아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.
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방법 논문
아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화
이 논문에서
요약
초록
아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (> 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 - 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.
서론
이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재 생체 내 3-7 미터>. AC의 감작도 (검토를 위해 참고 2 참조) 정신 분열증과 파킨슨 병 등의 D 2와 같은 도파민 수용체를 포함하는 다양한 질병과 관련이있다. 과민 반응의 잠재적 인 중요성에도 불구하고, 정....
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프로토콜
1. 분석 준비 세포의 확장과 냉동 보존
- 문화 CHO-K1-DRD 2L 1.0 μM의 L-글루타민, 800 ㎍ / μL의 G418, 300 ㎍ / ㎕의 하이 그로 마이신, 100 U / μL에게 보충 햄의 F12 미디어에서 15cm 2 세포 배양 접시에 (CHO-D 2L) 세포 페니실린, 100 개 / μL 스트렙토 μg, 10 % 소 태아 혈청 (FBS).
- 세포가 90 % -95 %의 합류 때까지 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 10 ㎕의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 세포 분리 버퍼의 3 μl를 추가하여 세포를 수확 배양액 12 μl를 사용하여 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 센다.
- 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 동결 미디어의 5 μL (10 % 디메틸 설폭 사이드, 90 % F에있는 세포 펠렛을 resuspendBS). 원하는 세포 농도 (예 1-20 × 106 세포 / μL)을 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석.
- 각 cryovial에 셀 솔루션의 ....
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결과
시판 셀 모델을 사용하여 소분자 저해제를 식별하기 위해 384도 이종 감작 분석법 개발 부품 I..
세포 모델에서 이종 과민 반응을 연구하기 위해, 우리는 "혼합 읽기"형식으로 분석을 간소화 할 수있었습니다 개선의 번호를했다. 키의 여러 변형이 아래 강조되고 논의에서 더욱 상세히 설명된다. 첫 번째 중요한 단계는 냉동 보관 된 세포 (26)에 지속적으로 배양 된 세포에서 우리의 세포 배양을 수정했다. 우리는 지금 일상적 × 10 1-20 6 세포 / μL 사이의 농도에서 세포의 배양 배치 냉동 보존 할 수있다. 각각의 분석의 경우, 세포 주식은 해동 희석 계산 한 다음 384 - 웰 플레이트에 직접 도금되어있다. 배양 기간의 필요성을 제거하고 분석의 편리 성을 증가시킨다. 우리의 이전의 민감성 분석의 형식은 48 - 웰, 담배 마는 활용UE 배양 플레이트, 및 세척, 캔트, 전송 단계
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토론
이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 "혼합 및 읽기"높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) "분석 준비"시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 - 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용률 캠프.
우리의 세포 기반 분석을위한 냉동 보존의 채용이 크게 일 실험과 심사 노력에 우리가 하루에 대한 효율성과 재현성을 향상되었습니다. 이러한 접근 방식은 업계 표준으로, 용이 26 설정 학술 연구로 번역 될 수있다. 세포 배양 효율을 향상시키기 위해 세포의 바이알, 해동 희석하고 384 - 웰 플레이트 FO에 직접 도금되는 해당 셀 축적량 「선반 용 시약 off "로 사용각 분석 연구. 우리는 이전 무척추 G 단백질 결.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| CHO-K1-DRD2L 셀 | DiscoveRx | 930579C2 | |
| Ham' s F12 매체 | VWR | SH30026fs | |
| 태아 소 혈청 | VWR | SH3007003 | |
| G418 | 시그마 | A1720 | |
| 하이그로마이신 | 피셔 | 50-230-5556 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 라이프 테크놀로지 | 15070063 | |
| 15cm 접시 | BD 팔콘 | 353025 | |
| DMSO | 시그마 | D2650 | |
| 세포 해리 완충액 | Life Technologies | 13150016 | |
| 인산염 완충 식염수 | Life Technologies | 10010-049 | |
| Cryovials | Fisher | 976171 | |
| Opti-MEM | Life Technologies | 31985070 | |
| TC 처리 384웰 플레이트 | Perkin-Elmer | 6007688 | |
| HTRF cAMP Dynamic 2 kit | Cisbio Bioassays | 62AM4PEB | http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay |
| Synergy 4 | Biotek | H4MLFPTAD | |
| Prism 6 | GraphPad 소프트웨어 | NA | |
| 3-Isobutyl-1-methylxanthine | Sigma | I5879 | |
| (±)퀸피롤 | 시그마 | Q111 | |
| 스피페론 | 시그마 | S7395 | |
| 클로자핀 | 시그마 | C6305 | |
| 할로페리돌 | 시그마 | H1512 | |
| S-(-)설피리드 | 시그마 | S112 | |
| 리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약 | 인비트로겐 | 11668019 | |
| 트리판 블루 | 라이프 기술 | T10282 | |
| 물, DNase 및 RNase가 없는 | MP 바이오메디컬 | 821739 | |
| Gas siRNA | Dharmacon | 맞춤형 siRNA | |
| 비표적 siRNA 제어 | Dharmacon Dharmacon | D-001206-14-20 | |
| siGlo Red | Dharmacon | D-001630-02 |
참고문헌
- Sharma, S. K., Klee, W. A., Nirenberg, M. Dual regulation of adenylate cyclase accounts for narcotic dependence and tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 72, 3092-3096 (1975).
- Watts, V. J., Neve, K. A. Sensitization of adenylate cyclase by....
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재인쇄 및 허가
