방법 논문

부위별 교차결합을 사용하여 분비된 박테리아 독성 인자의 조립 모니터링

DOI:

10.3791/51217

⸱

2013년 12월 17일

 ,  , 
1Genetics and Biochemistry Branch of the National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

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이 기사는 관심 단백질과 E. coli의 다른 인자 간의 상호 작용을 모니터링하기 위해 부위 특이적 광교차결합과 함께 펄스 추적 무선 라벨링을 사용하는 방법을 설명합니다. 기존의 화학적 가교 방법과 달리 이 접근 방식은 살아있는 세포에서 정렬된 조립 경로의 고해상도 "스냅샷"을 생성합니다.

초록

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이 기사에서는 생체 내에서 관심 단백질과 다른 요인 간의 동적 상호 작용을 감지하고 분석하는 방법을 설명합니다. 우리의 방법은 Peter Schultz와 동료들이 처음 개발한 호박 억제 기술을 기반으로 합니다1. 호박색 돌연변이는 관심 단백질을 암호화하는 유전자의 특정 코돈(codon)에 먼저 도입됩니다. 그런 다음 호박색 돌연변이체는 호박 억제 tRNA 및 메타노코커스 잔나스키(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 아미노 아실-tRNA 합성효소(amino acyl-tRNA synthetase)를 암호화하는 유전자와 함께 대장균에서 발현됩니다. 이 시스템을 사용하여 광 활성화 가능한 아미노산 아날로그 p-벤조일페닐알라닌(Bpa)이 호박색 코돈에 통합됩니다. 그런 다음 세포에 자외선을 조사하여 Bpa 잔기를 3-8 Å 내에 위치한 단백질에 공유 결합합니다. 광교차결합은 몇 초에서 몇 분에 이르는 시간 규모에 걸쳐 발생하는 단백질-단백질 상호 작용의 변화를 모니터링하기 위해 관심 단백질의 펄스 추적 표지 및 면역침전과 함께 수행됩니다. 우리는 두 개의 독립적인 도메인, 즉 외막에 통합된 도메인과 세포 외 공간으로 전위된 도메인으로 구성된 박테리아 독성 인자의 조립을 연구하기 위해 절차를 최적화했지만, 이 방법은 원핵 세포와 진핵 세포 모두에서 다양한 조립 과정과 생물학적 경로를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 원칙적으로, 상호 작용 요인 및 관심 단백질에 결합하는 상호 작용 요인의 특정 잔류물조차도 질량 분석법으로 식별할 수 있습니다.

서론

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생물학적 경로에서 단백질의 역할을 정의하고, 단백질의 조립을 이해하거나, 작용 메커니즘을 규명하기 위해 관심 단백질과 다른 세포 구성 요소 간의 상호 작용을 식별하고 특성화하는 것이 종종 필수적입니다. 단백질-단백질 상호 작용을 연구하기 위해 일반적으로 다양한 접근 방식이 사용되지만 모두 한계가 있습니다. 관심 단백질에 결합하는 단백질을 식별하는 가장 간단한 비편향 방법은 copurification(또는 coimmunoprecipitation)이지만, 이 접근 방식을 사용하려면 정제 절차 중에 단백질 복합체가 그대로 유지되어야 합니다. 약하거나 일시적인 단백질 상호 작용은 화학적 가교를 통해 안정화될 수 있지만, 이 방법은 일반적으로 단백질 염기서열에 널리 흩어져 있는 1차 아민을 통해 단백질을 연결하는 화합물을 사용해야 합니다. 해석하기 어려운 복잡한 가교 패턴이 생성될 수 있으며, 특히 관심 단백질이 다중 단백질 복합체의 구성 요소인 경우 더욱 그렇습니다. 더욱이, 화학적 가교제의 스페이서 암은 일반적으로 길이가 10 Å를 초과하기 때문에, 공유 결합은 관심 단백질에 근접해 있지만 직접 상호 작용하지 않는 단백질과 형성될 수 있습니다. 친화성 크로마토그래피 및 2-하이브리드 스크리닝과 같은 방법도 단백질-단백질 상호 작용을 식별하는 데 유용한 경우가 많습니다. 그러나 전자의 접근 방식은 생리학적으로 중요한 상호 작용을 촉진하고 약한 상호 작용을 감지하는 데 사용할 수 없는 조건을 재현해야 합니다. 후자의 접근법은 결합 상호작용이 숙주 유기체에서 복제될 수 있고 관심 단백질과 그 결합 파트너가 융합 단백질의 맥락에 배치될 때 유지될 것을 요구합니다. 또한 2-하이브리드 방법은 거짓 긍정 결과를 생성하는 경향이 있습니다2. 단백질-단백질 상호 작용이 확립되면 상호 작용 부위를 매핑하는 데 상당한 작업이 필요한 경우가 많습니다. 아마도 전통적인 접근 방식의 가장 중요한 단점은 분자간 상호 작용의 시간적 순서나 결합의 동역학에 대한 정보를 제공하지 않는다는 것입니다.

