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방법 논문

아데 닐 레이트 사이 클라 제의 약물에 의한 과민성 : 작은 분자와 siRNA의 심사 응용 프로그램에 대한 분석 최적화 기술과 소형화

12K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51218

⸱

2014년 1월 27일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Medicinal Chemistry and Molecular Pharmacology, Purdue University, 2Quantitative Biology, Eli Lilly and Company

이 논문에서

요약

아데 닐릴 시클 라제 시그널링의 억제 감작있는 G 단백질 결합 수용체 결과의 지속적인 활성화. 필수 분자 경로를 식별하기 위해 nonbiased 접근이 필요하지만,이 전략은 확장 셀 기반 캠프 민감성 분석의 개발이 필요합니다. 여기서, 우리는 작은 분자 및 siRNA의 검사에 대한 민감성 분석을 설명합니다.

초록

아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC) 신호의 과민 반응은 약물 남용 및 파킨슨 병 등의 신경 정신 및 신경 질환의 종류에 연루되어있다. Gαi / O를 결합 수용체의 급성 활성화는 AC의 활성을 억제, AC의 이종 감작에있는이 수용체 결과의 지속적인 활성화 및 세포 내 cAMP의 수준 증가하는 반면. 이전 연구는 AC의 응답 성이 향상이 D 2 도파민을 포함하고 오피오이드 수용체를 μ Gαi / O를 결합 수용체의 여러 종류의 만성 활성화 다음 시험 관내 및 생체 내에서 모두 관찰되는 것을 증명하고있다. AC의 이종 감작이 처음 사십 년 전에보고했지만,이 현상을 기초 메커니즘 (들)은 크게 알려지지 않은 남아있다. 기계적인 데이터의 부족은 아마도 nonbiased 방법 식별에 도움을 수 있다고 제안,이 적응 응답과 관련된 복잡성을 반영AC의 이종 과민 반응에 관여하는 분자 경로를 보내고. 이전 연구는 AC의 이종 과민 반응을 조절하는 구성 요소를 중복으로 키나제 및 Gbγ 신호를 내포하고 있습니다. AC의 과민 반응과 관련된 독특하고 추가 중복 표적을 확인하기 위해, 확장 성 캠프 민감성 분석의 개발 및 검증은 처리량이 필요합니다. 과민 반응을 연구하는 이전 방식은 연속적인 세포 배양 유지 보수뿐만 아니라 다수의 세척 단계를 포함 cAMP의 축적을 측정하는 복잡한 방법을 포함 일반적으로 복잡하다. 따라서, 384 웰 포맷에서 높은 처리량 스크리닝 (HTS)에 사용할 수있는 강력한 세포 기반 분석의 발전은 미래 연구를 용이하게한다. 두 개의 D 2 도파민 수용체 세포 모델 (예. CHO-D 2L와 HEK-AC6 / D 2L)를 사용하여, 우리는 다섯의 우리의 48 잘 증감 분석 (> 20 단계 4 ~ 5 일) 변환 한TEP, 384 - 웰 형식으로 하루의 분석. 이 새로운 형식은 작은 분자 검사 의무이며, 우리는이 분석의 디자인도 쉽게 대상의 siRNA 라이브러리 심사의 기대에 siRNA를 역 형질 전환을 위해 사용될 수 있음을 보여줍니다.

서론

이종 또는 초 과민성으로 알려진 응답 신호 적응 아데 닐 레이트 사이 클라 제 (AC)를 첫 번째 노벨상 수상자, 마샬 박사 Nirenberg의 연구실에서 발견되었다. 박사 Nirenberg 만성 δ 아편 수용체 활성화 다음 관찰 증가 AC 응답이 아편 내성과 의존성 1에 관여하는 메커니즘이라고 제안했다. 만성 δ 아편 수용체 활성화뿐만 아니라, AC 신호의이 neuroadaptive 응답은 또한 여러 가지 다른 Gαi / O를 결합 수용체 2의 지속적인 활성화 다음 발생합니다. 특히,이 수용체의 대부분은 통증, 신경 정신 및 신경 장애와 연관 μ / κ 아편, D 2 / 4 도파민, 5HT 1A 및 M 2 / 4 무스 카린 수용체 2를 포함한다. 박사 Nirenberg의 발견에 더하여, 기록하는 큰 몸체의 양쪽 만성 오피오이드 수용체 활성화에 AC 신호의 감작을 연결 존재 생체 내 3-7 미터>. AC의 감작도 (검토를 위해 참고 2 참조) 정신 분열증과 파킨슨 병 등의 D 2와 같은 도파민 수용체를 포함하는 다양한 질병과 관련이있다. 과민 반응의 잠재적 인 중요성에도 불구하고, 정확한 메커니즘 (들)은 AC 응답이 크게 알려지지 않은 남아 증가로 연결 지속 Gαi / O를 결합 수용체의 활성화와 관련.

