지 않았다)를 관찰했다. 7 dpi로에서 GFP의 형광 ₆₀₀ 1.0, 0.5 및 0.1의 세포 현탁액의 밀도에 침투 공장에서 비슷하지만, 0.05의 _600에 침투 공장에서 낮았다. 도 1C에 도시 된 바와 같이, 이러한 데이터를 웨스턴 블롯에 의해 확인 하였다는 _600에서 매우 낮은 단백질 생산을 나타내는 4 dpi로 징수 샘플의 분석 600에서 가장 높은 UB>. 0.05 _(600)가 낮은 GFP 생산 (1,199 ㎎ / ㎏)을 보여 주었다 동안 7 dpi의 해상도, 식물, (각각 1,662, 1,870 및 1,890) 1.0, 0.5 및 0.1의 _600으로 추정 GFP 생산에 유의 한 차이를 보이지 않았다. 대조적으로, 10 dpi 해상도에서 GFP 생산에 차이는 네 개의 세포 현탁액의 밀도 (1,218, 1,181, 1,197 및 1,304) 중 하나를 사용하여 침투 식물들도 관찰되지 않았다.

아그로 박테 리움의 다른 균주 침투. 과도 단백질 생산에 사용할 수 아그로 박테 리움 균주의 다양성을 높이기 위해, 우리는 야생 형이 분리 시험. 자연 호스트의 왕관 - 담즙에서 분리 한 균주, 친절 박사 Gelvin (퍼듀 대학, 웨스트 라피 엣, 인디애나)에 의해 제공되었다. 과도 단백질 생산에서 자신의 유틸리티를 조사하기 위해, 우리는 N. 침투 다음과 같은 변종 카와 benthamiana잉 pBID4-LicKM ¹⁸ : A. rhizogenes (A4) 및 A. 야생 형 둥지 라는 A348, A208 및 A281 균주 (AT6, AT10 이름을, 그리고 At77, 각각)뿐만 아니라, A의 설계 실험실 변종 투메 파시 엔스 튜메 파시 엔스 GV3101, C58C1 및 LBA4404. 침투 된 잎은 7 dpi 해상도에서 회수하고 LicKM 발현 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추정 하였다. ;도 2a, LicKM 생산의 높은 수준에 도시 된 바와 같이 균주 GV3101, A4와 LBA4404 (~ 1750 ± 163, 1650 ± 26 1450 ± 117 ㎎ / kg, 각각) 약간의 차이와 함께 달성 될 수있다 표현의 낮은 수준 C58C1와 (~ 900 ± 102 ㎎ / ㎏); 및 (각각 ~ 1,250 ± 19, 1100 ± 42, 1200 ± 111 ㎎ / ㎏) AT6, AT10 및 At77와 중간체 제조. lichenase 효소 활성은 Zymogram 분석을 사용하여 증명되었다. 그림 2B는 중 하나를 사용하여 침투 식물 조직에 lichenase 생산 것을 보여줍니다아그로 박테 리움 균주는 효소 활성이었다. AT10으로 증상이 온화 변형하는 동안 하나는, 병적 인 증상 (발육 부진, 잎자루의 신장과 컬링, 및 잎 말림)를 보여 A4와 At77 변종으로 침투하는 N.의 benthamiana 공장을주의해야한다. 증상은 실험실 변형 GV3101 (그림 2C)로 침투 N.의 benthamiana 공장에서 관찰되지 않았다.

대체 된 담배 종의 침투. 우리는 담배 속 (N.의 benthamiana와 N. 입시)와 하이브리드 종, N. 두 야생형 종의 바이오 매스 발전 및 단백질 생산의 비율을 비교 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana). 시험 종, N.의 benthamiana, 아그로 박테 리움 - 기반 또는 바이러스 계 발현 ^시스템을 이용하여 과도 ^2,34,4 단백질 생산에 널리 사용되는 호스트9, 발아 4-5 주 이내에 침투 준비에 도달한다. 바이오 매스의 최적 수준을 생성하는 데 필요한 성장 기간은 N. 4-5 주입니다 excelsiana하지만 N.에 대한 (6~7주) 이상 엑셀. 또한, 식물은 internodes N. 비교적 짧은 입시 다른는 담배 종에 비해.