이 논문은 단백질-단백질 상호 작용을 연구하는 데 사용되는 다른 접근 방식의 일부 한계를 극복하는 간단한 방법을 설명합니다. 처음에는 단일 호박색 돌연변이가 관심 단백질을 암호화하는 유전자에 도입됩니다. 그런 다음 호박색 돌연변이는 호박 코돈에서만 광활성성 아미노산 유사체 p-벤조일페닐알라닌(Bpa)을 통합하도록 조작된 메타노코커스 잔나스키(Methanococcus jannaschii)에서 유래한 호박 억제 tRNA 및 아미노 아실-tRNA 합성효소와 함께 공동 발현됩니다3. 장파장 자외선 (UV) 광선 (~ 365 nm)으로 세포를 조사하면 Bpa와 ~ 3-8 Å4,5 이내에있는 단백질 사이의 공유 결합 형성을 촉진합니다. 일부 실험적 맥락에서는 활성화된 Bpa와 지질 및 핵산과 같은 세포의 비단백질 성분 사이에 가교가 형성될 수도 있습니다6. 호박색 코돈에서 종결된 분자는 일반적으로 SDS-PAGE의 전장 단백질과 쉽게 구별할 수 있어야 하며 다른 단백질과 가교결합할 수 없습니다. 가교결합 전에 세포에 펄스 추적 방사성 표지를 적용한 다음 면역침전 또는 친화성 정제 가교 산물을 통해 단백질-단백질 상호 작용의 순서와 기간을 규명할 수 있습니다. 분자간 상호 작용에 대한 시간 정보를 생성하는 능력은 정렬된 다단계 조립, 트래픽 또는 신호 경로를 통해 관심 단백질의 진행을 연구하고 경로 중간체를 식별하는 데 특히 중요합니다. 화학적 가교와 마찬가지로 부위 특이적 가교는 생리학적 조건에서 발생하는 단백질-단백질 상호 작용을 감지하지만, 단일 위치에 가교제를 도입하면 단백질의 개별 세그먼트와 다른 요인 간의 상호 작용을 쉽게 분석할 수 있습니다. 부위 특이적 가교의 이러한 고유한 기능은 관심 단백질이 별개의 결합 파트너와 상호 작용할 가능성이 있는 여러 세그먼트 또는 도메인을 가지고 있을 때 특히 유리합니다. 또한 부위 특이적 가교를 질량 분석법과 같은 방법과 함께 사용하여 단백질-단백질 상호 작용을 매개하는 잔류물을 정밀하게 매핑할 수 있습니다. 이 방법은 대장균에 사용하도록 최적화되어 있지만, 호박색 억제에 의한 photactivatable 아미노산 유사체의 단백질에 통합되는 것은 Mycobacterium, 효모 및 포유류 세포7-11에서 보고되었습니다. 따라서 원칙적으로 우리의 방법은 다른 시스템에서 사용될 수 있습니다.

우리는 E. coli O157:H7 독성 인자인 EspP의 생물 발생을 촉진하는 분자 간 상호 작용을 확인하기 위해 이 방법을 광범위하게 사용했습니다. EspP는 원통형 b 배럴 구조로 접히고 단백질을 외막(OM)에 고정하는 큰 N-말단 세포외 도메인("passenger domain")과 aC-말단 domain("b domain")을 포함하는 "autotransporters"로 알려진 단백질의 슈퍼패밀리의 구성원입니다12. 승객 영역이 OM을 가로질러 전위되는 메커니즘은 오랫동안 미스터리로 남아 왔습니다. 모든 박테리아 세포 표면 단백질과 마찬가지로 EspP는 내막을 가로질러 운반되어야 하고, 주막(내막과 외막 사이의 공간)을 가로질러 이동해야 하며, 일련의 정렬된 이벤트에서 OM을 표적으로 삼아야 합니다. OM을 가로지르는 전좌 후, EspP passenger domain은 또한 단백질 분해 절단에 의해 b domain과 분리되어 세포 표면에서 방출됩니다. 부위 특이적 가교와 펄스 추적 방사성 표지를 결합함으로써 단백질의 두 영역이 초기에 periplasm6에서 분자 chaperone Skp와 상호 작용한다는 것을 보여주었습니다. 그 후, b 도메인의 개별 세그먼트는 Bam 복합체(Bam complex)라고 하는 이질적인 분자와 입체특이적 방식으로 상호 작용하며, 이는 알려지지 않은 메커니즘에 의해 b 배럴 단백질이 박테리아 OM으로 통합되는 것을 촉매합니다. 아마도 가장 흥미로운 것은 승객 영역이 OM13을 횡단할 때 Bam 복합 소단위(BamA) 중 하나와 접촉하고 있다는 것입니다. 우리의 결과를 통해 우리는 자동 수송기 어셈블리14에 대한 세부 모델을 구축할 수 있었고 OM을 가로지르는 여객 도메인 운송에 Bam 단지를 연루시켰습니다.