이러한 연구는 중요한 신경 생물학적 대상으로 아데 닐 레이트 사이 클라 제의 민감성에 대한 메커니즘을 조사하기위한 이론적 근거를 제공한다. 마찬가지로, 개별 AC 아형이 적응 응답하여 홀드 8 시그널링 AC의 생리 학적 관련성 및 중요성도 2,9,10을 인식해야한다. 우리의 연구의 맥락에서, AC의 재조합 이소 형의 이종 감작과 관련된 일반적인 특징은 그 특성을 평행 데AC의 내생 이소을 공부 cribed. 특히, 이전의 연구는 Gαi / O 단백질 및 후속 릴리스 / 재 배열 βγ 서브 유닛의 활성화는 모든 AC 이소 형의 수용체에 의한 감작을위한 중요한 요구 사항입니다 것을 발견했습니다. 또한, 여러 연구는 단백질 키나아제 및 Gβγ 서브 유닛에서 신호가 과민성 2,11-13에 참여하는 것이 좋습니다. 개별 ACS는 또한 독특하고 뚜렷한 증감 패턴 (12)을 표시합니다. 밀접한 관련이 AC3는 2 민감하지 반면 예를 들어, 효능에 D 2 수용체의 지속적인 노출은, 칼슘 2 + / 칼 모듈 린의 자극 (14, 15)에 AC1 및 AC8의 과민 반응과 연관되어 있습니다. AC2, AC4, 및 AC7 밀접 단, PKC 자극 AC2 활동이 견고 7,14,16,17을 주작 동근하는 D 2 수용체의 장기간 노출 후 민감하고, 관련이 있습니다. 또한, AC5 및 AC6은 heter의 현저한 정도를 나타냅니다ologous D 2 수용체 14,18-20의 활성화에 다음과 같은 가스와 포스 콜린 자극 캠프 축적에 과민 반응하지만, Gβγ 서브 유닛 - AC에 대한 자신의 요구 사항에 차이가 나타납니다 (21)를 상호 작용. AC 감작의 대부분의 연구 모델 세포주 (예를 들어 HEK293 세포는 각각의 AC 이소 형을 표현하는)를 사용하고 있지만, 이러한 연구 결과는 원시 신경 세포 모델 4,22로 번역 것으로 보인다. 더 최근에, AC 아형을 발현하는 HEK293 세포에서 식별 AC 이소 선택적 소분자 억제제의 효과는 또한 생체 행동 연구 (23)로 변환 할 수있다.

이종 감작위한 식별 분자 메커니즘의 부족 가능성 적응 반응의 복잡성뿐만 아니라 AC가 12 이소 폼의 개별 고유 규제 특성을 반영한다. 그러한 복잡성을 이루는 것이 더욱 성가신 방법론 t의 사용에 의해 복잡모자 공정한 방법을 사용에서 학술 조사를 제한하고있다. 48 잘 조직 문화 형식 (15) - 예를 들어, 우리의 이전의 기계 론적 연구 (24)를 사용하여 지속적으로 배양 세포 모델을 사용하고있었습니다. 배양 된 세포는 일반적으로 48 시간 동안 성장하고 세포 세척 및 배양 일련의 (그림 1) 다음에 효능 약물 치료 (2-18 시간)을 실시 하였다. AC-이소 특정 캠프 축적 프로토콜 캠프 방법론 15,24 바인딩 노동력과 시간이 소요 [3 H]를 사용하여 캠프 축적 측정한다 사용 후했다. 각각의 분석을 위해 처음부터 끝까지 지속 기간은 일반적으로 세포 도금의 데이터 분석 (그림 1)에 4-5일 총이 필요합니다. 새로운 기술과 자동화의 응용 프로그램은 산업 및 HTS 센터 설정에 감작 연구에 표시된 향상되었다. 예를 들어, 케미을위한 국립 센터와 협력 그룹칼 유전체학은 2 하루 1,536 잘 형식 25 μ 오피오이드 수용체에 의한 감작의 작은 분자 억제제를 식별하기위한 분석 절차를 HTS 보도했다.

