방법 논문

깁슨 조립 및 유전자 총을 사용하여 담배 일시적인 유전자 발현

DOI:

10.3791/51234

⸱

2014년 4월 18일

 ,  ,  , 
1Synthetic Biology Platform, Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, 2Department of Systems Biology, Harvard Medical School, 3Department of Biotechnology, Delft University of Technology

이 논문에서

요약

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이 작품은 선택적으로 바이오 래드 유전자 총을 사용하여 정량, 식물의 세포 내 소기관을 대상으로하기위한 새로운 방법을 설명합니다.

초록

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여러 세포 내 소기관으로 단백질을 단일 타겟하기 위하여, 식물은 일반적으로 중요한 유전자를 복제하고, 차동 촉진제 및 / 또는 신호 서열을 포함한 복잡한 규제 전략을 사용하여 개별적으로 각각의 유전자 표현. 대사 엔지니어와 특정 세포 기관에 효소를 표적에 관심이 합성 생물학은 도전에 직면하고 있습니다 : 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 동일한 유전자를 여러 번 복제해야합니다. 이 작품은이 전략에 대한 솔루션을 제공합니다 :의 mRNA의 스 플라이 싱을 활용. 이 기술은 설립 엽록체와 퍼 옥시 대상 시퀀스를 활용하고 선택적으로 접합되어 하나의 mRNA로 결합. 일부 스플 라이스 변종은 세포질에 퍼 옥시 일부, 일부, 엽록체로 전송됩니다. 여기에 시스템은 여러 세포 기관이 스 플라이 싱 타겟팅을 위해 설계되었습니다. 이 작품에서는, GFP는 EXPR이 될 것으로 예상했다합리적으로 설계된 5 '의 mRNA 태그 일련의 엽록체, 세포질 및 페 록시에 essed. 이 태그는 이종 유전자가 여러 세포 내 소기관으로 표현 될 필요가있을 때 요구 복제의 양을 줄일 수있는 가능성이있다. 구문은 전작 11에 설계되었으며, 깁슨 조립체, 제한 효소를 필요로하지 않는 결찰 독립적 클로닝 방법을 사용하여 클로닝 하였다. 얻어진 플라스미드는 변형 된 유전자 총 프로토콜 benthamiana 표피 된 담배 잎 세포에 도입 하였다. 마지막으로, 형질 전환 된 잎은 공 초점 현미경으로 관찰 하였다.

서론

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이 작품은 식물 세포가 여러 세포 기관에서 리포터 단백질을 발현하도록 설계하지만, 단 하나의 DNA 구조를 가진 것을 특징으로 대사 공학 / 합성 생물학 프로젝트입니다.

둘 이상의 위치로 단백질을 표적으로하는 하나의 접근법은 여러 복제 유전자 사본 다른 지역화 펩티드를 포함하는 각을 포함한다. 각 복사본은 하나의 변환 1을 역 교배에 의해, 또는 연속 재 변환에 의해 도입, 또는해야합니다. 이 추가 복제를 포함하고, 말단 당 하나의 지역화 태그에 의해 제한됩니다.

여러 위치에 단백질을 집중하는 또 다른 방법은 다른 접합 2-5을 통해서이다. RNA는 단일 유전자로부터 전사되지만, 전 사체의 다른 복사본은 셀 당 하나 이상의 방법으로 종종 다르게 처리된다. 이것은 단일 유전자로부터 전사 셀에 둘 이상의 메신저 RNA가 발생할 수있다. 이러한 다양한 MESSENGER RNA를 동일한 단백질의 상이한 이소 형을 위해 인코딩 또는 틀 이동, 모두 다른 단백질의 경우에 할 수있다. 대안적인 스 플라이 싱은 수년 동안 문헌에 기술되어 있지만, 작업 및 보존 공여체 및 수용체 스플 라이스 위치의기구는 더 최근 6 해명되고있다. 이 사이트는 더 나은 기술되고있다, 그들은 엔지니어링에 대한 기회를 엽니 다.