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프로토콜

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1. 플라스미드 구조

  1. 관심 단백질을 적절한 발현 벡터로 인코딩하는 유전자를 클로닝한 후, 부위 지정 돌연변이 유발 키트를 사용하여 원하는 위치에 호박색 돌연변이를 도입합니다.
    참고: 구조적 정보와 표면 노출 예측은 돌연변이의 위치를 결정하는 데 유용한 가이드 역할을 할 수 있습니다. 호박색 억제 및 가교의 효율성은 상당히 다를 수 있기 때문에 호박색 돌연변이는 여러 위치에 도입되어야 합니다. 더욱이, Bpa는 티로신과 페닐알라닌의 유사체이기 때문에, 단백질 구조와 기능의 섭동을 최소화하기 위해 일반적으로 큰 소수성 아미노산을 암호화하는 위치에 호박색 돌연변이를 도입하려고 합니다. 마지막으로, 발현 벡터를 선택할 때 매우 높은 수준에서 관심 단백질을 과도하게 생산하면 Bpa 통합의 효율성이 제한될 수 있음을 명심하십시오.

2. 문화 준비

  1. 전기천공법을 사용하여 호박색 억제 시스템을 암호화하는 플라스미드(pDULE-p Bpa, refrence4 참조) 및 호박색 돌연변이로 관심 단백질을 인코딩하는 호환 가능한 플라스미드로 적절한 E. coli 균주를 형질전환시킵니다.
  2. 적절한 항생제를 함유한 LB 한천의 플레이트 세포(pDULE-p Bpa를 선택하기 위해 5μg/ml 테트라사이클린 사용). 플레이트 O/N을 37°C에서 배양합니다.
  3. 다음 날, 0.2% 글리세롤, 메티오닌 및 시스테인(40μg/ml) 및 항생제를 제외한 모든 L-아미노산을 포함하는 3-5ml M9 배지14의 단일 콜로니에서 O/N 배양을 시작합니다. 37 °C에서 배양합니다.
  4. 다음 날, O/N을 2,500 x g에서 RT에서 5분 동안 원심분리하여 펠릿 세포로 배양합니다. 5ml의 신선한 M9 배지에 세포를 재현탁하고 원심분리를 반복합니다.
    참고: 이 세척 단계는 O/N 배양의 배지에 존재하는 소량의 b 락타마제(b lactamase)가 상당한 세포 성장이 발생하기 전에 갓 첨가된 암피실린을 분해하기 때문에 암피실린 저항성을 암호화하는 플라스미드를 유지하는 데 중요합니다.
  5. 2ml의 신선한 배지에 세포를 재현탁시키고 분광 광도계(OD550)에서 세포 농도를 측정합니다.
  6. 50ml M9 배지와 항생제가 들어 있는 250ml 삼각 플라스크에 OD550=0.03에서 세포를 추가합니다. 37 °C의 흔들리는 수조에서 배양물을 배양합니다.