본 기사는 대부분의 학술 연구 기관에서 사용할 수있는 기술을 사용하여 이종 과민 반응의 연구를위한 HTS 분석을 개발하는 우리의 노력을 설명합니다. 이 전략은 heterologously 내인성 또는 개별 재조합 아데 닐릴 시클 라제 이소 폼 (CHO-D 2L 또는 HEK-AC6 / D 2 L)와 조합 D 2 도파민 수용체를 발현하는 세포 모델에서 냉동 보관 세포의 사용을 통합함으로써 달성되었다. 우리의 처리량을 개선하기 위해, 우리는 기본적으로 "혼합 읽기"이었다 384 - 웰 형식의 5 단계, 하루의 분석에 우리의 48 개 감작 분석 (4-5 일 동안 ca.> 20 단계)를 재 설계. 새로운 형식은 캠프 ACC를 측정하기 위해 시중에서 균일 한 시간 해결 형광 (HTRF) 분석을 사용하여멀티 모드 플레이트 리더와 손상 세포 umulation. 분석은 강력하고 작은 분자 검사 의무, 그리고 효과적으로 이종 과민 반응의 억제에 대한 화면으로 적용 할 수 있습니다. 또, 일반적인 방법으로 오직 사소한 수정을 가진 대상 또는 게놈 와이드 siRNA의 라이브러리 스크리닝 된 siRNA의 형질 감염과 역방향이 분석의 사용을 허용 데이터를 제공한다.

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프로토콜

1. 분석 준비 세포의 확장과 냉동 보존

  1. 문화 CHO-K1-DRD 2L 1.0 μM의 L-글루타민, 800 ㎍ / μL의 G418, 300 ㎍ / ㎕의 하이 그로 마이신, 100 U / μL에게 보충 햄의 F12 미디어에서 15cm 2 세포 배양 접시에 (CHO-D 2L) 세포 페니실린, 100 개 / μL 스트렙토 μg, 10 % 소 태아 혈청 (FBS).
  2. 세포가 90 % -95 %의 합류 때까지 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어. 10 ㎕의 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 세포를 세척하고 37 ℃에서 5 분 동안 세포 분리 버퍼의 3 μl를 추가하여 세포를 수확 배양액 12 μl를 사용하여 세포를 재현 탁하고 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 센다.
  3. 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포 현탁액을 원심 분리기. 뜨는을 대기음 및 동결 미디어의 5 μL (10 % 디메틸 설폭 사이드, 90 % F에있는 세포 펠렛을 resuspendBS). 원하는 세포 농도 (예 1-20 × 106 세포 / μL)을 달성하기 위해 세포 현탁액을 희석.
  4. 각 cryovial에 셀 솔루션의 나누어지는 1.0 μL. -80 ° C 하룻밤에 셀 냉동 컨테이너에 cryovials을 품어. 장기 저장을위한 액체 N 2 탱크에 cryovials을 전송합니다.

2. 분석 준비 세포 (및 역 형질 옵션) 도금

  1. 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에있는 세포의 고정 cryovial을 해동. 세포를 해동되면, 옵티-MEM 15 μl를 함유하는 15 ㎕의 원뿔 튜브에 세포를 전송하고, 튜브 (3)-5X를 반전시켜 혼합한다.
  2. 실온에서 5 분 동안 500 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 기음과 1 ㎕의 옵티-MEM에있는 세포를 재현 탁.
  3. 세포 생존 능력을 결정하고 필요한 경우 (예. 3 × 105 세포 / μL 농도)에서 생존 세포를 희석하기 위하여 트리 판 블루 배제를 이용하여 세포를 세어OPTI-MEM. 플레이트는 조직 배양 세포의 10 μL / 잘은 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트를 처리.
  4. (권장 사항 제조에 따라 - 7 항 참조) 세포에 의해 캠프 생산을 추정하는 표준 곡선을 생성하는 옵티-MEM 캠프의 시리얼 희석합니다. 접시에 10 μL / 잘 캠프 표준의 추가 참고 :. 단일 표준 곡선 분석 플레이트 중 하나에 별도의 판 또는 빈 우물에 제조 할 수있다.
  5. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 1 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다.

