Method Article

사례 연구로 담배에 과도 단백질 발현 : 실험 접근의 디자인을 사용하여 복잡한 시스템의 특성

DOI:

10.3791/51216

⸱

January 31st, 2014

 , 
1Institute for Molecular Biotechnology, RWTH Aachen University, 2Institute for Molecular Biology and Applied Ecology, Fraunhofer Gesellschaft

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 식물에서 단일 클론 항체와 리포터 단백질의 과도 발현 유전자 조절 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건의 영향을 결정하고 모델링하는 데 사용될 수있는 실험 방법의 설계를 설명한다.

Abstract

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식물은 낮은 비용, 확장 성 및 안전성을 포함한 생물 약제의 제조를위한 다수의 이점을 제공한다. 일시적 발현은 짧은 개발 및 생산 시간의 추가적인 장점을 제공하지만, 발현 따라서 좋은 제조 연습의 맥락에서 규제 우려로 상승을주는 일괄 처리 사이에 상당히 다를 수 있습니다. 우리는 일괄 간의 발현의 변동에 대한식이 동안 규정 식 구조 요소, 식물의 성장과 발달 파라미터 및 배양 조건 등 주요 요인의 영향을 결정하기 위하여 실험 (DOE) 접근법의 디자인을 사용했다. 우리는 모델 항 HIV 단일 클론 항체 (2G12)과 형광 마커 단백질 (DsRed를)을 표현하는 식물을 시험했다. 우리는 모델의 특정 속성을 선택하기위한 이론적 근거를 설명하고 잠재적 한계를 식별합니다. 일반적인 방법은 간단하게 다른 문제로 전송 될 수 있기 때문에 모델의 원리광범위하게 다시 적용 : 작은 모듈, 최적의 실험 조합의 소프트웨어 가이드 설정 및 단계적 디자인 증가로 초기 문제를 분할하여 지식 기반 파라미터 선택, 복잡성 감소. 따라서, 방법론뿐만 아니라 식물의 단백질 발현을 특성화뿐만 아니라 기계적인 설명이 부족한 다른 복잡한 시스템의 조사에 유용합니다. 파라미터 사이의 상호 접속을 설명하는 예측 식들은 다른 복잡한 기계적 시스템 모델을 확립하는데 사용될 수있다.

Introduction

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식물이 성장 저렴하기 때문에 식물에서 바이오 의약품 단백질의 생산이 유리하다, 플랫폼은 더 많은 식물을 재배하여 확장 할 수 있으며, 인간의 병원체는 1,2를 복제 할 수 없습니다. DNA 전달 및 정제 된 제품의 배달 지점 사이의 시간을 세 미만 2 달 이상 3로 감소하기 때문에 아그로 박테 리움 튜메 파시 엔스 잎의 침투에 예를 들어 기반의 일시적 발현 전략은 추가 혜택을 제공한다. 일시적 발현은 기능 상실 돌연변이를 보완하기 위해 또는 단백질 상호 작용 4-6을 조사하기 위해 자신의 능력에 대한 유전자를 테스트하는 기능 분석, 예를 들어 사용됩니다. 그러나, 일시적인 발현은 형질 전환 식물체 7-9의 발현 수준보다 큰 배치 별 편차를 표시하는 경향이있다. 이는 바이오 의약품의 제조 공정은 일시적인 발현 위스콘신에 근거한다는 가능성을 줄여재현성이 중요한 품질 특성과 위험 평가 10 될 수 있으므로 우수 제조 기준 (GMP)의 맥락에서 승인 될 것이다. 이러한 변화는 연구자가 조사하고자하는 모든 상호 작용에 마스크를 적용 할 수 있습니다. 따라서 식물에서 과도 발현 수준에 영향을 고품질 정량적 예측 모델을 구축하는 주요 요인의 동정을 설정.