3. BPA 설립 및 Photocrosslinking 준비

참고: 아래에 설명된 프로토콜은 세 개의 시점(0, 1, 5분)이 있는 샘플 시간 코스에 대한 것입니다. 다른 수의 시점이 필요한 경우 그에 따라 볼륨을 조정하십시오. 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. 배양액이 성장하는 동안 1M NaOH(100μl 1M NaOH에서 27mg Bpa)의 신선한 1M(1,000x) Bpa 용액을 준비합니다. 용액을 어두운 곳에 보관하기 위해 어두운 벽으로 된 튜브를 사용하십시오.
  2. 배양이 초기 및 중간 로그 단계(OD550=0.2)에 도달하면 각 배양에 50μl 1M Bpa를 추가합니다. 침전을 피하기 위해 플라스크를 휘젓는 동안 Bpa를 한 번에 한 방울씩 추가하십시오. 다음으로, 호박색 돌연변이의 발현을 유도하는 데 필요한 유도 인자를 추가합니다. 추가로 30분 동안 37°C에서 배양물을 계속 배양합니다.
  3. 30분의 유도 시간 동안 6개의 일회용 15ml 원심분리기 튜브에 시간(0분, 1분, 5분)과 "+ UV" 또는 "- UV"를 표시합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  4. 두 번째 얼음 양동이에 얼음을 채우고 얼음 위에 6웰 조직 배양 플레이트를 놓습니다.
  5. 펄스 표지를 위해 높은 비활성(1,000 mCi/mmol) 35S-메티오닌 및 35S-시스테인(또는 두 화합물의 사전 만들어진 혼합물)을 해동하고 추적을 위해 비방사성 L-시스테인 및 L-메티오닌(각각 100mM) 용액을 준비(또는 해동)합니다.
  6. 방사선 라벨링 5분 전에 UV 램프를 켭니다.
    참고: 램프는 멀티웰 플레이트의 샘플에서 ~3-4cm 떨어진 곳에 배치할 수 있도록 조정 가능해야 합니다.
  7. "- UV"라고 표시된 각 튜브와 멀티웰 플레이트의 두 웰에 얼음(~2ml)을 추가합니다.
    알림: 얼음은 5분 시점 직전에 세 번째 우물에 추가해야 합니다. 튜브와 웰에 얼음을 직접 넣어 각 시점에서 세포 내 반응을 즉시 중단하고 특정 생화학 경로의 정확한 "스냅샷"을 얻는 것이 중요합니다.
  8. 30분의 유도 기간이 끝나면 배양액 25ml를 예열된 125ml 일회용 삼각 플라스크에 옮깁니다. 플라스크를 37°C의 흔들리는 수조에 넣습니다.

4. 펄스 추적 라벨링 및 UV 조사

참고: 펄스 추적 라벨링 및 UV 조사 프로토콜에는 적시에 수행해야 하고 상당한 조직과 사전 준비가 필요한 많은 단계가 있습니다. 모든 시약과 튜브는 쉽게 접근할 수 있어야 합니다. 0분, 1분, 5분의 시간 지점이 있는 실험에 대한 프로토콜은 다음과 같습니다.

  1. 시간 0:00 (min:sec)에 배양액 25ml를 125ml 플라스크에 옮깁니다.
  2. 시간 0:30에 30 μCi/ml 방사성 아미노산을 첨가하고 빠르게 소용돌이쳐 섞습니다. 플라스크를 37°C 흔들리는 수조에 넣습니다.
  3. 시간 1:00에 100mM 메티오닌-시스테인 용액 250μl를 첨가하고 빠르게 소용돌이쳐 섞습니다.
    1. 즉시 배양액 4ml를 얼음이 들어있는 냉각된 멀티웰 플레이트의 웰 중 하나에 피펫팅합니다. 두 번째 4ml 분취액을 "0 min - UV"라고 표시된 15ml 튜브에 피펫으로 넣습니다. 플라스크를 수조에 다시 넣습니다.
  4. 시간 2:00 피펫 4ml를 얼음이 들어있는 냉각 된 멀티 웰 플레이트의 두 번째 웰에 넣습니다. "1 min - UV"라고 표시된 15 ml 튜브에 또 다른 4 ml 분취액을 피펫으로 넣습니다.플라스크를 수조에 다시 넣습니다.
  5. 시간 6:00에 배양액 4ml를 얼음이 들어있는 냉각 된 멀티 웰 플레이트의 세 번째 웰에 피펫으로 넣습니다. "5 min - UV"라고 표시된 15 ml 튜브에 또 다른 4 ml 분취액을 피펫으로 주입합니다.
  6. 예열된 UV l 아래에 멀티웰 플레이트가 있는 얼음 양동이를 놓습니다.amp 각 샘플을 4분 동안 개별적으로 조사
    참고: 시점이 최소 4분 간격으로 배치되어 있는 실험에서는 멀티웰 플레이트에 피펫을 삽입하는 즉시 각 샘플을 조사해야 합니다.
  7. 세포를 "0 min +UV", 1 min +UV" 등으로 표시된 냉각된 15ml 튜브에 넣습니다.
  8. 2,500 x g의 원심분리기 셀, 4°C에서 10분 동안
  9. 각 샘플을 300μl M9 배지 또는 PBS에 재현탁하고 33μl 100% 저온 트리클로로아세트산(TCA)을 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. TCA를 마이크로분리에서 최고 속도로 10분 동안 원심분리기하고 상층액을 제거합니다. 이 시점에서 샘플은 -20 °C에서 보관할 수 있습니다.

