방법 논문

테스트

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⸱

DOI:

10.3791/51241

⸱

2014년 6월 12일

 ,  , 
1Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-6265 CNRS, 2Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, UMR-1324 INRA, 3Centre des Sciences du Goût et de l'Alimentation, Université de Bourgogne

이 논문에서

요약

우리는 Y-미로 분석을 사용하여 초파리의 행동에 냄새 물질의 영향을 나타 내기 위해 선택 테스트를 제시한다.

초록

동물은 자신의 생존을 보장하는 환경에서 신호를 검출하는 것은 필수적이다. 이 목표로, 그들은 직접 접촉을 통해 이상 범위에서 동작하는 휘발성 분자에 대한 응답을 나타냅니다 후각을 통해, 같은 시각, mechanoreception, 청각, 맛을 통해 chemoperception 등의 환경 신호를 사용합니다. 휘발성 화학 분자 위험, 음식의 소스, 또는 개인 간의 통신의 검출에 대부분의 동물에 매우 중요한 신호입니다. 초파리는 후각의 세포 및 분자 기초를 탐구하는 과학자에 대한 가장 일반적인 생물학적 모델 중 하나입니다. 이 작은 곤충의 후각 능력을 강조하기 위해, 우리는 고전적인 마우스와 함께 사용되는 Y-미로 시험에 기초하여 수정 된 선택의 프로토콜을 설명합니다. Y-미로로 얻은 데이터는 더 나은 동물들은 끊임없이 변화하는 환경에 대처하는 방법을 이해하는 데 유용한 정보를 제공합니다. 우리는 공부를 단계별 프로토콜을 소개합니다이 Y-미로 분석을 사용하여 비행 탐색 응답에 냄새 물질의 영향.

서론

맛이나 후각을 통해 Chemoreception 동물의 생존을위한 중요한 감각 양상이다. 그것은 중요한 위험 또는 음식 소스의 검출에 필요한 신호뿐만 아니라 사회적 상호 작용을 제공한다. 또한 자신의 재생에 필요한 섹스 파트너를 찾기 위해 동물을하는 데 도움이됩니다. 20 년 이상, 노벨상은 "후각 수용체와 후각 시스템의 조직의 그들의 발견에 대해"2004 년 리처드 악셀과 린다 벅에 의해 작업 경력을 포함하여 집중적 인 연구는 분자 및 세포 기지를 나타 내기 위해 수행 된 후각, 2.

후각 인식을 해부하는 과학자의 마음에 드는 동물 모델 중 하나는 D.입니다 의 melanogaster. 이 곤충은 포유 동물과 유사한 세포 및 분자 냄새 코딩 전략을 공유한다. 과학계는이 과일 파리에있는 방향제의 역할을 연구하기 위해 다양한 행동 패러다임을 사용합니다. 이 테스트는 courtshi으로 복합 분석을 포함후각 등 다양한 감각 양식이, 남성의 구애 3을 유도하는 것이 중요합니다 P 테스트합니다. 다른 분석은 더 구체적 방향제의 역할을 해결하기 위해 개발되었다; 이들은 T-미로, Y-미로 트랩 분석, 4 개의 필드로 경기장과 바람 터널 4,5,6,7,8 있습니다.

이 문서에서 우리는 D를 사용하여 강력한 후각 응답을 제공하는 간단한 수정 된 Y-미로 분석을 제시 의 melanogaster. 우리의 셋업은 이전에 설명한 방법 9에 반대의 최종 팁을 사용합니다. 따라서, 우리의 Y-미로는 두 가지 장점이 있습니다. 파리가 그녀의 선택을 한 후에 첫째, 시스템의 반환을 방지 할 수 있습니다. 둘째, Y-미로의 모든 영역에서의 냄새 물질의 교환을 제한한다. 초파리는 종종 취제 포화를 방지하는 데 사용되는 공기 흐름에 매우 민감하기 때문에이 마지막 이점은 중요하다. 공기의 흐름과 실험 장치를 조정하려면 시간과 비용이 소모 될 것이다. 따라서, 우리의 Y-미로 분석은 EF를 나타냅니다ficient 초파리의 후각 성능을 테스트하는 빠른 방법.