또한, 우리는 N.의 진공 침투를 관찰 benthamiana와 N. 60 초 동안 50 ~ 250 mbar에서 excelsiana은 전체 잎의 agroinfiltration에 매우 효율적입니다 동안 N. 엑셀은 진공 등 Sillwet-77 또는 S240 등의 비 이온 계면 활성제의 존재 하에서 1 분마다 3 회 도포 하였다하더라도, 인해 하부 캐노피와 가죽 같은 잎에 침투하기 어렵다. 또한, N.의 발아율 excelsiana 및 N. 엑셀 시어 씨앗 ~ 40-50%이었다 90-100%에 발아율을 높이기 위해, 종자를 10 % blea로 처리되어야한다파종하기 전에 1 시간 동안 채널. 같은 성장 조건, N.에서 생성 할 수있는 가장 높은 잎 바이오 매스에서 excelsiana는 N.에 비해 약 높은 두 배입니다 benthamiana (표 1).

단백질 생산 N.에 조사 하였다 benthamiana, N. 입시 및 N. excelsiana는 pBID4-GFP를 숨겨 아그로 박테 리움 균주 GV3101에 침투. GFP의 축적이 웨스턴 블롯 분석에 의해 다음에 UV 빛을 사용하여 전체에 침투 잎에 7 dpi로에서 평가되었다. 그림 3a는 N.에서 GFP의 고른 분포를 보여줍니다 benthamiana와 N. excelsiana 및 N.에 격차가 유통 엑셀 시어 (때문에 N. 입시의 전체 잎의 영역을 침투의 어려움). 그림 3b는 7 dpi 해상도에서 세 된 담배 종에서 수집 침투 잎에 UV 빛의 조명에 의해 추정 GFP 생산의 수준을 보여줍니다. GFP의 축적lation 수준 N. 높았다 N.보다 benthamiana (~ 2.23 g / kg) excelsiana 및 N. 엑셀 시어 (각각 1.89 ~ 1.54 g / kg). N.에서 단백질 생산의 저역 입시 고르지 침투 및 수집 잎 축적 된 GFP의 분포에 의한 것입니다.

우리는 직접 빛에 노출 상위 잎은 종종 캐노피 아래 잎보다 (2-4 dpi의 해상도) 과도 GFP 축적의 최초 및 최고 수준을 나타내는 것을 관찰했다. 그러나, 우리의 연구에서, GFP의 축적은 7 dpi 해상도에서 가장 높았고 더 GFP 축적을 보여 uninfiltrated 새롭게 성장하는 잎을 제외하고, 대부분의 잎에 걸쳐 고르게 분포되었다.

과도 단백질 생산. 진공 침투에 진공 압력과 시간의 효과는 크게 바늘없는 주사기 ^(42)와 손 주입에 의해인가 된 압력에 비해 과도 발현 수준을 증가시킨다. 의 응용 프로그램진공은 기공을 통해 잎 잠긴 공장에서 철수 가스가 발생합니다. 진공이 부서 및 압력이 급격히 증가되는 경우, 아그로 박테 리움 현탁액의 배기 가스 ^(50)를 대체하기 위해 잎에 구동된다.

N.의 잎에 진공 압력의 효과를 테스트하려면 benthamiana, 우리는 30 초, 60 초에 대한 다양한 진공 압력 (50 ~ 400 밀리바)에서 pBID4-GFP를 숨겨 아그로 박테 리움 균주 GV3101과 식물에 침투. 그것은 (50 밀리바 이하) 강한 진공이 곧 침투 (48 시간) 후 조직 시들고 식물 사망에 이르는, 침투 잎의 기계적 손상에 30 초, 60 초 결과를 적용하는 것이 증명되었다. 50 잎 영역의 %와 GFP 생산 (303 ± 90 ㎎ / ㎏) (그림 4A)의 감소 수준의 침투에 약한 진공 (400 밀리바) 결과 다른 한편으로, 응용 프로그램에서. 중요한 사실은, 우리는 50, 10에서 GFP 생산에 차이가 관찰되지0과 200 밀리바 (1,651 ± 107, 1688 ± 40, 1594 ± 26 ㎎ / ㎏, 각각) (그림 4A)과 온화한 아니, 식물의 건강에 해로운 영향 50 ~ 200 밀리바에서 진공 압력이 30 또는 60에 적용했다 초. 따라서, 진공 압력의 50 ~ 100 밀리바는 침투 실험을 권장합니다.

