바이러스 복제를 측정하는 시험 관내 분석에서 크게 루시페라아제 또는 생물 발광 가능한 다른 효소를 발현하는 재조합 RNA 바이러스의 개발에 의해 개선되었다. 여기 세부 홍역 및 화학 도서관에서 폭 넓은 스펙트럼 항 바이러스를 분리하기 Chikungunya의 바이러스와 같은 재조합 균주를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을.
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이 논문에서
요약
초록
RNA 바이러스는 독감, 기관지염, 뎅 그열, C 형 간염 또는 홍역과 같은 주요 인간의 질병에 대한 책임이 있습니다. 그들은 또한 때문에 점점 더 많은 자연 생태계를 관통 증가 세계적 교류와 인간의 인구의 신흥 위협을 나타냅니다. 이러한 새로운 상황의 좋은 예는 인도양 2005에서 2006 사이의 Chikungunya의 바이러스 전염병이다. 바이러스 복제를 제어하는 세포 경로에 대한 우리의 이해의 최근 진행되는 호스트 세포의 기능을 대상 화합물은, 오히려 바이러스 자체보다, RNA 바이러스의 대형 패널을 억제 할 수있는 것이 좋습니다. 일부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 화합물은 호스트 목표 지향적 인 분석으로 확인되었습니다. 그러나, 세포 배양에 바이러스 복제의 억제를 측정하는 것은 판독으로 세포 변성 효과의 감소를 사용하는 것은 여전히 가장 중요한 검사 방법을 나타낸다. 이러한 기능적인 스크린에는 크게 리포터를 발현하는 재조합 바이러스의 개발에 의해 개선 된 주 효소이러한 루시퍼 같은 생물 발광의 pable. 본 보고서에서는 세부 광범위한 스펙트럼 항 바이러스 프로필과 화합물을 식별하기 위해, 재조합 홍역 및 세포 생존 능력의 분석과 Chikungunya의 바이러스를 결합하여 높은 처리량 검사 파이프 라인을,.
서론
RNA 바이러스는 인간 감염의 큰 다양성에 대한 책임이 있으며, 공공의 건강과 경제적 비용의 측면에서 전 세계적으로 인구에 큰 영향을 미친다. 효과적인 백신은 여러 가지 인간의 RNA 바이러스에 대해 개발되어 널리 예방 치료로 사용됩니다. 그러나 RNA 바이러스 감염에 대한 치료 약물의 중요한 부족은 여전히있다. 사실, 효율적인 백신은 뎅 그열 바이러스, C 형 간염 바이러스 또는 인간의 호흡기 세포 융합 바이러스 (hRSV) 등 주요 인간의 병원체에 대해 사용할 수 없습니다. 게다가, RNA 바이러스로 인해 글로벌 교류와 생태계에 대한 인간의 영향의 빈도가 증가하고 새로운 질병의 대부분에 대한 책임이 있습니다. RNA 바이러스를 나타내는이 위협에 대해, 우리의 치료 아스날은 매우 제한적이며 1-3 상대적으로 비효율적이다. 현재 치료는 본질적으로, 선천성 면역을 자극하는 재조합 I 형 인터페론 (IFN-α / β)를 기반으로또는 리바비린의 관리. 이 리보 아날로그의 작용 모드가 논란이 아마 다양한 메커니즘에 의존하고 있지만, 세포 내 GTP 풀을 고갈 휴대 IMPDH (이노신 인산 탈수소 효소)의 억제, 4 명확 필수적이다. 리바비린은 페 길화 된 IFN-α와 결합, C 형 간염 바이러스에 대한 주요 치료입니다. 그들이 효율적으로 무딘 IFN-α ....
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프로토콜
화합물과 96 웰의 딸 플레이트 1. 준비
- 실내 온도 -20 ° C에서 DMSO 화학 화합물의 10 mM의 주식 솔루션을 포함하는 96 - 웰 어머니 플레이트를 이동합니다. 희석 화합물은 2 ㎜에서 중간 96 - 웰 희석 판을 얻기 위해 DMSO에 5 배. 희석은 DMSO 20 ㎕로 5 μl를 피펫과 혼합하여 얻을 수있다.
- 피펫 흰색, 바코드 조직 문화 96 - 웰 플레이트의 마른 우물에 희석 플레이트에서 1 μL. 보조 플레이트 (D1)이 첫 번째 세트는 20 μM의 최종 농도에서의 화합물의 독성을 평가하는 데 사용된다. -20 ° C까지 사용에 보관 딸 접시.
- DMSO와 혼합 36 μL로 희석 플레이트에서 4 μl를 피펫으로 다시 1:10 화합물을 희석. 흰색, 편평한 바닥, 바코드 조직 문화 96 - 웰 플레이트의 마른 우물에 피펫 1 μL. 딸 플레이트 (D2)의 두 번째 세트는 MV의 replicatio의 억제를 평가하는 데 사용됩니다2 μM의 최종 농도에서 화합물에 의한 N. -20 ° C까지 사용에 보관 딸 접시.