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Protocol

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1. 미상 전략 계획

  1. 디자인에 포함 관련 요소 및 응답을 확인합니다.
    1. 측정을위한 하나 또는 여러 개의 응답을 정의합니다. 여기서, 2G12 및 DsRed를 발현 수준은 중요한 (각각 10 및 20 ㎍ / ㎖,)로 간주 감지 할 수있는 최소의 차이와 시스템의 추정 표준 편차에 대한 근사값 (4-8 μg을 포함하여 (㎍ / ㎖)를 사용했다 / ㎖, 각각) 이전의 실험에 따라.
    2. 사용 가능한 문학을 사용하여, 이전의 실험 또는 전문 심사 디자인에서 데이터 누구의 충격 응답에 대한 정량화 될 것이다 (표 1) 7,8,19,20 중요한 요소를 선택합니다 (예 : 요인 설계가 도입 참조).
    3. 요소 유형 (숫자 또는 categoric)를 할당하고 숫자 요인은 피해자의 조사 (표 1) 동안 변화 될 내에서 범위를 선택합니다.
    4. NUMERI를 확인C 요인하는 지속적인 변형은 구현하기 어렵다.
      1. 특정 수준으로 정밀하게 조정할 수없는 요인에 대한 지속적인 변화를 사용하지 마십시오. 예를 들어, 배양 온도는 전형적으로 ± 2 ° C 내에서 제어 할 수있는, 그러한 27.2 ° C, 25.9 ° C, 29....

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

다른 발기인 및 5'UTRs를 사용하여 일시적 발현시 DsRed를 축적에 대한 설명 모델

잎 추출물의 형광 DsRed를 재조합 단백질의 발현 수준을 나타 내기 때문에 미상 전략에 대한 응답으로 사용되었다 사용 하였다. 우리가 중요한 고려 최소 검출 가능한 차이가 20 ㎍ / ㎖의이었고 시스템의 추정 표준 편차는 초기 실험을 기준으로 13 ㎍ / ㎖의이었다. 일시적 발현 모델에 포함 된 요인은 문헌 데이터 7,8 우리의 이전 결과 9에 따라 선택되었다. 조사 범위는 이러한 데이터에 따라 선택되었다 (표 1). 적어도 세 레벨 차 기본 모델의 계산을 허용하는 모든 이산 숫자 요인으로 선정 하였다. D-최적 선택 알고리즘이 미상의 선택을 위해 선택되었다 대한 가장 정확한 추정치를 구하는 것이 실행회귀 모델의 계수. 처음 DesignExpert 의해 제안 설계는 90 런 이루어져 있지.......

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Discussion

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자원은 종종 부족하고 비용 때문에 모든 실험은 신중한 계획이 필요합니다. 계획 단계 (예를 들어, 모든 중요한 요소의 상호 작용을 포함하지 않는 기본 모델을 선택)하는 동안 오류가 실질적 결과 모델의 예측 능력을 감소함으로써 전체 실험을 평가 절하 할 수 있기 때문 미상 전략에 특히 사실이다. 그러나 이러한 오류는 쉽게 기본 절차에 따라 피할 수 있습니다.

미상 계획시 고려 사항

첫째, 각 피해자의 실행에 대한 (긍정적이거나 부정적인) 결과를 평가하기에 적합한 응답을 선택하는 것이 중요합니다. 예를 들어 : UV 흡수 (37)에 의해 결정된 표적 단백질의 농도는 특정 프로모터 / 5'UTR 배합의 활성을 평가하는 데 유용하다. 그러나, 단백질의 기능 평가 (예. DsRed를의 경우 형광하거나 CAS있는 단백질에 바인딩그것은 또한 단백질의 품질 측면을 포함하고 있기 때문에 .......

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Disclosures

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출판 비용은 부분적으로 원고 또는 그 내용에 대해 책임을의 준비에 참여에 참여하지 않은 기업 Statease, 주식 회사 (미국)와 Statcon (독일), 후원했다.

Acknowledgements

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저자는이 연구에서 사용 된 담배 식물을 재배의 pPAM 식물 발현 벡터 및 이브라힘 알 Amedi를 제공하는 토마스 박사 Rademacher는에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 원고를 편집하는 그의 도움 박사 리처드 M. 트 와이에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 부분적으로 유럽 연구위원회 고급 그랜트 "미래 제약"에 의해 추진, 제안 번호 269110과 프라운호퍼 Zukunftsstiftung (프라운호퍼 미래 재단).