5. 면역침전 및 가교 산물 검출

  1. 각 샘플에 50μl 가용화 완충액(15% 글리세롤, 200mM 트리스베이스, 15mM EDTA, 4% SDS, 2mM PMSF)을 추가하고 95°C에서 5분 동안 교반하면서 가열하여 침전된 단백질을 가용화합니다.
  2. 1ml 방사성 면역침전 분석(RIPA) 완충액(50mM Tris pH 8.0, 150mM NaCl, 1.0% Igepal CA-630, 0.5% 데옥시콜레이트, 0.1% SDS)을 추가하고 각 샘플의 1/5에서 1/2을 사용하여 표준 면역침전(15)을 수행합니다.
    참고: 더 이상 상업적으로 이용할 수 없는 NP-40 대신 Igepal CA-630(옥틸페닐-폴리에틸렌 글리콜)이 사용됩니다. 두 화합물은 화학적으로 구별할 수 없습니다.
  3. SDS-PAGE로 면역침전된 단백질을 분해합니다. 얼룩, 염색 및 건조 젤.
  4. 겔을 형광체 스크린 O/N에 노출시키고 인광분석기로 방사성 단백질(교차결합 제품 포함)을 검출합니다.

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결과

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우리는 OM으로 이동하는 동안 EspP와 상호 작용하는 단백질을 식별하기 위해 부위 특이적 광교차결합을 사용했습니다. 여기에 표시된 실험에서, 잔기 1113 및 1214의 페닐알라닌 코돈은 호박색 코돈으로 대체되었습니다. 두 위치 모두 OM에 통합되고 멤브레인 앵커 역할을 하는 bdomain에 있습니다. EspPβ 영역(16)의 결정 구조는 두 잔류물이 b 배럴의 주위 쪽에 있지만 ~120°로 분리되어 있음을 보여줍니다(그림 2 및 3의 구조 참조). 대장균 균주 AD20217은 pDULE-P Bpa 및 2개의 EspP 호박색 돌연변이13 중 하나를 인코딩하는 플라스미드(pRI22)로 형질전환시켰다. EspP 합성을 유도하기 위해 IPTG를 첨가한 후 펄스 추적 라벨링을 수행하고 0, 1 및 5분 시점에서 샘플을 수집했습니다. 각 부분 표본의 절반은...

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토론

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이 논문은 관심 단백질과 살아있는 세포의 다른 구성 요소 사이의 상호 작용 역학을 조사하기 위해 부위 특이적 광가교와 펄스 체이스 표지를 결합하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 단백질이 다른 요인과 순차적으로 상호 작용하는 다단계 과정을 연구하는 데 특히 유용합니다. 기존의 화학적 가교 접근법과 달리 부위 특이적 광가교는 관심 단백질의 개별 세그먼트 또는 개별 잔기의 상태에 대한 자세한 정보를 제공합니다. 이 정보는 여러 개의 독립적인 도메인 또는 모듈을 갖거나 여기에 설명된 바와 같이 올리고머 복합체의 별개의 서브유닛과 접촉하는 상대적으로 밀접하게 배치된 잔기를 갖는 단백질의 분석에 특히 유용합니다. 아마도 이 방법의 가장 큰 장점은 다단계 경로의 사건 순서와 단백질-단백질 상호 작용의 동역학에 대한 정보를 제공할 수 있다는 것입니다. 또한, 합성 중에 가교기를 관심 단백질에 통합하면 시간이 많이 걸리는 화학 반응을 수행하고 예측할 수 없는 방식으로 기본 환경을 변경할 수 있는 화학 시약으로 세포를 처리할 필요가 없습니다. 원...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 미국 국립당뇨병연구소(National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
QuikChange II 부위 지정 돌연변이 유발 키트Agilent200521
BPA (H-p-Bz-Phe-OH)BachemF-2800
TRAN35S-LABEL, 대사 라벨링 시약(35S-L-메티오닌 및 35S-L-시스테인, >1,000 Ci/mmol)MP Biomedicals51006
Spectroline SB-100P 초고강도 UV 램프, 365nmSpectronics CorporationSB-110P
Spectroline 교체 전구 100SSpectronics Corporation11-992-15
Falcon 조직 배양 플레이트, 6웰Becton Dickinson Labware353046
일회용 125ml 삼각 플라스크Corning430421
Innova 3100 쉐이킹 수조새 제품 브런즈윅 사이언티픽n.a.

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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