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프로토콜

1. 시작하기 전에

  1. 안정적이고 강력한 행동 표현형 베어링 isogenized 기준 재고를 사용합니다. 모든 잠재적 인 컨트롤 이기종 배경 대립 유전자를 전달할 수 있기 때문에,이 주식을 선택에 대한 일반적인 규칙은 없다.
  2. 이후 단계에 필요한 다른 모든 주식을 역 교배이 컨트롤 변형을 사용합니다. 이 교잡 단계는 일반적으로 2 ~ 3 동질 기준 남성 5에 (가능한 횡단 오버 상동 염색체 사이에 허용하는) 하나의 처녀 여성의 적어도 5 연속 십자가로 표시됩니다. 이 단계는 다른 비행 주식 사이의 유전 적 배경을 균질화하는 것이 중요합니다.
  3. 25 ℃에서 12 시간 빛 / 어둠주기 항생제 (0.4 % 메틸 파라 하이드 록시 - 벤조 에이트) 보완 표준 옥수수 가루 (9 %), 효모 (10 %), 한천 배지 (1.5 %)에 초파리의 주식을 유지 ° C.
  4. 온도 제어 방까지 붉은 빛 아래 (25 ℃)에서 화학 감각 실험 달성(시각적 단서의 기여를 제거하고, 화학 감각 신호에 집중). 정기적으로 각 실험 사이의 영역을 환기하는 방의 공기를 갱신.

Y-미로 분석을 사용하여 2. 후각 응답

  1. 테스트 전에 젖은 종이 타월을 포함하는 유리 튜브에 25 ° C에서 16 ~ 18 시간 동안 파리를 굶어.
  2. 두 개의 유리 병에 더 작은 플라스틱 병 (로드 유리 병)에 Y 형 커넥터에 가입하세요. 세 개의 작은 유리 병에 커넥터를 연결하고 밀봉 Y-미로를 얻기 위해 거품 마개를 통과 1 ㎖ 피펫 팁을 사용합니다. 두 개의 "함정"튜브를 형성하기 위해, 하나의 피펫 팁의 넓은 끝이 "로드"를 형성하기 위해 (그것의 결정을 일단 비행의 반환을 방지하기 위해 1 ~ 2 mm 직경) 두 피펫 팁의 좁은 끝을 잘라 관 (그림 1A).
  3. 다만 "함정"병 (그림 1B)를 연결하기 전에, 한 ~ 6mm 직경의 필터 종이를 배치각각의 병. 한 여과지에 부 취제 용액 40 μL 및 제 2 필터 종이에 대응하는 용매의 40 μL를 추가.
  4. "로드"유리 병에 열 4~9일 된 파리를 소개합니다. 이 동작을 10에 강한 효과를 가지고 있기 때문에,이 전송 중에 CO 2 마취를 사용하지 마십시오. 오히려 얼음에 간단한 냉각을 사용합니다. 마취 파리의 적절한 조작 최대한 피사체에 스트레스를 제한하는 것이 중요하다.
    1. 시각적 자극에게 최대한 방지하기 위해 (가능한 열원을 제한하는 LED 전구를 사용하여) 원적외선 빛 아래에서 25 ° C에서 Y-미로 일련의 테스트를 수행합니다. (; 그림 1C 왼쪽, 또는 오른쪽에 악취 물질 함유 튜브 및로드 관 앞이나 뒤에있는) Y-미로의 방향을 교대로주의하십시오.
    2. 파리에 대한 몇 시간이 악취 물질 또는 용매를 포함하는 트랩 유리 병에 입력 할 수 있습니다. participati을 높이기 위해 24 시간 후 파리를 계산에 80 % 이상까지 최대 후각 인덱스 값 (Simonnet, 개인 통신)을 제공한다.
    3. - /로드 파리의 총 수 (용매 튜브 수 냄새 튜브 번호) : 다음과 같은 공식을 사용하여 그 결과 후각 인덱스를 계산합니다.
  5. 세척 Y-미로 셋업 다음과 같이 하룻밤 RBS 35 MD의 해체 셋업을 흡수. 철저하게 수돗물로 헹구어. 마지막으로 탈 이온수로 세척하고 건조 할 수 있습니다.

데이터의 3. 통계 분석

  1. 데이터 및 변수들에 따라 t-테스트, 일방향 ANOVA 또는 양방향 ANOVA를 수행한다.

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결과

그림 1D이 Y-미로 분석을 사용하여 두 개의 대표적인 응답을 보여줍니다. 그들은 크게 10 % 페닐 아세트산을 피하지 않는 반면, 주-S의 남성은 강하게, 증류수에 희석하여 10 % 초산을 피하십시오. 이러한 분석은로드 유리 병에 함께 배치 복제 당 10 명의 남성을 기준으로합니다. 이 프로토콜은 때때로 평균의 큰 표준 오차가 발생할 수 있습니다. 필요하다면, 대신 단지 10. 수학적으로, 한 개인의 선택은보다 큰 샘플 크기 인덱스 값에 더 낮은 가중치가 건 반복 실험 당 20 명의 남성을 사용하여 이러한 단점을 줄일 수있다.

