방법 논문

연속 흐름 Microspotter을 사용하여 수정 된 표면에 세포의 침수 인쇄

DOI:

10.3791/51273

⸱

2014년 4월 22일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Wasatch Microfluidics, 2Department of Mechanical Engineering, University of Utah

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 3D 미세유체 프린팅 기술은 수중 표면에 세포 배열을 인쇄합니다. 우리는 세포 배열이 3D 플로우 셀에서 수중 표면에 미세유체적으로 전달되는 방법을 설명합니다. 물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생성되었습니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

마이크로어레이 응용 분야를 위한 세포 인쇄는 인쇄 후 생리학적으로 관련된 세포 표현형을 유지하는 문제, 원하는 세포의 열악한 조직 및 분포, 어레이의 대상 영역에 약물 및/또는 영양소를 전달할 수 없는 문제 등 중요한 문제를 가지고 있습니다. 당사의 3D 미세유체 프린팅 기술은 자동화되고 다중화된 방식으로 수중 표면에 세포 어레이를 밀봉하고 인쇄할 수 있는 고유한 능력을 갖추고 있습니다. 미세유체 세포 어레이(MFCA) 3D 유체공학의 설계를 통해 프린트헤드 팁을 액체로 채워진 우물 또는 접시로 낮추고 표면에 대해 압축하여 밀봉을 형성할 수 있습니다. 프린트 헤드의 부드러운 실리콘 팁은 개스킷처럼 작동하며 압력을 가하거나 뒤로 물러나서 되돌릴 수 있는 밀봉을 형성할 수 있습니다. 핀 또는 잉크젯 프린터와 같은 다른 셀 인쇄 기술은 물에 잠긴 응용 프로그램에서 인쇄할 수 없습니다. 수중 표면 프린팅은 세포의 표현형을 유지하고 재료 표면 특성을 방해하지 않고 표면에서 이러한 세포를 모니터링하는 데 필수적입니다. 물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 암, 당뇨병, 염증, 감염 및 심혈관 질환을 포함한 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생산됩니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

제약 산업의 최근 발전은 약물 검사 및 cytotoxicological 분석 1,2,3의 약물 발견 과정에서 세포 마이크로 어레이를 사용하여 증가 된 관심을 이끌고있다. 세포의 마이크로 어레이를 사용하여 시험 관내 높은 처리량 분석 및 스크리닝 방법의 개발이 신속하고 비용 효과적인 약물 후보의 개발뿐만 아니라, 미리 셀 1,4의 기본적인 이해를 용이하게한다. 세포 검사에 대한 전통적인 접근 방식은 기존의 잘 플레이트 플랫폼을 사용한다; 그러나이 접근법으로 인해 높은 비용, 제한된 처리량 및 세포 기능에 대한 정량적 정보 1,5 제한적 기능으로 제한된다. 때문에 이러한 제한, 세포 마이크로 어레이 기술의 연구는 분자 생물학적 특성, 조직 공학, 약물 검사의 1,6에 급성장하고 있습니다. 셀룰러 마이크로 어레이의 장점은 더 작은 샘플 사용, 최소한의 영향을 포함세포의 표현형의 이질성 정보를 마스킹, 그리고 더 높은 처리량 응용 프로그램 -1,7,8,8에 대한 분석을 자동화하는 가장 중요한 기능입니다.

제약 산업은 현재 마이크로 웰 플레이트 9 약물 검사에 대한 2 차원 세포 단층 배양과 높은 처리량 세포 기반 스크리닝 분석을 이용한다. 마이크로 플레이트의 우물에서 다중 세포는 독특한 실험 옵션을 더 높은 처리량에 대한 가능성을 제공합니다. 또한, 세포 마이크로 어레이에 대한 현재의 기술은 세포가 극적으로 생체 내에서 10, 11에서 세포의 표현형을 변경할 수있는 건조 할 수 있습니다. 이러한 문제를 극복하기 위해, MFCA는 설계하고도 1에 도시된다. MFCA 차원 유체의 디자인이 욕에 하강과 시일을 형성하는 표면에 대해 압축하는도 1의 프린트 헤드 칩을 가능하게한다. 프린트 헤드의 부드러운 실리콘 팁처럼 동작가스켓 가역 씰을 형성한다. MFCA 기술은 고유 세포 배양 및 조직 슬라이스 시스템 모두에 필요한 잠긴 표면과의 인터페이스에 적합하고, 대부분의 다른 접근 방식을 가진 어렵거나 불가능하다. 핀 또는 잉크젯 인쇄가 작동하지 않습니다, 그리고 2 차원 마이크로 유체 장치는 증착 또는 개별 관광 명소의 큰 배열과 인터페이스에 적합하지 않습니다. 또한, 실험 소형화 및 지역화로 - 세포 마이크로 어레이 - MFCA는 높은 처리량 세포 기반 스크리닝 분석과 관련된 주요 문제를 극복한다.