여러 소기관의 단백질을 발현 할 때 식물 대사 엔지니어는 도전에 직면하고 있습니다. 하나 이상의 세포 기관에 국한되어 단백질의 경우, 엔지니어는 관심의 세포 기관에 지시 별도의 신호 순서와 동일한 유전자 각을 여러 번 복제해야합니다. 세 소기관에 단일 유전자의 경우, 이는 단순히 세 유전자이다. 그러나 여섯 유전자 대사 경로에 대해,이 18의 유전자 복제 상당한 노력을 확장합니다. 하나의 대안 - 접합 유전자 기호에 여러 현지화 시퀀스를 결합ificantly이 노력을 줄일 수 있습니다. 예를 들어, 리엔지니어링 광호흡 7,8 및 이소 프레 노이드 합성 9,10는 엽록체와 퍼 옥시 솜을 모두 포함한다. 자연 애기 장대 시스템에서 관찰로 우리의 경우에 우리는 이전 6 설명 스플 라이스 사이트를 이용했다. 우리는 이성적으로 만 자연 스플 라이스 사이트를 떠나 mRNA의 순서를 재 설계하지만, 대안 - 접합 인트론 (그림 1)에서 엽록체 또는 퍼 옥시 타겟팅 태그를 인코딩 할 순서를 배치. 발현 된 단백질 또는 인코딩 사전의 mRNA는 인트론 (그림 1g 및 1H)로 적출 여부에 따라 태그가있을 수도 있고 없을 수도 있습니다. 이 연구에서 제시 한 구조의 설계에 대한 자세한 내용은 관련 기사 11를 참조하십시오.

이것은 여전히​​ 상당한 클로닝 노력 깁슨 조립체, DNA 구조를 클로닝하기위한 새로운 방법이므로, U는건설에 나오지. 깁슨 방법에 관계없이 제한 부위 (그림 2) 12 ~ 14의 모든 순서에 사용될 수있다. 효소의 특정 혼합 한 단계 등온 조립을 허용한다. 이 방법에서는, 몇개의 이중 가닥 선형 DNA의 부품들은 50 ~ BP의 겹치는 서열을 갖도록 설계된다. 깁슨 조립체 효소 믹스는 부분적 상동 서열의 단일 가닥을 노광, 선형 DNA의 부분 소화. 이러한 부분적인 단일 가닥 서열은 신속한 원스텝, 순서에 관계없이, 결찰 미사용 서브 클로닝 반응의 결과, 반응 혼합물에 재 어닐링된다.

이 작품은 식물의 엽록체, 퍼 옥시 솜 및 cytosols의 표현을위한 1) 합리적인 설계 대안 접합 구조를 설명, 2) 자신의 복제 깁슨 어셈블리의 새로운 결찰없는 방법을 사용, 3) 유전자 총을 가진 담배 잎의 세포에 자신의 배달하고, GFP 관찰로, 세포 기관 타겟팅을 보여주는 4) 결과및 공 초점 현미경.

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프로토콜

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대상으로 여러 세포 기관에 대한 대안 - 접합 시퀀스의 1. 디자인

  1. 최종 단백질 발현을위한 사이트를 확인합니다. 이 작품의 경우, 관심이 엽록체, 퍼 옥시 및 세포질을 대상으로합니다.
  2. 관심의 세포 기관에 단백질을 표적으로하는 것으로 알려진 단백질과 DNA 시퀀스를 식별하기 위해 문학을 사용합니다. 이 경우 엽록체는 애기 장대의 L-isoaspartate의 methyltransferase 6,15에서 순서를 대상으로하고, 애기 장대 트랜스 티 레틴 같은 S-알란토인 합성 효소 (16, 17)에게로부터 순서를 대상으로하는 페 록시가 결정되었다.
  3. 정확한 세포 기관의 관심 단백질을 대상으로해야 대안 - 스 플라이 싱 정권을 확인합니다. 자연 애기 시스템 6 관찰이 작품의 경우, 사이트를 접합. mRNA의 서열은 천연 스플 라이스 사이트를 떠나기 재 설계되었지만, 시퀀스는 인코딩 엽록체 또는 peroxis을 넣었다대안 - 접합 인트론 내 태그 (그림 1) 오메 타겟팅.