표적 발현에 진공의 재생 시간의 효과는 N.의 한 평면에 침투하여 평가 하였다 benthamiana 공장 pBID4를 숨겨 GV3101의 0.5 ₆₀₀ 매 시간마다 -. 같은 아그로 박테 리움 문화에서 8 시간 동안 GFP는 그림 (b)는 GFP의 생산 수준이 유사한 모든 시간이 제안, 8 시간까지를 가리키는 것을 보여줍니다이 이상 시간의 기간은 아그로 박테 리움은 단일 가닥 DNA를 시작하는 그것의 기능을 유지합니다.

단백질 생산에 화학 유도의 영향. 일부 공장의 페놀 대사와 설탕은 산업사 수 있습니다A.의 UCE 독성 유전자 ^1.52를 투메 파시 엔스. 결과적으로, 많은 화학 물질과 monosaccharaides 다양한 식물 종의 변이 단백질 생산을 향상시키기 위해보고되었다. 아세토 시린 곤 가장 일반적 A. 배양에 첨가 agroinfiltration ^40,53-57 전에 VIR 오페론을 유도 투메 파시 엔스.

우리는 N. 일시적인 GFP 단백질 생산에 아세토 시린 곤의 상이한 농도 (0, 100, 200 및 400 μM) 및 글루코스 (0-4%)의 효과를 평가했다 GFP - benthamiana은 아그로 박테 리움 균주 GV3101 pBID4를 숨겨와 침투. 이 목적을 위해, 우리는 침투하기 전에 1-3 시간 동안 아세토 시린 곤 및 포도당의 상이한 농도를 함유 MMA 유도 배지에서 아그로 박테 리움 세포를 재현 탁. 모두 육안 관찰 (데이터 미도시) 및 웨스턴 블롯 (도 4C), 시험 된 농도 개분의 결과에 따르면이들 화합물의 유동 매체가 더 아세토 시린 곤 또는 글루코스를 함유하지 대조군과 비교 GFP 형광 또는 단백질 생산의 상당한 증가를 유발.

N.에 GFP 및 HAC1 유전자의 일시적인 생산에 침묵 억제의 공동 침투 효과 benthamiana 잎. 이전에 기자 단백질 ^(34)의 향상된 생산의 결과로 침묵 억제 (토마토 덤불 스턴트 바이러스의 P19 [TBSV]) 전사 후 유전자 침묵 (PTGS)을 방해의 공동 발현을 입증되었습니다.

우리는 N. 공동 침투 효과를 평가했다 GFP의 리포터 유전자 (pBID4-GFP)와 P19을 들고 발사 벡터 benthamiana. A.의 침투 이전에, ₆₀₀ 0.5 희석 pBID4-GFP 및 P19을 품고 튜메 파시 엔스 GV3101의 문화는 각각 1:1, 2:1 3:1 4시 1분. 익스프레스의 비율로 혼합 한침묵 억제의 이온은 꽃 양배추 모자이크 바이러스 35S 프로모터에 의해 제어되었다. 7 dpi로 (도 5a)의 웨스턴 블롯 분석의 결과에 의해 지시 된 바와 같이, P19의 존재가 증가 또는 N.에서 GFP 생산을 감소시키지 않았다 benthamiana,이 아그로 박테 리움 현탁액의 비율.

p23and의 P19 - - HAC1에 대한 PTGS의 예방에 우리는 또한 2 개의 바이러스 성 유전자 침묵 억제의 효과를 비교했다. 발사 벡터 pBID4-HAC1 (H1N1 A/California/04/2009)과이 바이러스 침묵 억제 플라스미드 중 하나를 운반하는 아그로 박테 리움의 배양 물을 각각 4:1의 비율로 혼합, 0.5 _(600)로 희석 하였다 4-5 주령 N.에 공동 침투 benthamiana. A.의 현탁액 pBID4을 들고 튜메 파시 엔스 - HAC1 혼자가 컨트롤로 침투했다. 침투 된 잎 시료 3 ~ 8에 dpi로 수집 하였다. 실험은 REPE했다HAC1 식의 ated 3 회 평균 수준은 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된다.