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
디자인 전문가(R) 8Stat-Ease, Inc.n.a.DoE소프트웨어
TryptoneCarl Roth GmbH8952.2배지 성분
효모 추출물Carl Roth GmbH2363.2매체 성분
염화나트륨Carl Roth GmbHP029.2매체 성분
AmpicillinCarl Roth GmbHK029.2항생제
한천Carl Roth GmbH5210.2미디어 구성 요소
Escherichia coli K12 DH5aLife Technologies18263-012Microorganism
pPAMGenBankAY027531Cloning/expression vector;  
NucleoSpin 플라스미드 MACHEREY-NAGEL GmbH740588.250플라스미드 DNA 분리 키트
NucleoSpin Gel 및 PCR Clean-upMACHEREY-NAGEL GmbH740609.250플라스미드 DNA 정제 키트
NanoDrop 2000Thermo Scientificn.a.분광 광도계
NcoINew England Biolabs Inc.R3193L제한 엔도뉴클레아제
EcoRI뉴잉글랜드 Biolabs Inc.R3101LRestrictionendonuclease
AscI뉴잉글랜드 Biolabs Inc.R0558LRestrictionendonuclease
NEB 4뉴잉글랜드 Biolabs Inc.B7004SRestrictionendonuclease buffer
TRISCarl Roth GmbH4855.3매체 성분
Disodium tetraborateCarl Roth GmbH4403.3매체 성분
EDTACarl Roth GmbH8040.2매체
성분 AgaroseCarl Roth GmbH6352.4매체 성분
Bromophenol blueCarl Roth GmbHA512.1색상 표시기
Xylene cyanolCarl Roth GmbHA513.1색상 표시기
GlycerolCarl Roth GmbH7530.2매체 구성
요소 Mini-Sub Cell GT CellBioRad170-4406겔 전기 영동 챔버
< >Agrobacterium tumefaciens< / i> 균주 GV3101 : pMP90RKDSMZ12365미생물
Electroporator 2510Eppendorf4307000.658Electroporator
쇠고기 추출물Carl Roth GmbHX975.2배지 성분
PeptoneCarl Roth GmbH2365.2매체 성분
SucroseCarl Roth GmbH4621.2매체 성분
Magnesium sulfateCarl Roth GmbH0261.3매체 성분
CarbenicillinCarl Roth GmbH6344.2항생제
KanamycinCarl Roth GmbHT832.3항생제
RifampicinCarl Roth GmbH4163.2항생제
FWD 프라이머Eurofins MWG Operonn.a.CCTCAG GAA GAG CAA TAC
REV 프라이머Eurofins MWG Operonn.a.CCAAAG CGA GTA CAC AAC
2720 열 cycler응용 바이오 시스템4359659Thermocycler
RNAfold 웹 서버비엔나 대학n.a.Software
Ferty 2 MegaKammlott5.220072비료
Grodan Rockwool 큐브 10 x10 cmGrodann.a.Rockwool블록
온실n.a.n.a.식물 재배
PhytotronIlka Zelln.a.식물 재배용
Omnifix-F SoloB. Braun6064204주사기
Murashige 및 Skoog 염DuchefaM 0222.0010미디어 구성 요소
GlucoseCarl Roth GmbH6780.2미디어 구성
요소 AcetosyringoneSigma-AldrichD134406-5GPhytohormon analogon
  BioPhotometer plusEppendorf6132 000.008광도계
Osram cool white 36 WOsram4930440광원
Disodium phosphateCarl Roth GmbH4984.3매체 구성 요소
Centrifuge 5415DEppendorf5424 000.410Centrifuge
Forma -86C ULT FreezerThermoFisher88400Freezer
Synergy HTBioTekSIAFRT형광 플레이트 리더
Biacore T200GE Healthcaren.a.SPR장치
Protein ALife Technologies10-1006항체 결합 단백질
HEPESCarl Roth GmbH9105.3배지 구성 요소
Tween-20Carl Roth GmbH9127.3배지 구성
요소 2G12 항체PolymunAB002Reference 항체
,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fischer, R., Emans, N. Molecular farming of pharmaceutical proteins. Transgenic research. 9, 277-299 (2000).
  2. Commandeur, U., Twyman, R. M., Fischer, R. The biosafety of molecular farming in plants. AgBiotechNet. 5, 9 (2003).
  3. Shoji, Y., et al.

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