CFM은 표면 (12, 13)에 미세한 반점 위치에 사이클 작은 양의 유체 샘플에 3D 채널 네트워크를 사용합니다. 흐름과 함께 인쇄함으로써, 생체 분자, 세포 및 다른 시약은 현재 셀의 인쇄 기술을 방해하는 공기에의 노출없이 민감한 생체 분자와 세포의 인쇄를 가능하게 프린팅 프로세스에 걸쳐 액체 환경에서 유지된다. 이 어레이 표면에 캡처 메커니즘이 이러한 하이 브리 도마 또는 제공 상청액 같은 조질 물질로부터 직접 인쇄하는 것도 가능하다. 이 원고의 목적은 표면에 상세히 두 세포 유형의 잠긴 인쇄를 설명하는 것이다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 문화 제조 예 셀로

  1. 사용 준비가 될 때까지 액체 질소에 NIH/3T3 세포 주식을 저장합니다.
  2. 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 10 % 소 태아 혈청, 10 mM의 HEPES 완충액, 50 단위 / ㎖ 페니실린 및 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용 NIH/3T3 세포에 대한 완전한 미디어를 준비한다.
  3. 37 ℃에서 진탕 수조에서 2 ~ 3 분 동안 세포를 해동
  4. 3 분 1,500 XG에 완전한 미디어와 원심 분리기 5 ㎖의 세포를 Resuspend.
  5. 세포 펠렛을 방해하지 않고 세포의 상층 액을 제거합니다.
  6. 미디어 5ml에 세포를 재현 탁하고 혈구 세포를 사용하여 계산.
    1. 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 세포 현탁액과 장소의 10 μl를 제거합니다.
    2. 세포 현탁액에 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 피펫의 끝으로 저어.
    3. 피펫 혈구 실에 염색 된 세포의 10 μL.
    4. 배에서 혈구 세포를 계산확대.
      1. 9 큰 사각형의 4의 살아있는 세포 (작은 흰색 공)을 계산합니다. 만 트리 판 블루 염색에서 진한 파란색을 표시하지 않는 살아있는 세포를 계산합니다.
      2. 세포 본래 세포 현탁액 × 104 세포 / ml의 수의 결과, 대형 사각형 당 세포의 평균 수를 계산한다.
      3. 1 배 각각 T25 플라스크에 5 ㎖의 총 5 개의 세포 / ml의 밀도로 시드 세포.
    5. 시작 실험 전에 70 %와 80 %의 포화 상태 사이에 문화의 세포. 필요에 따라 2-3 일마다 미디어를 새로 고치거나.

2. 인쇄 표면 처리

  1. 마크 조직 문화 처리 된 폴리스티렌 (TCTPS) 12 웰 플레이트의 하단에 마커로 사각형 프린트 헤드 (x 19mm 7mm)의 크기.
  2. 피펫 (50) 사각형 영역에 소 태아 혈청의 μL 및 팁 전체 영역에 그것을 확산.
  3. 페트리 접시를 남겨살균 바이오 안전성 후드 O / N의 혈청 자리가 완전히 건조 할 수 있도록합니다. 이 접시는 사용하기 더 이상 2 일 이상 전에 준비를해야합니다.

3. 머지 인쇄

  1. 증류수로 프린트 헤드를 씻어.
    1. 증류수로 60mm 페트리 접시를 채우고 표면에 프린트 헤드를 고정.
    2. 공기 펌프를 사용하여 150 μL / 분에서 2 분 동안 각 라인을 통해 증류수 흐름.
    3. 페트리 접시에서 물을 버리고 깨끗한 물을 채운다.
    4. 물에서 아래로 3 회를 프린트 헤드를 이동합니다.
  2. 사전 준비를 12 웰 플레이트에서 혈청 코팅 자리에 프린트 헤드 중심을 도킹합니다.
  3. 프라임 사전 예열 완료 미디어, 채널 당 300 μL와 프린트 헤드.
  4. 인쇄 표면에 50,000 세포 / ml의 농도와 60 μL / 분, 채널 당 100 μL에서 세포를 중단.
  5. 에 도킹 왼쪽 프린트 헤드를 올려 놓고표면 및 세포 배양 인큐베이터에서 매니 폴드는 2 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C로 설정합니다.
  6. 2 시간 배양 한 후, 프린트 헤드를 제거하고 배양 접시에 뚜껑을 놓습니다. 프린트 헤드를 제거하는 시간은 0 시간 시점으로 간주됩니다.