DNA 파트 2. 깁슨 조립

그림 2를 참조하십시오.

깁슨 조립체 법) (1)에 미리 만들어진 혼합 여러 효소의 작용에 따라 부분적으로 단일 가닥 및 DNA 부분을 인접한 2) 어닐링 무료 염기쌍을 만들기 위하여 이중 가닥 DNA의 끝을 소화. 이는 제한 부위의 제한없이 DNA 단편의 클로닝을 허용한다.

  1. DNA 플라스미드 구조의 요소에 대한 주문을 선택합니다. ) 플라스미드 식물, 카나마이신 저항성 마커에서 작동하는 것으로 알려진 GFP 구조를 포함하는 벡터 (기공, 대장균 및 아그로 박테 리움이 호스트를 투메 파시 엔스), B)에 대한 복제의 기원 : 예를 들어 TriTag-1의 요소가 프로모터 서열, (P ENTCUP2, 식물의 구성적인 것으로 표시), c) 시퀀스 (CTS)를 대상으로 엽록체, c) 페 록시) 이전 6 바와 같이 스플 라이스 위치의 일련의 시퀀스 (PTS), 및 D 타겟팅.
  2. 구조의 기초를 위해베이스 실리 디자인 소프트웨어를 디자인합니다. 원숭이는이 작업에 유용한 오픈 소스 프리웨어 패키지입니다.
    참고 : TriTag-1, 순서가 : 플라스미드 벡터, 프로모터, ATG, 스플 라이스 기증자 사이트, 엽록체 표적 서열, 스플 라이스 기증자 사이트, 중립 사이트, 스플 라이스 수용체 사이트, 퍼 옥시 대상 시퀀스 결합 수용체 사이트, GFP 플라스미드 벡터에 포함 된 .
    1. PCR 프라이머를 주문하면 각 조각 사이에 50 bp의 중첩이되도록에 실리 DNA의 구조를 설계합니다. 25 bp의 각 방향 :이 프라이머로서 50 bp의 중첩을 사용하는 것이 가능하다.
      1. 시퀀스의 각 조각의 기원을 추적해야합니다. 그것은과 같습니다 : 성장과 miniprepped하는 플라스미드; PCR의 주형으로서 사용할 수있는 선형 서열; 또는해야합니다 순서상업적으로 합성? 몇몇 회사는 단편 <500 BP에 대한 저가의 DNA 합성 서비스를 제공합니다. 상업적으로 주문하는 것이 유익이 경우에, TriTag 자체는 437 BP입니다.
      2. 모든 조각이 PCR 증폭과 자신의 템플릿 DNA에서 정제하는 경우 가장 좋은 결과가 올 것이다. 저항 마커보다 쉽게​​ PCR 증폭 두 개의 작은 템플릿으로이 큰 DNA를 나눌 수있는 좋은 장소입니다.
      3. 제한 제한 효소 DpnI는 메틸화 된 DNA를 잘라냅니다. PCR 템플릿은 E.에서 미니 프렙 인 경우 대장균, DpnI 처리는 오염 템플릿 DNA를 제거합니다.
  3. 별도로 모든 DNA 서열을 정화하고 물, TE 또는 버퍼 EB에 용출.
    1. 기공 벡터 1 부 ~ 3,000 BP (녹색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
    2. 기공 벡터 부분 2 ~ 3,000 BP (검은 색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