그림 (b), N.의 공동 침투에서와 같이 P23 또는 P19과 benthamiana (각각 642 ± 157 764 ± 108 ㎎ / ㎏)의 6 dpi의 해상도 (각각 약 15-25%)에는 침묵 억제를 사용하지에 비해 HAC1 생산의 증가를 초래. 이 P23와 P19은 우리의 시스템에서 효율적으로하는 것이 좋습니다. 그러나 pBID4-HAC1은 P19와 공동 침투 때 HAC1의 축적이 하루 일찍 발생했음을 주목해야한다. 따라서, 우리의 결과는 HAC1에 침묵 억제 P19 및 GFP 축적의 효과는 일시적 발현 및 / 또는 N.의 일부 단백질의 안정성을 선택적으로 개선을 제안, 다른 것을 보여 benthamiana.

또한 관찰 존재와 침묵 억제 HAC1 단백질의 자극 수준의 부재하에 둘uction 7 dpi로에서 감소하기 시작했다. 이 발사 벡터로 침투 N.의 benthamiana에서 과도 단백질 생산의 감소의 타이밍이 특정 타겟을 나타냅니다.

발사 벡터를 아그로 박테 리움 형질의 세포 은행은 표적 유전자의 안정성, 아그로 생존 및 단백질 축적 수준 매년 평가 하였다. -80 ° C에서 보관 하였다 pBID4-HAC1로 형질 전환 GV3101 균주의 세포 은행의 글리세롤 주식은 침투 N. 일시적인 단백질 생산의 수준의 변화없이 3 년 이상 매우 안정적인 것으로 나타났다 benthamiana 공장. 그림 (c) 2010, 2011, 2012, 2013 년에 웨스턴 블로 팅에 의해 추정 된 HAC1 단백질 생산은 각각 670, 685, 566 및 683 ㎎ / ㎏, 이었다는 것을 보여줍니다. N.의 평균 HAC1 생산 benthamiana 공장은 651 ± 49.4 ㎎ / ㎏이었다.

표 1. N.의 비교 benthamiana와 N. excelsiana 식물 바이오 매스 생산.

그림 1. N. 일시적인 유전자 발현의 웨스턴 블롯 분석 benthamiana. (A) 6 주 된 N. benthamiana 1) 4.8 %의 인을 함유 비료 용액에서 성장하는 식물 및 2) 식물은 0 %의 인을 함유 비료 용액에서 성장. 신선한 잎 무게 상당의 스물 다섯 μg는 레인 당로드했습니다. GFP 생산 (B) 비교 pBID 침투와 식물 진공세 가지 다른 미디어에서 자란 4-GFP-품고 아그로 박테 리움 GV3101의 문화 : YEB, AB 및 LB. GV3101의 문화 YEB에서 O / N을 성장 또는 LB 미디어는 저속 원심 분리 (MMA) (레인 : MMA-1과 MMA-2, 각각) 유도 매체에 다시 중단, 또는 YEB에서 O / N 성장, LB 또는 AB 매체와 직접 1:5 밀리 Q 물을 1:10로 희석 (레인 : YEB / 5 YEB/10, AB / 5 AB/10, LB / 5 LB/10) (C) 비교. A. 상이한 농도 (2.0 ₍₆₀₀₎ 0.5, 0.1 및 0.05) 진공 침윤 다음 4, 7, 10 dpi 해상도에서 GFP 발현 pBID4-GFP를 들고 GV3101의 피로를 투메 파시 엔스.

N.의 그림 2. 과도 lichenase 생산 활동의 비교 다음 진공 침투 diffe와 benthamiana 공장아그로 박테리아의 변종을 임대. 아그로 박테리아 균주 (GV3101, A4, At77, C58C1, AT6, AT10 및 LBA4404)의 문화 pBID4-LicKM이 N.의 잎에 개별적으로 침투 된 발사 벡터를 숨겨 benthamiana. 침투 잎은 7 dpi로 수집 하였다. 웨스턴 블로 팅에 의해 정량화 (A) Lichenase 생산. (B) Zymogram 분석이 효소 활동을 통해 lichenase 생산을 보여주는. 아그로 박테 리움의 (C) 효과 (야생 형 A4, AT10, At77 및 실험실 변형 GV3101) N.에 침투 7 dpi의 해상도 benthamiana 공장 건강. 신선한 잎 무게 상당의 스물 다섯 μg는 레인 당로드했습니다.

