이 3D 미세유체 프린팅 기술은 수중 표면에 세포 배열을 인쇄합니다. 우리는 세포 배열이 3D 플로우 셀에서 수중 표면에 미세유체적으로 전달되는 방법을 설명합니다. 물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생성되었습니다.
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이 논문에서
요약
초록
마이크로어레이 응용 분야를 위한 세포 인쇄는 인쇄 후 생리학적으로 관련된 세포 표현형을 유지하는 문제, 원하는 세포의 열악한 조직 및 분포, 어레이의 대상 영역에 약물 및/또는 영양소를 전달할 수 없는 문제 등 중요한 문제를 가지고 있습니다. 당사의 3D 미세유체 프린팅 기술은 자동화되고 다중화된 방식으로 수중 표면에 세포 어레이를 밀봉하고 인쇄할 수 있는 고유한 능력을 갖추고 있습니다. 미세유체 세포 어레이(MFCA) 3D 유체공학의 설계를 통해 프린트헤드 팁을 액체로 채워진 우물 또는 접시로 낮추고 표면에 대해 압축하여 밀봉을 형성할 수 있습니다. 프린트 헤드의 부드러운 실리콘 팁은 개스킷처럼 작동하며 압력을 가하거나 뒤로 물러나서 되돌릴 수 있는 밀봉을 형성할 수 있습니다. 핀 또는 잉크젯 프린터와 같은 다른 셀 인쇄 기술은 물에 잠긴 응용 프로그램에서 인쇄할 수 없습니다. 수중 표면 프린팅은 세포의 표현형을 유지하고 재료 표면 특성을 방해하지 않고 표면에서 이러한 세포를 모니터링하는 데 필수적입니다. 물에 잠긴 표면에 인쇄함으로써, 암, 당뇨병, 염증, 감염 및 심혈관 질환을 포함한 다양한 분야에서 약물 스크리닝 및 세포 독성 평가를 허용하는 세포 마이크로어레이가 생산됩니다.
서론
제약 산업의 최근 발전은 약물 검사 및 cytotoxicological 분석 1,2,3의 약물 발견 과정에서 세포 마이크로 어레이를 사용하여 증가 된 관심을 이끌고있다. 세포의 마이크로 어레이를 사용하여 시험 관내 높은 처리량 분석 및 스크리닝 방법의 개발이 신속하고 비용 효과적인 약물 후보의 개발뿐만 아니라, 미리 셀 1,4의 기본적인 이해를 용이하게한다. 세포 검사에 대한 전통적인 접근 방식은 기존의 잘 플레이트 플랫폼을 사용한다; 그러나이 접근법으로 인해 높은 비용, 제한된 처리량 및 세포 기능에 대한 정량적 정보 1,5 제한적 기능으로 제한된다. 때문에 이러한 제한, 세포 마이크로 어레이 기술의 연구는 분자 생물학적 특성, 조직 공학, 약물 검사의 1,6에 급성장하고 있습니다. 셀룰러 마이크로 어레이의 장점은 더 작은 샘플 사용, 최소한의 영향을 포함세포의 표현형의 이질성 정보를 마스킹, 그리고 더 높은 처리량 응용 프로그램 -1,7,8,8에 대한 분석을 자동화하는 가장 중요한 기능입니다.
제약 산업은 현재 마이크로 웰 플레이트 9 약물 검사에 대한 2 차원 세포 단층 배양과 높은 처리량 세포 기반 ....
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프로토콜
1. 문화 제조 예 셀로
- 사용 준비가 될 때까지 액체 질소에 NIH/3T3 세포 주식을 저장합니다.
- 50 ㎍ / ml의 스트렙토 마이신을 10 % 소 태아 혈청, 10 mM의 HEPES 완충액, 50 단위 / ㎖ 페니실린 및 보충 된 둘 베코 변형 이글 중간 (DMEM)를 사용 NIH/3T3 세포에 대한 완전한 미디어를 준비한다.
- 37 ℃에서 진탕 수조에서 2 ~ 3 분 동안 세포를 해동
- 3 분 1,500 XG에 완전한 미디어와 원심 분리기 5 ㎖의 세포를 Resuspend.
- 세포 펠렛을 방해하지 않고 세포의 상층 액을 제거합니다.
