기본 결합 및 고해상도 질량 분석과 크로 마틴 면역 가교으로 ChroP 접근 방식은 히스톤 수정, 변형 및 기능적으로 구별 염색질 영역에서 시너지 효과가 아닌 histonic 단백질의 복합 단백체 구조를 해부 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
염색질은 다양한 DNA에 의존하는 프로세스를 제어하는 DNA와 단백질로 이루어진 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 특정 지역에서 염색질의 구조와 기능은 전사 인자 및 DNA 메틸화를 포함 히스톤 번역 후 변형 (hPTMs) 및 변종, 크로 마틴 결합 단백질의 지역 농축에 의해 조절된다. 서로 다른 기능 영역에서 크로 마틴 조성물의 프로테오믹스 특성은 지금까지 질량 분석 (MS)에 의해 후속 심층 분석에 적합한 순도와 양에 같은 도메인을 풍부하게하는 효율적인 프로토콜의 부족에 의해 방해되었다. 우리는 여기에 예비 크로 마틴 면역이 그 기능 hPTMs의 측면에서, 변종 공동 관련된 비 histonic 단백질 별개의 염색질 영역을 분리하는 데 사용된다 ChroP (색도 MATIN의 P의 roteomics)라는 이름의 새롭게 디자인 된 염색질 단백질 체학 전략을, 설명 MS에 의해 분석 하였다. 우리는 그가를 설명히스톤 H3상의 라이신 9의 트라이 메틸화의 존재에 의해 표시 전사적으로 침묵 염색질 영역의 농축 및 분석을위한 ChroP의 설정까지 재. 달성 된 결과는 완전히 이질 염색질 프로테옴의 특징과 염색질의 고유 한 단백질 결정의 상호 작용 및 현장 별 구조 및 기능 구성을 설정하는 시너지 효과 방법을 이해하기위한 강력한 분석 전략으로 그것을 증명에 ChroP의 가능성을 보여줍니다.
서론
염색질은 모든 DNA가 중재 프로세스에 대한 기본 템플릿으로 관여하는 매우 역동적 인 핵 단백질 복합체이다. 뉴 클레오 솜은 염색질의 기본 반복 단위이며, DNA의 147 BP는 1, 2를 포장하는 주위에 각 표준 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4, 두 분자를 포함하는 단백질 octameric 코어로 구성되어 있습니다. 모든 핵심 히스톤은 구형 도메인과 뉴 클레오 외부에 돌출 유연한 N-말단 "꼬리"로 구성되어있다. 염색질 구조와 역학을 조절하기위한 중요한 메커니즘 중 하나는 주로 3,4 히스톤의 N-말단에 공유 결합이 발생 번역 후 변형 (PTMS)에 기초한다. 히스톤 변형이 히스톤-DNA 사이 또는 뉴 클레오 간의 접점을 변경함으로써, 고차 염색질 구조를 변경하고, 따라서 DNA 결합 단백질 (시스 메카니즘)의 액세스 가능성을 제어함으로써 어느 작동하거나 dockin 역할을하여규제 단백질, 하나 하나의 단위 또는 다중 체 복합체에 포함 된 같은 G 사이트. 이러한 조절 단백질이 다른 방법으로 그 기능을 발휘할 수있다 : 직접 유전자 발현 (즉, TAF 단백질)을 변조하여, 또는 뉴 클레오 솜 위치 (즉, 염색질 단지를 리모델링)을 변경하거나 다른 히스톤의 잔류 물....
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프로토콜
1. 세포 배양
- 기본 칩의 표준 매체
- 10 % 태아 소 혈청 (FBS), 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5로 보충 된 둘 베코 변성 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포 성장.
- 칩을 가교 SILAC 라벨링
- 10 % 투석 된 FBS, 1 %의 글루타민, 1 % 펜 / Strep의 10 mM의 HEPES pH를 7.5 및 광 L-라이신 (리스 0) 및 L-선택 보충 된 라이신과 아르기닌 고갈 SILAC DMEM 배지에서 HeLa 세포를, 성장 아르기닌 (의 Arg 0) 또는 무거운 대응, L-라이신 (리스 8) 및 L-아르기닌 (의 Arg 10) (자료 표), 각각 73 ㎎ / L, 42 ㎎ / L의 최종 농도.
- 완전한 동위 원소 코딩 아미노산 결합을 보장하기 위해 SILAC 매체에 최대 8 세대에 세포를 성장. 그들은 AC에서 그들을 시드, 1.0-1.5 × 106 세포 / ml의 밀도에 도달했을 때, 이틀 셀 합격oncentration 5 10 × 3의 세포 / ml.
- SILAC 매체의 ....
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결과
크로 마틴 면역 게놈 따라 단백질이나 히스톤 변형의 현지화를 프로파일 링하는 데 사용하는 강력한 기술이다. 프로테오믹스 동등한에서, 칩, 관심의 수정이나 단백질과 함께 면역 침강 "미끼"로 사용되는 정 성적 및 정량적으로 hPTMs, 히스톤 변형 및 염색질 결합 단백질을 식별하는 MS 기반 프로테오믹스옵니다. N-ChroP 접근 방식에서, 염색질이 MNase (그림 1B)로 분해되는 그림 1A, 기본 칩에 설명 된, 별개의 기능 도메인을 염색질 대량의 정화 입력으로 사용됩니다. 모노 뉴 클레오 풍부한 소화 염색질은 특정 항체와 함께 배양하고 immunopurified 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리된다. 예시 된 예에서, H3K9me3, 침묵 염색질 (32, 33)의 마커는 방법을 설정하는 데 사용됩니다. 선택은 사실에 근거 것과 모두 기능적 역할그 단백질 인터랙의 일부가 잘 설명되어 있습니다뿐만 아니라. 또한 본래의 뉴 클.......