3. * siRNA의 형질 옵션 반전

이 섹션에서는 그림 3을 선택하고 관련이 있습니다.

  1. RNA 분해 효소가없는 DDH 2 O (예를 들어 0.4 pmol의 / μL)에서의 siRNA의 솔루션을 준비합니다. 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 5 μl를 추가, 15 SE 100 XG에서 접시를 원심 분리실온에서 C.
  2. (예 : 옵티-MEM 1000 μL에 리포 펙 타민 2000 년 6 μl를 추가), 아래로 pipetting에 의해 혼합 0.006의 요인에 의해 옵티-MEM에서 리포 펙 타민 2000을 희석.
  3. 실온에서 5 분 동안 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 용액을 배양한다. 이미의 siRNA를 포함 384 - 웰 플레이트의 각각의 웰에 희석 리포 펙 타민 2000/Opti-MEM 솔루션의 5 μl를 추가합니다. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.
  4. 실온에서 30 분 동안 플레이트를 배양한다.
  5. (2 절) 전술 한 바와 같이 플레이트 분석 준비 세포. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.
  6. (토론 참조) 노크 타겟 유전자에 대한 결정에 따라 48 ~ 96 시간 동안 37 ° C (5 % CO 2)에 가습 인큐베이터 분석 플레이트를 돌려줍니다.

4. 작은 분자 스크리닝

  1. 옵티에 관심있는 약물 (예. 작은 분자 억제제)를 희석-MEM 원하는 최종 농도의 6 배. 시리얼 희석 휴대용 피펫 또는 액체 핸들링 스테이션을 이용하여 완료 될 수있다.
  2. 시험 화합물을 2.5 μL / 웰을 추가 또는 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰의 측면에, 차량 (예 DMSO)을 함유하는 버퍼.
  3. 실내 온도 (배양는 선택 사항입니다)에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기.

5. 영구 작용제 치료

  1. 600 nm의 옵티-MEM에서 quinpirole 용액 (100 ㎚의 예. 6 번 원하는 최종 농도)를 준비합니다.
  2. 2.5 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 우물의 측에 600 nm의 quinpirole 솔루션을 추가합니다.
  3. 실온에서 15 초 동안 100 XG에서 접시를 원심 분리기, 2 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 37 ° C에서 알을 품다.

6. 캠프 축적의 자극

  1. 2 시간 배양시 stimulati 준비옵티-MEM 용액에. 자극 용액을 40 μM의 포스 콜린으로 구성되어 2 μM 3 - 이소 부틸 -1 - methyxanthine (IBMX) 및 4 μM 스피 페론의 (6 단계의 모든 농도는 원하는 최종 농도의 4 배된다).
  2. 5 μL / 웰의 멀티 채널 피펫을 사용하여 웰 측으로 자극 용액을 추가.
  3. 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.

7. 캠프 축적의 냉각 및 추정

  1. 세포에 의해 cAMP의 생산은 제조업체의 지시에 따라 cAMP를 동적 2 키트를 사용하여 측정된다. 간단히, 증류수 안티 캠프 - 크립 테이트 및 캠프-D2를 재구성. 단기 저장을 위해 -20 ° C에서 분주 동결.
  2. 작업 솔루션을 만들 수있는 제조 업체의 지침에 따라 용해 버퍼에 방지 캠프 - 크립 테이트 중 하나가 나누어지는 개별적으로 캠프-D2 중 하나가 나누어지는을 희석.
  3. 체크인 yyyy 방지 캠프 - 크립 테이트 작업 용액 10 μL / 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 384 - 웰 플레이트에 캠프-D2의 작업 솔루션의 10 μL / 잘.
  4. 실온에서 15 초 동안 100 XG에 플레이트를 원심 분리하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다.
  5. 337 ㎚의 여기를 사용하여 형광 플레이트 리더 (감도 자동 스케일 설정)의 판을 읽고마다 620 ㎚, 665 ㎚에서 배출량을 측정 지침을 제조하고 있습니다.
  6. 당 평가하는 비율 계량 분석을 적용 캠프의 표준 곡선은 지침을 제조하고 있습니다. 결과 값을 사용하여 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트 웰에서 추정 된 cAMP의 축적을 추정.

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결과

시판 셀 모델을 사용하여 소분자 저해제를 식별하기 위해 384도 이종 감작 분석법 개발 부품 I..