    3. TriTag 삽입, 437 BP (파란색 화살표). 상업적으로 주문했다. Resuspend DDH 2 O.에서
    4. P의 ENTCUP 프로모터 ~ 750 BP (주황색 화살표). PCR 증폭과 DpnI 치료.
  4. DNA 조각의 각각의 농도를 측정한다. 벡터 조각 150 NG / μL을 목표로.
  5. 냉장고에서 깁슨 어셈블리 믹스의 나누어지는를 타고 얼음 해동. 이 실험실 12-14에서 만들 상용, 또한 간단합니다.
    1. 점성 배 마스터 믹스 15 μl의 반응 크기의 1.33 배 분량 씩이 조리법에 두 단계가 있습니다. 배의 마스터 믹스는 포함한다 : 3 ㎖ 1 M 트리스 - 염산의 pH 7.5, 300 ㎕의 1 M MgCl2를 각각의 dNTP 600 μL 10 밀리미터, 300 ㎕의 1 M DTT, 1.5 g PEG-8000, 20 밀리그램 NAD 및 DDH 2 6 ML에 O. 320 ㎕의 분취 량 (18)를 준비하고 -20 ° C.에 하나를 제외하고 모두 동결 이 솔루션은 매우 점성이 될 것입니다. 이러한 "배 등온선 버퍼를"레이블
    2. (320 μL)를, 나머지 하나에, 1.2 ㎕의 T5 엑소 뉴 클레아 제, 20 μL Phusion 높은-FID를 추가elity DNA 중합 효소, 160 μL의 Taq DNA 리가 제 700 μL의 DDH 2 O. 15 μL 씩 분주 (~ 80) -20 PCR 튜브 및 저장소에있는 얼음에 °를 준비 C.
  6. 각 조각의 몰량에 대한 볼륨을 결정합니다. Gibthon.org을 포함하여 몇 가지 온라인 계산기가 있습니다. 모든 DNA 조각의 5 μL의 총이 있어야합니다. 깁슨이 나누어지는 혼합 15 μL에 추가합니다. 이 피펫에 너무 작은 볼륨을 필요로하는 경우, DNA 조각을 희석 및 / 또는 하나 이상의 나누어지는을 사용합니다.
    1. 혼자 벡터 DNA의 제어를 준비 (항생제 내성 마커를 포함하는 예를 들어 DNA 부분)와 물을 사용하여 볼륨을 구성하는 것을 잊지 마십시오.
  7. 30~60분에 대한 50 ~ 55 ° C에서 열 자전거 타는 사람에 튜브를 품어. 얼음에 교체 한 E.로 변환 열 충격을 화학적으로 유능한 세포를 통해 대장균. electrocompetent 세포를 사용하지 마십시오. 높은 염 농도와 비교적 낮은 DNA 농도세포가 아크의 원인이 될 수 있습니다.
    1. 200 ㎕의 칼슘 염화물의 상업 준비 관할 E.보기에 20 μl를 적용 대장균.
      42 ° C에서 30 분 얼음과 열 충격 60 초에 품다
    2. 얼음 2 분으로 돌아 750 μL의 SOC 또는 LB 매체를 적용하고 37 ℃에서 microcentrifuge 관 30 분에 흔들리는 복구 LB + 칸 (또는 다른 적절한 항생제)의 혼합물과 적절한 희석 플레이트. 이것은 기존의 결찰 기반 복제보다 더 높은 배경 (및 비 표적 재조합 이벤트의 높은 숫자)이 발생할 수 있지만 약 10 식민지를 화면에 가치가있다.
  8. 순서를 통해 클론을 확인하고, -80 ° C에서 나누어지는 저장