N.의 잎에있는 그림 3. 과도 GFP 발현 benthamiaNA, A.와 진공 침투 후 7 dpi의 해상도 N.의 excelsiana과 N.의 엑셀 시어 GFP - 발사 벡터 pBID4를 숨겨 투메 파시 엔스. GFP 축적의 UV 빛 아래 GFP 표현의 (A) 시각 검사. (B) 웨스턴 블롯 분석.

그림 4. 과도 GFP 발현과 식물의 건강에 진공 압력의 (A) 효과. N. benthamiana 공장은 pBID4으로 침투했다 -. 400, 200, 100 또는 50 mbar의 진공 압력에서 GFP를, 30 초, 60 초 진공 유지 시간에 (B) 안정성 및 A의 감염 N.의 튜메 파시 엔스 benthamiana은 아그로 박테 리움 GV3101은 pBID4-GFP는 AB 배지에서 성장과 0.5의 _600로 희석 품고으로 침투. Agroinfiltration은 N.의 한 평면에 침투하여 수행 하였다 GFP의 일시적 발현에 아세토 시린 곤과 포도당의 농도가 다른 동일한 희석 된 아그로 박테 리움 문화 (차선 0-8). (C) 효과에 benthamiana 공장 매 시간마다. pBID4를 숨겨 아그로 박테 리움 균주 GV3101은 - GFP는 YEB 미디어에서 O / N 성장 원심 분리 (200)를 포함하는 0, 100, 200 또는 400 μM에서 아세토 시린 곤과 2 %의 포도당을 함유하는 MMA에서, 또는 MMA의 하나 0.5 _(600)에 재현 탁 0 ℃에서 글루코스 μM 아세토 시린 곤, 1, 2 또는 4 %. 아그로 박테 리움 현탁액을 침투하기 전에 실온에서 3 시간 동안 유지 하였다.

그림 5. N. 일시적인 단백질 생산에 침묵 억제 효과 benthamiana 잎. (ApBID4-GFP의 공동 침투와 다른 비율로 P19를 다음 GFP 단백질의) 웨스턴 블롯 분석. 7 dpi로 (신선한 잎 무게 상당의 25 μg는 레인 당로드). (B) pBID4-HAC1를 운반하는 아그로 박테 리움의 문화에서 수집 된 샘플은 개별적으로 P19 또는 P23 침묵 억제를 들고 문화와 4:1 비율로 혼합 플라스미드. 아그로 박테 리움 문화의 결과 조합은 진공 식물에 침투했다. HAC1의 침투 조직은 재조합 단백질의 정량 8 dpi의 일상 수집 하였다. 아그로 박테 리움 세포 은행의 (C) 안정성. 식물은 단백질의 축적을 평가하기 위해 매년 아그로 박테 리움 세포 은행의 동일한 배치로 침투했다. 신선한 잎의 무게에 상당 오십 μg는 레인 당로드했습니다. 일의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오그림입니다.

토론

이 연구에서, 우리는 시작 벡터를 운반하는 아그로 박테 리움 균주를 사용하여 선택한 된 담배 종의 일상 과도 단백질 생산을위한 간단한 agroinfiltration 프로토콜을 개발했습니다. 또한, 우리는 우리의 과도 식물 발현 시스템에서 가장 높은 재조합 단백질 생산 수준을 달성하기 위해 최적의 조건을 확인했다.