세포 모델에서 이종 과민 반응을 연구하기 위해, 우리는 "혼합 읽기"형식으로 분석을 간소화 할 수있었습니다 개선의 번호를했다. 키의 여러 변형이 아래 강조되고 논의에서 더욱 상세히 설명된다. 첫 번째 중요한 단계는 냉동 보관 된 세포 (26)에 지속적으로 배양 된 세포에서 우리의 세포 배양을 수정했다. 우리는 지금 일상적 × 10 1-20 6 세포 / μL 사이의 농도에서 세포의 배양 배치 냉동 보존 할 수있다. 각각의 분석의 경우, 세포 주식은 해동 희석 계산 한 다음 384 - 웰 플레이트에 직접 도금되어있다. 배양 기간의 필요성을 제거하고 분석의 편리 성을 증가시킨다. 우리의 이전의 민감성 분석의 형식은 48 - 웰, 담배 마는 활용UE 배양 플레이트, 및 세척, 캔트, 전송 단계

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토론

이종 과민 반응의 연구를 촉진하기위한 노력의 일환으로, 우리는 광범위하게 우리의 이전 방법 효율적인 달성을 수정했습니다 "혼합 및 읽기"높은 처리량 검사 및 행동 검사의 메커니즘을 수정할 수있는입니다 형식. 다음과 같이 우리의 프로토콜에 큰 변형이 요약 될 수있다 : 1) "분석 준비"시약 등의 동결 보존 세포의 사용, 384 - 웰 포맷으로 분석의 2)의 소형화와, HTRF 둘레 3) 사용률 캠프.

우리의 세포 기반 분석을위한 냉동 보존의 채용이 크게 일 실험과 심사 노력에 우리가 하루에 대한 효율성과 재현성을 향상되었습니다. 이러한 접근 방식은 업계 표준으로, 용이 26 설정 학술 연구로 번역 될 수있다. 세포 배양 효율을 향상시키기 위해 세포의 바이알, 해동 희석하고 384 - 웰 플레이트 FO에 직접 도금되는 해당 셀 축적량 「선반 용 시약 off "로 사용각 분석 연구. 우리는 이전 무척추 G 단백질 결...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

저자는 방법론 교육 및 분석 지침 씨 리처드 아연 토드 Wiernicki을 인정하고 싶습니다. 우리는 또한주의 읽기 및 편집 제안 요한 바오로 스펜스 감사합니다. 이 작품은 국민 건강 MH 060397, 두뇌와 행동 연구 재단과 일라이 릴리의 연구소와 릴리 연구 상 프로그램 (LRAP)를 통해 회사에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
CHO-K1-DRD2L 셀DiscoveRx930579C2
Ham' s F12 매체VWRSH30026fs
태아 소 혈청VWRSH3007003
G418시그마A1720
하이그로마이신피셔50-230-5556
페니실린/스트렙토마이신라이프 테크놀로지15070063
15cm 접시BD 팔콘353025
DMSO시그마D2650
세포 해리 완충액Life Technologies13150016
인산염 완충 식염수Life Technologies10010-049
CryovialsFisher976171
Opti-MEMLife Technologies31985070
TC 처리 384웰 플레이트Perkin-Elmer6007688
HTRF cAMP Dynamic 2 kitCisbio Bioassays62AM4PEBhttp://www.htrf.com/camp-cell-based-assay
Synergy 4BiotekH4MLFPTAD
Prism 6GraphPad 소프트웨어NA
3-Isobutyl-1-methylxanthineSigmaI5879
(±)퀸피롤시그마Q111
스피페론시그마S7395
클로자핀시그마C6305
할로페리돌시그마H1512
S-(-)설피리드시그마S112
리포펙타민 2000 트랜스펙션 시약인비트로겐11668019
트리판 블루라이프 기술T10282
물, DNase 및 RNase가 없는MP 바이오메디컬821739
Gas siRNADharmacon맞춤형 siRNA
비표적 siRNA 제어Dharmacon DharmaconD-001206-14-20
siGlo RedDharmaconD-001630-02

참고문헌

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  20. Watts, V. J., Taussig, R., Neve, R., Neve, K. A. Dopamine D2 receptor-induced heterologous sensitization of adenylyl cyclase requires Gas: Characterization of Gas-insensitive mutants of adenylyl cyclase V. Mol. Pharmacol. 60, 1168-1172 (2001).
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