유전자 총과 담배 3. Biolistic 형질

이 조브 18, 19 년에 설립 된 기술이다. 주요 단계와의 차이는 아래에 설명되어 있습니다.

  1. 50 ~ 100 ㎖의 E.을 성장 공동리 또는 200 ㎖의 아그로 박테 리움. 맥시 예비 학교 문화를. 약 1,500 NG /의 농도는 ㎕를 계속해야합니다.
  2. 전술 한 바와 같이 유전자 총 글 머리 기호를 준비합니다. 유전자 총에로드.
  3. 는 담배 benthamiana 담배 잎의 표피 조직의 형질를 들어, 3 개월 이전 공장의 기본에 가까운 큰 잎을 선택합니다. 조심스럽게 잘라 15cm 페트리 접시에 젖은 종이 타월에 바닥면을 위로 놓습니다.
  4. 200 ~ 250 PSI에 유전자 총을 그는 압력을 설정합니다.
  5. 조심스럽게 약 3-5센티미터 그 위에, 잎의 아래쪽에 갈비뼈 사이의 유전자 총을 목표로하고 있습니다. 안전을 해제하고 잎에 입자를 제공합니다. 각 탄환은 잎에 동일한 위치에 두 번 사용될 수있다. 잎 폭발은 버리고 시작하면 새 잎이 잎의 인성에 어떤 변화로 인해 같은 12 cm 잎의 경우, 약 6 탄에 맞게 기대 등 나이, 습기 등의 성장 조건이다.
  6. 의 상단으로 덮여 잎을 저장,벤치에 낮은 조명에서 2 ~ 3 일 배양 접시.
  7. UV 형광 장착 된 해부 현미경 잎을 검사하고 GFP를 표현하는 각각의 세포를 검색합니다. 잎 5 ~ 10 밀리미터 섹션을 해부하다.
  8. ~ 200 ㎕의 0.1 % 트리톤 X-100에서 깊은 우물 현미경 슬라이드에 잎을 담근다. 세제는 표면에 형성되는 기포를 방지하고, 깊은 웰 현미경 슬라이드는 큰 조직 이미징 영역을 허용한다.

트랜 조직 4. 공 초점 현미경

이 지침은 모든 기기에 따라 다를 수 있으므로 제대로 훈련을 얻을하는 것이 필수적입니다.

  1. 형광 검출 실험을 위해, 489 nm의 여기 레이저를 설정하고, GFP의 형광 및 엽록소 자동 형광을위한 630-700 nm의에 대한 500-569 nm의 광전자 증 배관 탐지기를 설정합니다. 40X 물 침지 목표를 사용하여 이미지 세포.

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결과

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디자인 노력은 중요한 계획의 결과였다. 이 프로젝트에 대한 소설은 발현 된 단백질로 번역되는 사전의 mRNA를 만들 수있는 스 플라이 싱의 사용이다. 이들 단백질은,이 경우, 다른 세포 기관에서 발현되는 엽록체, 페 록시 및 / 또는 시토 졸. 우리는 선택적으로 6 접합되어 자연 애기 장대의 유전자를 적응하고, (TriTag-1과 TriTag-2) 대체 엑손의 시퀀스를 대상으로 엽록체 6 페 록시 17 알려진 배치했다. TriTag-3 엽록체 시퀀스의 복잡도가 낮은 영역 내에 포함 된 페 록시 신호로 구성된다. 이들은 GFP (그림 1) 프레임에 배치했다.

시퀀스 GFP를 표적 PIMT2 유전자 06 엽록체 및 페 록시로부터 네이티브 대안 접합 섭생 및 플라스미드 백본 : 본 연구에 사용 된 플라스미드 따라서 몇 가지 요소를 포함 하였다...

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토론

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본 연구에서는 단순한 전략은 식물의 여러 세포 구획에 단일 유전자 변형 단백질을 지역화에 대해 설명합니다. 목표는 담배 benthamiana에 하나 이상의 소기관으로 단일 유전자를 발현 할 구조물을 설계하는 것이었다. 전략은 합리적 GFP 기반의 DNA 구조의 설계, 깁슨 조립, 유전자 총을 가진 잎의 세포에 플라스미드의 전달 및 공 초점 현미경과 결과의 관찰이 (가) 있습니다.