희석 A. 진공 침투 N.에 출시 벡터 pBID4를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스 benthamiana, N. excelsiana 및 N. 엑셀 시어는 알팔파 모자이크 바이러스를 숨겨 GV3101에 침투 피섬 새 티범 다른 식물 종에 비해 7 dpi로 내 표적 단백질 생산의 높은 수준, 결과 - 나 오이 모자이크 35S 프로모터에서 GFP의 리포터 유전자를 발현하는 바이러스 기반의 벡터 ^41, 또는 락 투카 사티, 까 lycoA.의 C58C1 변형으로 침투 persicum 및 애기 장대 베타 - 글루 쿠로니다 아제 리포터 유전자 ^57. N.을 들고 튜메 파시 엔스 benthamiana와 N. excelsiana는 90 % -95 %의 침투 효율이 30 ~ 60 초 동안 50 mbar에서 침투 진공 청소기로 청소하기 쉽게했다. 잎 지역의 나머지 10 % 때문에 진공의 응용 프로그램 중 아그로 박테 리움 현탁액의 표면에 잎의 일부 부동의 침투되지 않았습니다. 발사 벡터가 세포 간 이동 ¹⁸ 능력을 가지고 있기 때문에, 과도 단백질의 축적은 7 dpi로에 전체 잎뿐만 아니라 잎자루에서 발생합니다. pBID4 발현 벡터가 셀 사이를 이동시킬 수 있지만, 체계적 ¹⁸ 움직이지 때문에 10 dpi로에서 잡은 GFP 생산은 다소 낮았다; 따라서, 새로 자란 잎은 벡터를 포함하지 않고 대상의 생산에 기여하지 않습니다. 또한, 재조합 단백질의 열화 이상의 시간 mAY 10 dpi로에서 환원 단백질 수준에 기여한다. 우리의 결과는 A.의 침투를 보여 주었다 N. 일시적인 단백질 생산의 튜메 파시 엔스 균주 GV3101 매개 높은 수준 benthamiana. 또한, 목적 단백질은 lichenase하는 N-말단, C-말단 또는 내부 융합체 (LicKM), β-1 ,3-1, 4 - 글루 카나 아제, 클로스 트리 디움 thermocellum에서 열 안정성 효소이고 많은 타겟에 내열성을 부여로 설계 될 수있다 단백질 융합 ^18. N.의 침투 A.과 benthamiana 잎 말림, 잎자루의 신장, 컬링 : 가벼운 또는 심한 증상을 유발 관심의 유전자를 품고 야생형 균주 (AT6, AT10 및 at77를) 투메 파시 엔스. 어떤 병적 인 증상은 N.에서 관찰되지 않았다 일부 유전자가 GV3101을 변종 pBID4에 삽입 실험실로 변환하는 동안 benthamiana는, 빈 pBID4 벡터를 숨겨 실험실 변형 GV3101에 침투, C58C1 또는 LBA4404 가벼운 괴사 반응과 잎을 이끌어백화 / 잎의 침투 지역에서 증상을 황변. 야생 형 아그로 박테 리움 또는 가지과 식물 기폭 장치를 제거하는 균주에 의한 괴사 증상은 이전에 ^{56, 57가보고되었습니다.} 괴사 반응은 유형 III 분비 시스템의 유형 IV 분비 시스템에 의해 식물 세포에 전달 세균의 단백질 및 / 또는 편모 ^58-60 감도의 독성 요인에서 발생할 수 있습니다. 우리는 이종 단백질의 일시적인 생산도 병원성을 유도 할 수 있으며 침투 공장에서 과민 반응이 나뭇잎 것으로 나타났습니다. 많은 연구자들은 안정적으로 형질 전환 식물 ^28,57에 비해 과도 단백질 생산의 5 ~ 20 배 높은 수준까지 생산 공장 이진 벡터와 다른 식물 종의 agroinfiltration을보고했다. 우리의 데이터는 보여줍니다 N. benthamiana는 GV3101에 대해보고 된 GFP 수익률과 유사 GFP의 pBID4-GFP 일시적으로 발현 높은 수준을 품고으로 침투N.의 benthamiana는 아그로 박테리아가 롯트-GFPSYS 바이러스 벡터 (총 수용성 단백질의 80 %) ^{44 운반과} 침투. 런칭 벡터를 이용 Agroinfiltration이 내열성 단백질 LicKM의 높은 생산 결과, 표준 플라스미드 바이너리 ^(18)를 사용하여 관찰 된 것보다 50 배.

A.의 감염을 테스트하려면 튜메 파시 엔스 및 발사 벡터의 안정성, 우리는 N.의 플랫 침투 benthamiana pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 GV3101의 동일한 밀리 Q 물 희석 문화권을 사용하여 최대 8 시간 동안 매 시간마다. 우리의 데이터는 GV3101의 변형을 효율적으로 최소 8 시간 및 pBID4 (발사 벡터)에 대한 감염성 것으로 나타났다은 8 시간 긴 침투하는 동안 매우 안정적입니다.