4. 표준 세포 배양

  1. 2 단계에서 제조 된 혈청 발견 TCTPS 12 - 웰 플레이트 중 하나에 미리 예열 미디어 1 ML을 추가합니다.
  2. 12 잘 TCTPS 판의 하나의 우물에 2 단계 피펫에 남아있는 세포 현탁액 1 ㎖를 가져 가라. 이 접시에 50,000 세포를 포함하는 문화를 생성합니다.
  3. 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에서 세포 배양 접시를 놓습니다.
  4. 2 시간 배양 타이밍을 시작하면; 인쇄 및 시드 샘플 사이의 일관성을 위해이는 0 시간 시점으로 간주됩니다.

5. 문화의 시각화

  1. 0, 2, 24, 두 가지 방법에서 각각 48 시간 걸릴 세포 D 후표준 거꾸로 현미경을 사용하여 위 및 이미지 escribed.
    1. 요오드화 프로피 듐 만 사균의 핵으로 혼입되어 적색 형광 염색을 이용하여 세포를 염색.
      1. 부드럽게 칼슘과 이물질을 제거하기 위해 마그네슘 (PBS + +)와 인산염 완충 생리 식염수 1 ㎖로 세포를 3 회 헹군다.
      2. 각 배양 용기에 미리 예열 PBS + +의 1 ML을 추가합니다.
      3. 각 배양 용기에 프로피 디움 요오드 원액 (1 ㎎ / ㎖) 1 μl를 추가합니다.
      4. 10 분 동안 37 ° C에서의 propidium 요오드화 염색 세포를 품어.
    2. 이미지 반전에서 10X 및 40X 현미경 배율을 이용하여 세포.
  2. 적절한 생물 학적 용기에 세포를 폐기하십시오.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

섬유 아세포 세포주 NIH/3T3 세포 잠긴 표면에 인쇄하거나 시딩 하였다. 세포는 밀리리터 당 5 X 104 세포의 밀도로 성장시켰다. 세포는 기존의 세포 배양 기술을 이용하여 접종 하였다. 세포를 대형, 채널 단백질 및 기타 생체 분자에 사용 CFM보다 (~ 500 μm의) 큰 열두 플로우 셀 프린트 헤드를 사용하여 인쇄 하였다. 세포를 혈청 코팅 표면 상에 인쇄되거나 시딩 하였다. 인쇄 공정은도 1에 도시된다.

인쇄 및 시딩 후, 균체 중요한 시점 (0, 2, 24, 48 시간)에서 밀도 및 형태를 평가하기 위해 시각화 하였다. 이러한 시점에서 세포 밀도와 세포의 형태가 10X 및 40X 현미경의 배율을 사용하여 평가 하였다. 이미지는 세포가 각각의 시점에서 각 배율 그림 2에서와 거의 동일 표현형을 가지고 있음을 보여줍니다.이 그림의 효과를 바탕으로인쇄를 최소화하기로 결정했습니다.

...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

토론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명 된 3D 미세 인쇄 기술은 잘 채워진 액체로 세포 microfluidically 프린팅 배열 고유 능력 잠긴 표면 즉. 잠긴 표면에 인쇄에 의해, 세포 마이크로 어레이에서는 세포의 생리 학적으로 관련된 세포 표현형뿐만 아니라 단일 웰도 4의 하단에 세포를 다중화 할 수있는 능력을 유지하는 것을 제조 할 수있다. microfluidically 세포 결과를 인쇄하는 본 연구 쇼의 결과 유사한 세포 형태 및 생존 능력을 가진 세포 부착; 그러나 인쇄 된 세포가 더 조밀하게 짧은 전체 연구 시간의 결과로 정의 된 위치에 부착 할 수 있습니다. 짧은 학습 시간은 14 선별 처리량이 약에 대한 비용을 크게 절감 될 수 있습니다.

마이크로 유체 이전 셀룰러 마이크로 어레이 및 높은 처리량 약물 스크리닝을 위해 사용되었다. 연구 수십 흐름 분석을 기반으로하는 방법을 자세히 설명했다정적 흐름 문제를 제거;

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 시약 및 / 또는이 원고에 사용되는 악기를 생산하고 사치 미세 유체의 직원 및 주주입니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

저자는 기술 지원을 크리스 모로을 인정하고 싶습니다. 자금 조달은 NIH SBIR (R43)에 의해 제공되었다 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803을 부여합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
연속 흐름 마이크로 스포터Wasatch Microfluidics
NIH / 3T3 세포ATCCCRL-1658
Dubbleco의 Modified Eagle MediumInvitrogen11965-092세포 용 기본 배지
HEPES bufferInvitrogen15630-080세포 배지 첨가제 (대조군 pH)
Sodium pyruvateInvitrogen11360-070세포 배지 첨가제
페니실린-스트렙토마이신 Invitrogen세포 배지 첨가제
Trypan blueInvitrogen15250-061혈구 계수용
세포 측정기Fisher267110세포 계수를 위한 세포 챔버
Nikon Eclipse TS100Nikon세포 확인에 사용
Nikon Eclipse TE2000-UNikon이미지
수집에 사용인산염 완충 식염수 (칼슘과 마그네슘 포함)Invitrogen14040-133파시에이징 전 및 PI TrypLE Express로 염색 전 세포 헹굼
;InvitrogenA12177-01표면에서 세포를 제거하는 데 사용됩니다
염색 : .