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토론
우리는 최근 ChroP, 염색질의 단백질 성분의 대규모 특성화 양적 전략을 설명 하였다. ChroP는 성적인 분야에서 사용되는 두 개의 보완적인 접근 방식, 칩과 MS, 자신의 강점에서 이익과 각각의 한계를 극복을 결합한다. 깊은 시퀀싱 (칩 - 시퀀서)에 결합 된 칩은 몇 가지 뉴 클레오 솜 (35)의 해상도에서 히스톤 수정의 게놈 전체의 매핑을 할 수 있습니다. 자신의 감성에 유리하지만, 항체 기반의 분석은 유사한 수정을 구분하기 위해 자신의 능력과 히스톤 코드 (36)의 조합 측면을 해부 제한됩니다. MS가 hPTMs, 단독 및 조합으로 15에서의 종합적이고 공정한 분석을 제공하면서 한편, 지금까지의 궤적 특정 PTMS 재잘 정보의 필연적 부족 벌크 염색질의 분석에 적용되었다. 우리는 기능적으로 분리 칩의 수정 된 버전을 사용히스톤 PTM 패턴 및 비 histonic 단백질의 특성을 구별 염색질 도메인 및 질량 분석은 특히 공동 충실.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 원래 몰 세포 단백질 체학 (Proteomics)에 출판되었다. SOLDI M. 및 염색질 기능 영역의 Bonaldi T. 프로테오믹스 조사는 고유 이질 염색질 구성 요소 MCP 사이 소설 상승 작용을 보여준다. 2013; 64-80 : 12. © 생화학 및 분자 생물학을위한 미국 사회. 우리는 원고의 비판적 읽기 로베르타 Noberini (기술 및 IEO 이탈리아 연구소, 이탈리아) 감사합니다. TB의 작품은 지오반니 Armenise 하버드 재단 경력 개발 프로그램, 암 연구 및 건강의 이탈리아 정부에 대한 이탈리아 협회에서 교부금에 의해 지원됩니다. MS의 작업은 FIRC 친교에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Lonza | BE12-614F | |
| FBS | Invitrogen | 10270-106 | |
| SILAC DMEM | M-Medical | FA30E15086 | |
| 투석 FBS | Invitrogen | 26400-044 | |
| Lysine 0 (12C6 14N2 L-lysine) | Sigma Aldrich | L8662 | |
| Arginine 0 (12C6 14N4 L-arginine) | Sigma Aldrich | A6969 | |
| 라이신 8 (13C6 15N2 L-라이신) | 시그마 알드리치 | 68041 | |
| 아르기닌 10 (13C6 15N4 L-아르기닌) | 시그마 알드리치 | 608033 | |
| 소세포 뉴클레아제 | Roche | 10 107 921 001 | |
| 완전한, EDTA 무함유 프로테아제 억제제 칵테일 정제 | Roche | 04 693 132 001 | |
| Spectra/Por 3 투석 튜브, 3.5K MWCO, 18mm 평면 너비, 50피트 길이 | Spectrumlabs | 132720 | |
| QIAquick PCR 정제 키트 | QIAGEN | 28104 | |
| Anti-Histone H3 tri-methylated K9-ChIP grade | Abcam | ab8898 | |
| Histone H3 peptide tri-methyl K9 | Abcam | ab1773 | |
| Dynabeads Protein G | Invitrogen | 100.04D | |
| NuPAGE Novex 4-12% 비스-트리스 젤 | Invitrogen | NP0335BOX | |
| 콜로이드 블루 염색 키트 | Invitrogen | LC6025 | |
| LDS 샘플 버퍼 | Invitrogen | NP0007 | |
| Formaldheyde | 시그마 Aldrich | F8775 | |
| Aceti 무수물 -d6 | 시그마 Aldrich | 175641-1G | |
| [헤더] | |||
| 포름산 | 시그마 알드리치 | 94318-50ML-F | |
| 요오드 아세트아미드 ≥ 99% (HPLC), 결정질 | 시그마 Aldrich | I6125 | |
| DL-Dithiothreitol | 시그마 Aldrich | 43815 | |
| 시퀀싱 등급 수정 트립신, 냉동 100 μ g (5 × 20 μ g) | Promega | V5113 | |
| 나노 스프레이 OD 360μ m x ID 75μ m, 팁 ID 8 μ m 코팅되지 않은 Pk 5 | 마이크로컬럼 Srl | FS360-75-8-N-5-C15 | |
| ReproSil-Pur 120 C18-AQ, 3 &마이크로; 엠 15% C | Dr. Maisch GmbH | r13.aq. | |
| 탄소 추출 디스크, 47mm | Agilent Technologies | 12145040 | |
| 양이온 추출 디스크 | Agilent Technologies | 66889-U |
참고문헌
- Kornberg, R. D. Chromatin structure: a repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389, 251-260....
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재인쇄 및 허가