-80 ° C에 저장된 발사 벡터 pBID4-HAC1 (세포 은행을) 숨겨 GV3101 균주의 글리세롤 주식은 과도 PROTE의 변화없이 3 년 동안 매우 안정적인 것으로 나타났다침투 공장에서 생산.

최적의 조건에서 35 사이의 42 일 후 파종에서 재배 N. benthamiana의 식물 진공 침투 매개 일시적인 유전자 발현 ^(40)에 대한 최적이었다. (3-4 주령) 이하 식물 때문에 세포 현탁액 표면 및 진공을인가하는 기계적 효과에서 조직 손상에 떠있는 나뭇잎 완전히 침투 할 수 없다. 사십오일, N.보다 오래된 식물 benthamiana 사용 된 최적의 광 조건에서, 무대를 볼트, 일시적 발현의 수준이 낮습니다.

저분자 페놀 화합물 (아세토 시린 곤) 및 monosaccharaides (글루코오스) ^55,61을 A. 투메 파시 엔스는 소재 VIR 유전자를 유도하는 것으로 알려져있다. 또한, N.의 침투 50-600 μM의 농도에서 아세토 시린 곤의 존재 이진 벡터 pCAMBIA (GFP)와 benthamiana 약간 과도을 증가 표시했다유전자 발현 ^40. 우리는 3 시간 동안 MMA에 pBID4-GFP를 숨겨 GV3101의 문화에 이들 화합물을 첨가하여 우리의 시스템에서 아세토 시린 곤과 포도당의 서로 다른 농도의 효과를 연구하고, GFP 발현에 차이를 찾을 수 없습니다. 흥미롭게도, pBID4-GFP를 숨겨 0.5의 ₆₀₀ 밀리 Q 물에 희석하고 비르 유전자의 유도없이 침투 GV3101의 문화에 의한 문화 침투와 그로서 GFP의 동일한 금액을 표명했다. A. 튜메 파시 엔스의 비르 유전자 (들)은 잠재적으로 공장의 페놀 화합물 (아세토 시린 곤 및 sinapinic 산)과 잎의 조직에 존재하는 식물 monosaccharaides (포도당과 과당)에 의해 유도 될 수있다. 따라서 외인성 VIR 유전자 유도제의 존재 또는 부재에서 GFP 발현의 유사한 수준이 식물 세포에서 GFP 발현 발사 벡터의 복제 중에 본 세포질 VIR 유전자 유도제의 효과의 결과 일 수 있다는 것을 추측.

야생 형 N. benthamiana 과도 단백질 생산 ⁴⁹ 모델 호스트로 사용되어왔다. 그러나, N. benthamiana의 상대적으로 낮은 바이오 매스 수율은 재조합 단백질의 대량 생산에 대한 응용 프로그램을 방해한다. 최적의 호스트는 일시적 발현의 높은 수준의 온실 쉬운 성장을 결합하고, 아그로 박테 리움의 침투 ^2에 민감해야한다. 다른 호스트를 선택하기 위해, 우리는 하이브리드 N.에게 된 담배 (N.의 benthamiana와 N. 엑셀)의 두 개의 서로 다른 야생 형 종을 침투하고 A.와 excelsiana (N. 엑셀 × N.의 benthamiana) pBID4-GFP 플라스미드를 숨겨 변형 GV3101을 투메 파시 엔스. 이러한 세 가지 종 중에서, GFP 발현 수준 N. 약간 높았다 benthamiana. N. 엑셀 시어 식물 인해 가죽 같은 잎을 진공 agroinfiltration에 어려움을 보였으며, N. excelsiana생산 거의 같은 성장 조건에서 더 많은 바이오 매스를 두 배. 7 dpi 해상도에서 GFP의 일시적인 생산 N. 상대적으로 유사하다 benthamiana와 N. excelsiana. 따라서, N. excelsiana은 재조합 단백질 생산에 더 적합한 호스트 일 수있다.