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
  2. Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A. Cell-based assays: fuelling drug discovery. Anal Bioanal Chem. 398, 227-238 (2010).
  3. Gao, D., et al. Recent developments in microfluidic devices for in vitro cell culture for cell-biology research. TrAC Trends in Analytical Chemistry. 35, 150-164 (2012).
  4. Geysen, H. M., Schoenen, F., Wagner, D., Wagner, R. Combinatorial compound libraries for drug discovery: an ongoing challenge. Nature Reviews Drug Discovery. 2, 222-230 (2003).
  5. Xu, Y., Shi, Y., Ding, S. A chemical approach to stem-cell biology and regenerative medicine. Nature. 453, 338-344 (2008).
  6. Khademhosseini, A., Langer, R., Borenstein, J., Vacanti, J. P. Microscale technologies for tissue engineering and biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 2480-2487 (2006).
  7. Bhadriraju, K., Chen, C. S. Engineering cellular microenvironments to improve cell-based drug testing. Drug Discovery Today. 7, 612-620 (2002).
  8. Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. -A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
  9. Tsui, J. H., Lee, W., Pun, S. H., Kim, J., Kim, D. -H. Microfluidics-assisted in vitro drug screening and carrier production. Advanced Drug Delivery Reviews. , (2013).
  10. Gottwald, E., et al. A chip-based platform for the in vitro generation of tissues in three-dimensional organization. Lab on a Chip. 7, 777-785 (2007).
  11. Liu, R., Lee, A. P. Integrated Biochips for DNA Analysis. , Springer. (2008).
  12. Natarajan, S., et al. Continuous-flow microfluidic printing of proteins for array-based applications including surface plasmon resonance imaging. Analytical Biochemistry. 373, 141-146 (2008).
  13. Natarajan, S., Hatch, A., Myszka, D. G., Gale, B. K. Optimal Conditions for Protein Array Deposition Using Continuous Flow. Anal. Chem. 80, 8561-8567 (2008).
  14. Keighley, W. The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process. , Summer 2011. Drug Discovery World Online at: http://www.ddw-online.com/p-149288 (2011).
  15. Xu, F., et al. A three-dimensional in vitro ovarian cancer coculture model using a high-throughput cell patterning platform. Biotechnol J. 6, 204-212 (2011).
  16. Tuckwell, D. S., Weston, S. A., Humphries, M. J. Integrins: a review of their structure and mechanisms of ligand binding. Symposia of the Society for Experimental Biology. 47, 107(1993).
  17. Roberts, C., et al. Using mixed self-assembled monolayers presenting RGD and (EG) 3OH groups to characterize long-term attachment of bovine capillary endothelial cells to surfaces. Journal of the American Chemical Society. 120, 6548-6555 (1998).
  18. Chandra, R. A., Douglas, E. S., Mathies, R. A., Bertozzi, C. R., Francis, M. B. Programmable cell adhesion encoded by DNA hybridization. Angewandte Chemie. 118, 910-915 (2006).
  19. Hsiao, S. C., et al. Direct cell surface modification with DNA for the capture of primary cells and the investigation of myotube formation on defined patterns. Langmuir. 25, 6985-6991 (2009).
  20. Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry. ASSAY and Drug Development Technologies. 9, 13-20 (2011).
  21. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J. Mater. Chem. 18, 5717-5721 (2008).
  22. Onoe, H., et al. Cellular Microfabrication: Observing Intercellular Interactions Using Lithographically-Defined DNA Capture Sequences. Langmuir. 28, 8120-8126 (2012).
  23. Hsiao, S. C., et al. DNA-Coated AFM Cantilevers for the Investigation of Cell Adhesion and the Patterning of Live Cells. Angewandte Chemie International Edition. 47, 8473-8477 (2008).

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

Submerged Cell PrintingContinuous Flow MicrospotterCell MicroarrayFluorescence MicroscopyPropidium Iodide StainNIH 3T3 FibroblastsSerum Coated SurfaceCell Viability AssessmentDrug Screening ApplicationCell Density Analysis

관련 논문