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토론

우리의 Y-미로 프로토콜은 이전에 설명한 프로토콜 9를 기반으로합니다. 그러나, 우리는 두 가지 주요 차이점을 소개합니다. 첫째, 우리는 그들이 용매 또는 용매 플러스 악취 물질을 포함하는 유리 병에 입력하는 것을 결정하면 돌아가는 비행을 방지하기 위해 좁은 피펫 팁을 사용합니다. 이 좁은 팁은 Y-미로의 악취 물질의 확산을 제한하는 데 유용합니다. 둘째, 우리는 Y-미로에 입력하는 파리를 강제로 작은로드 유리 병을 사용합니다. 이들 파리의 높은 참여하는 것이 중요합니다 (24 시간 후 100 %로 80 %를, Simonnet, 개인 통신).

이 Y-미로 분석은 초파리에서 화학 감각 반응을 평가하기위한 효율적인 테스트를 나타냅니다. (등 공기의 흐름에서,로드 단계 동안 파리의 조작) 파리에 스트레스를 포함하여 시험의 상황은 잠재적으로 자신의 후각 반응에 영향을 미치는 있습니다. 이러한 환경 문제는 중요하며 적어도 부분적으로, 왜 다른, 설명...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는 원고를 개선하기 위해 자신의 작품에 대해 4 익명의 검토를 부탁드립니다. 우리는 MBG과 YG에 재정적 지원 센터 국립 드 라 공들인 Scientifique, 감사 및 MMS에 Université 드 부르고뉴 및 연구의 프랑스 교육부. YG의 실험실에서 연구는 유럽 연구위원회 (ERC 그랜트, GliSFCo-311403 시작), 직원은 국립 드 라 공들인 (ANR-JCJC, GGCB-2010), 헌법위원회 지역 드 부르고뉴 (페이버) 및 CNRS에 의해 투자된다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
드로소필라 폴리스티렌 튜브VWR 유럽734-225530 x 25 mm 
Y-미로
초파리 붕규산 튜브Dijon verre95 X 25 mm
Y-미로
폼 스토퍼Dutscher999038
Y-미로
Y-형 커넥터Europrix11020605
Y-미로
100-1,000 &마이크로; l 피펫 팁Corning4868다음 피펫 팁을 Y자형 커넥터에 연결합니다. 넓은 끝에서 65 mm 떨어진 곳에서 2개의 피펫 팁을 자르고, 좁은 끝을 연결하십시오 ( ∼ 2mm 개구부)를 2개의 테스트 바이알에 연결합니다. 이 구멍은 파리가 냄새가 나는 튜브에 들어가면 U턴을 제한합니다. 와이드 엔드에서 35mm 떨어진 곳에서 피펫 팁 1개를 잘라 로딩 바이알에 연결합니다.
Y-maze
Far-Red LED 전구Rubin-Lacaque0RB180238625-630 nm
아세트산Sigma-Aldrich45725
페닐아세트산Sigma-AldrichP16621
효모센시언트 맛 스트라스부르1018880464
옥수수 가루eurogermFarine de maï s
한천KalysHP-697-25
메틸 하이드록시 4 벤조 에이트 VWR 국제25605293

참고문헌

  1. Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5, 263-278 (2004).
  2. Silbering, A. F., Benton, R. Ionotropic and metabotropic mechanisms in chemoreception: 'chance or design. EMBO Rep. 11, 173-179 (2010).
  3. Ziegler, A. B., Berthelot-Grosjean, M., Grosjean, Y. The smell of love in Drosophila. Front. Physiol. 4, (2013).
  4. Silbering, A. F., et al. Complementary function and integrated wiring of the evolutionarily distinct Drosophila olfactory subsystems. J. Neurosci. 31, 13357-13375 (2011).
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  8. Budick, S. A., Dickinson, M. H. Free-flight responses of Drosophila melanogaster to attractive odors. The Journal of Experimental Biology. 209, 3001-3017 (2006).
  9. Martin, F., Charro, M. J., Alcorta, E. Mutations affecting the cAMP transduction pathway modify olfaction in Drosophila. J. Comp. Physiol. A. 187, 359-370 (2001).
  10. Barron, A. B. Anaesthetising Drosophila for behavioural studies. Journal of Insect Physiology. 46, 439-442 (2000).
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