세 가지 짧은, N-말단 태그 (11)를 대상으로 동시 엽록체, 퍼 옥시과 세포질을 위해 설계되었습니다. 이러한 "TriTags"는 엽록체 플러스 세포질 6 퍼 옥시 플러스 세포질 (17) 중 하나에 인코딩 된 단백질을 직접 선택적으로 접합의 mRNA를 인코딩하는 자연 발생의 DNA를 결합하여 설계되었다. TriTag-3 플라이 싱에 의존하고있는 NA 엽록체 대상 시퀀스로 구성하지 않는turally 구조화되지...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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저자는 담배 benthamiana 모종의 관대 한 기부에 대한 매사 추세 츠 종합 병원의 젠 쉰에게 감사의 말씀을 전합니다. 젠 부시 대통령은 식물 성장 및 성장 챔버 영역을 설정하는 조언에 크게 도움을주었습니다. Wyss 다음 연구소의 톰 Ferrante의 공 초점 현미경에 중요한 도움을 제공했다. 저자는 특히 보스턴 아동 병원의 돈 Ingber과 유전자 총과 관련된 공급의 관대 한 기부에 대한 Wyss 다음에 연구원에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트에 대한 자금 조달은 PAS, JCW 및 MDM에 대한 에너지 고급 연구 프로젝트 기관의 부 (ARPA-E 상 # DE-000079)와 협력 계약을 통해 제공되며, Chimerion 생명 공학, 주식 회사를 통해 MJV에 대한했습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
올리고뉴클레오티드 프라이머IDT(맞춤형)GeneBlocks
IDT(맞춤형)500bp 올리고뉴클레오티드
ApE 소프트웨어U Utah(다운로드)http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
MinElute 키트Qiagen28004PCR 제품 정제에 사용
QIAprep 스핀 miniprep 키트Qiagen27104가진 플라스미드
Phusion 마스터 믹스NEBM0532S관심 유전자를 PCR 증폭하는 데 사용
Gibson 어셈블리 반응 믹스NEBE2611L다음 9 가지 성분의 마스터 믹스
1 M Tris-HCl pH7.5TeknovaT1075Gibson 어셈블리 믹스
1 M MgCl2G Biosiences82023-086Gibson 어셈블리 믹스
dNTP 믹스FermentasR0192Gibson 어셈블리 믹스
1 M DTTFermentasR0861Gibson 어셈블리 믹스
PEG-8000Affymetrix19966Gibson 어셈블리 믹스
NADApplichemA1124,0005Gibson 어셈블리 믹스
T5 엑소뉴클레아제진원지T5E4111KGibson 조립 혼합물
Phusion polymeraseNEBF530SGibson assembly mix
Taq DNA ligaseNEBM0208LGibson assembly mix
Gibthon.org계산 단순화를 위한 웹사이트
Plasmid PLUS Maxi kitQiagen12963유전자 총 총알의 DNA를 준비하는 데 사용
Gene Gun systemBioRad165-2451필요한 모든 부품 포함
Nicotania benthamiana(n/a)(n/a)Gift of Jen Sheen, MGH
컨포칼 현미경LeicaSP5 X MP결과 세포의 이미징
Deep well slidesElectron Microscopy Sciences71561-01컨포칼 이미징에 사용
플라스미드 편집기(ApE) 유타 http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape
Gibthon:결찰 계산기http://django.gibthon.org/tools/ligcalc/
GC 완충액을 의 클로닝을 준비하는 데 사용됩니다 대학교

참고문헌

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  13. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 12-16 (2009).
  14. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  15. Lowenson, J. D., Clarke, S. Recognition of D-aspartyl residues in polypeptides by the erythrocyte L-isoaspartyl/D-aspartyl protein methyltransferase. Implications for the repair hypothesis. The Journal of Biological Chemistry. 267 (9), 5985-5995 (1992).
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  17. Reumann, S., et al. Proteome analysis of Arabidopsis leaf peroxisomes reveals novel targeting peptides, metabolic pathways, and defense mechanisms. The Plant Cell. 19 (10), 3170-3193 (2007).
  18. Woods, G., Zito, K. Preparation of gene gun bullets and biolistic transfection of neurons in slice culture. J. Vis. Exp. (12), (2008).
  19. Hollender, C. A., Liu, Z. Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) Assay for Protein-Protein Interaction in Onion Cells Using the Helios Gene. (40), (2010).
  20. Li, M. Z., Elledge, S. J. Harnessing homologous recombination in vitro to generate recombinant DNA via SLIC. Nature Methods. 4 (3), 251-256 (2007).

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재인쇄 및 허가

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태그

GFP

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