아그로 박테 리움 매개 과도 단백질 생산 유전자가 식물 바이러스의 기원 ^(62)의 억제를 침묵의 공동 식으로 극복 할 수 PTGS ^{26 일에} 의해 제한됩니다. 과도 단백질 생산 이전에 함침 조직 ^(34)에 PTGS를 억제 TBSV의 P19 단백질의 존재하에 50 배 향상된 것으로 나타났다. 우리의 연구에서, 우리는 개별적으로 발사 벡터 pBID4-HAC1와 공동 침투 두 바이러스 성 침묵 억제 (P19 및 P23)의 효과를 평가 하였다. 이러한 침묵 억제의 공동 침투 HAC1 만 약간의 증가와 함께, HAC1의 일시적 발현에 거의 영향을 미칠 듯공동 침투 P23 또는 P19의 존재 단백질의 축적 (15~25%). 단백질 생산에 긍정적 영향을 미치는 것으로, 침묵 억제 구체적 대상 식물 종 및 바이러스 벡터 ^(63)에서 유효로 선정 될 필요가있다. TMV의 헬리는 RNA 침묵 활동 ^{(64), (65)의} 억제가 있습니다. pBID4-HAC1와 P23 또는 P19의 공동 침투는 GFP의 증가없이 또는 과도 HAC1 단백질 생산에 약간의 증가의 결과로 우리의 데이터는 이러한 관찰을 확인합니다.

결론적으로, 우리는 수정 및 최적화 식물과 아그로 박테 리움의 성장 조건을 진공 침투의 효율성을 개선했습니다. 이 기술은 몇 시간에 식물 재료의 수백 킬로그램의 성장과 침투 할 수있었습니다. 우리는 성공적으로 현재 좋은 제조 관리 기준 (cGMP의) 조건에서 산업 규모에서 높은 처리량 백신 생산을위한 공장 일시적 발현 기술을 자동화. ABO 자세한 내용은UT 자동화 및 cGMP의 조건 하에서 서브 유니트 백신 후보를 포함한 재조합 단백질의 생산을위한 식물 과도 단백질 생산 시스템의 활용은, 독자는 홈페이지 칭한다 www.fhcmb.org/ .

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Nicotiana benthamiana	Tobacco 생식질 수집, 작물 과학과, 노스 캐롤라이나 주립 대학	PI 555478 TW16	침투
Nicotiana excelsior	담배 생식 질 수집, 작물 과학과, 노스 캐롤라이나 주립 대학	PI 555685 TW47	침투
Nicotiana excelsiana	Dr. Wayne Fitzmaurice, Large Scale Biology Corporation, Vacaville, CA	LSBC EBA 042304.02	침투
진공 스키드	Abbas, Ashland, MA	맞춤형	식물 침투
Rockwool	Grodan Inc., 온타리오, 캐나다	AO 50/40	식물 성장용 수경 매체
2-(N-Morpholino) 에탄술폰산	Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ	172595000	버퍼
무라시게 & Skoog salt (MS salt)	Phyto Technology Lab	M524	조직 배양 매체
Acetosyringone	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	D134406-5G	Agrobacterium induction
Immobilon-P transfer membrane	Millipore, Billerica, MA	IPVH00010	Western blotting
I-block	Applied Biosystems, Foster City, CA	T2015	Western blotting
토끼 다클론 항-GFP 항혈청	Washington Biotechnology, Baltimore, MD		웨스턴 블로팅
마우스 안티– poly-histidine monoclonal antibody	Qiagen GmbH, Hilden	34670	Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-rabbit 항체	Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA	111-035-003	Western blotting
Horseradish peroxidase-conjugated anti-mouse anti-mouse antibody	Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA	115-035-003	Western blotting
SuperSignal® West Pico 화학발광 기질	Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL	34078	Western blotting
Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glucan)	Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland	P-LICHN	Lichenase Activity
Congo Red	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	C6277	젤 염색
디지털 카메라	Olympus, Center Valley, PA	C-8080	화학발광 이미징
GeneGnome	Syngene, Frederick, MD		화학발광 이미징
GFP 표준	사내에서		된 화학 발광 이미징
식물 비료 솔루션	Griffin Greenhouse Nursery Supplies, Newark, DE	67-23-20	식물 성장
Lichenase 표준	집에서		Western blotting
MicroPulser Electroporator	BioRad, Hercules, CA	165-2100	Agrobacterium transformation