2. 세포 배양의 제조 화합물의 독성을 확인하는
- 37 ° C에서 HEK-293T 세포를 성장, 5 % CO 2
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결과
이 검사 파이프 라인은 MV 복제를 억제하는 화합물의 선택에 첫 의존하고 중요한 세포 독성 (그림 1, 기본 화면)을 표시하지 않습니다. 그것은 세포 독성과 바이러스 복제 억제를 결정하는 루시 페라 기반의 분석을 활용합니다. 모든 피펫 팅 단계 및 데이터 수집은 로봇 플랫폼 높은 처리량 설정에서 수행 될 수있다.
화합물의 세포 독성은 대사 활성 셀에 대응하는 존재하는 ATP의 정량을 기반 문화에서 살아있는 세포의 개수를 계산 루시페라아제 기반 생존력 분석을 이용하여 평가된다. 루시 페라으로 루시페린의 산화가 ATP에 의존하기 때문에, 발광 신호. 그림 3a는 한 대표 심사 플레이트 결과를 보여주는 살아있는 세포에 의해 제공 세포 ATP에 직접적으로 비례한다. 예상했던대로, 매우 독특한 루시 페라 제 활동 값은 지표 성과가 있었다IGEPAL 살해 살아있는 세포 나 죽은 세포 하나를 포함 제어 우물에서 에드. 임계 값은.......
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토론
여기에서 설명하는 심사 파이프 라인은 RNA 바이러스의 광범위한 스펙트럼 억제제로서 적절한 프로필과 화합물을 선택 목표로하고있다. 10,000 화합물의 라이브러리가이 프로토콜 및 상기 필터링 기준이 적용된 함께 상영되었을 때, 75 %, 40 화합물 (0.4 %)으로 우수한 MV 복제 즉, 억제는 긍정적 인 기록했다. 게다가, 이들 중 절반은 루시페라아제 기반 생존력 분석에서 어떤 독성을 보였으며, 이러한 이유로 무시 하였다. 마지막으로, 더 많은 양의에서 쉽게 사용할 히트 다스가 다시 테스트했다. 이 작은 세트는 쉽게 셀룰러 독성과 용량 - 반응 실험에서 MV 및 CHIKV에 대한 바이러스 복제의 억제 (그림 4)에 다시 테스트했다. 선택한 모든 화합물의 항 바이러스 활성을 확인하고,이 검사 파이프 라인의 전체 식별 히트 비율은 1.3 ‰이었다. 이 점수는 다른 높은 처리량과 다른 그룹에 의해 얻어진 결과와 매우 유사하다항 바이러스제 27,32, 및 (1-5 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
감사의 글
우리는 그의 결실의 의견과 제안 박사 이브 L. JANIN 감사합니다. 우리는 그녀의 기술 지원을 CHIK / 랜 C. Combredet에 HH 갓에게 감사의 말씀을 전합니다. 파스퇴르 만성 질환 Infectieuses (POV에 프로그램의 STING 및 HM--이 작품은 파스퇴르 연구소, 센터 내셔널 드 라 공들인 Scientifique (CNRS), 문화원 국립 드 라 상테 동부 표준시 드 라 공들인 Médicale (INSERM), 문화원 카르노에 의해 지원되었다 L), 직원은 국립 라 공들인 POV에 (ANR-RPIB, 프로그램 STING 2.0), 그리고 "헌법위원회 지역 일 드 프랑스"(화학 도서관 프로젝트를 부어, 보조금은 N I 06-222 / R을 ° 및 I HM-L에 09-1739는 / R.). CHIKV / 르네의 작품은 프로젝트 ArbOAS에 의해 지원되었다 (ANR 보조금 2010 INTB - 1601-02).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Freedom EVO 플랫폼 | TECAN | 로봇 플랫폼 | |
| 96웰 폴리스티렌 세포 배양 마이크로플레이트, 흰색 | Greiner Bio One | 655083 | |
| CellTiter-Glo 발광 세포 생존도 분석 | Promega | G7570 | 루시퍼라제 기반 생존력 분석 |
| Bright-Glo 루시페라제 분석 시스템 | Promega | E2610 | 반딧불이 루시페라아제를 함유한 시약 기질 |
| Renilla-Glo luciferase 분석 시스템 | Promega | E2710 | Renilla luciferase 기질을 함유 |
| 시약 Britelite plus Reporter 유전자 분석 시스템 | Perkin-Elmer | 6016761 | 반딧불이 luciferase 기질을 함유하는 시약. Brigh-Glo 시약의 대안으로 사용하여 루시퍼라제 활성을 측정할 수 있습니다. |
참고문헌
- De Clercq, E. Antiviral drugs in current clinical use. J Clin Virol. 30, 115-133 (2004).
- Debing, Y., Jochmans, D., Neyts, J. Intervention strategies for emerging viruses: use of antivirals. Curr Opin Virol. , (2013).
- Leyssen, P., De Clercq, E., Neyts, J.
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재인쇄 및 허가