- 미디어 5ml에 세포를 재현 탁하고 혈구 세포를 사용하여 계산.
- 0.5 ML의 microcentrifuge 관에 세포 현탁액과 장소의 10 μl를 제거합니다.
- 세포 현탁액에 트리 판 블루의 10 μl를 추가하고 피펫의 끝으로 저어.
- 피펫 혈구 실에 염색 된 세포의 10 μL.
- 배에서 혈구 세포를 계산확대.
- 9 큰 사각형의 4의 살아있는 세포 (작은 흰색 공)을 계산합니다. 만 트리 판 블루 염색에서 진한 파란색을 표시하지 않는 살아있는 세포를 계산합니다.
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결과
섬유 아세포 세포주 NIH/3T3 세포 잠긴 표면에 인쇄하거나 시딩 하였다. 세포는 밀리리터 당 5 X 104 세포의 밀도로 성장시켰다. 세포는 기존의 세포 배양 기술을 이용하여 접종 하였다. 세포를 대형, 채널 단백질 및 기타 생체 분자에 사용 CFM보다 (~ 500 μm의) 큰 열두 플로우 셀 프린트 헤드를 사용하여 인쇄 하였다. 세포를 혈청 코팅 표면 상에 인쇄되거나 시딩 하였다. 인쇄 공정은도 1에 도시된다.
인쇄 및 시딩 후, 균체 중요한 시점 (0, 2, 24, 48 시간)에서 밀도 및 형태를 평가하기 위해 시각화 하였다. 이러한 시점에서 세포 밀도와 세포의 형태가 10X 및 40X 현미경의 배율을 사용하여 평가 하였다. 이미지는 세포가 각각의 시점에서 각 배율 그림 2에서와 거의 동일 표현형을 가지고 있음을 보여줍니다.이 그림의 효과를 바탕으로인쇄를 최소화하기로 결정했습니다.
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토론
여기에 설명 된 3D 미세 인쇄 기술은 잘 채워진 액체로 세포 microfluidically 프린팅 배열 고유 능력 잠긴 표면 즉. 잠긴 표면에 인쇄에 의해, 세포 마이크로 어레이에서는 세포의 생리 학적으로 관련된 세포 표현형뿐만 아니라 단일 웰도 4의 하단에 세포를 다중화 할 수있는 능력을 유지하는 것을 제조 할 수있다. microfluidically 세포 결과를 인쇄하는 본 연구 쇼의 결과 유사한 세포 형태 및 생존 능력을 가진 세포 부착; 그러나 인쇄 된 세포가 더 조밀하게 짧은 전체 연구 시간의 결과로 정의 된 위치에 부착 할 수 있습니다. 짧은 학습 시간은 14 선별 처리량이 약에 대한 비용을 크게 절감 될 수 있습니다.
마이크로 유체 이전 셀룰러 마이크로 어레이 및 높은 처리량 약물 스크리닝을 위해 사용되었다. 연구 수십 흐름 분석을 기반으로하는 방법을 자세히 설명했다정적 흐름 문제를 제거;
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공개 사항
저자는 시약 및 / 또는이 원고에 사용되는 악기를 생산하고 사치 미세 유체의 직원 및 주주입니다.
감사의 글
저자는 기술 지원을 크리스 모로을 인정하고 싶습니다. 자금 조달은 NIH SBIR (R43)에 의해 제공되었다 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803을 부여합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 연속 흐름 마이크로 스포터 | Wasatch Microfluidics | ||
| NIH / 3T3 세포 | ATCC | CRL-1658 | |
| Dubbleco의 Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | 세포 용 기본 배지 |
| HEPES buffer | Invitrogen | 15630-080 | 세포 배지 첨가제 (대조군 pH) |
| Sodium pyruvate | Invitrogen | 11360-070 | 세포 배지 첨가제 |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Invitrogen | 세포 배지 첨가제 | |
| Trypan blue | Invitrogen | 15250-061 | 혈구 계수용 |
| 세포 측정기 | Fisher | 267110 | 세포 계수를 위한 세포 챔버 |
| Nikon Eclipse TS100 | Nikon | 세포 확인에 사용 | |
| Nikon Eclipse TE2000-U | Nikon | 이미지 | |
| 수집에 사용인산염 완충 식염수 (칼슘과 마그네슘 포함) | Invitrogen | 14040-133 | 파시에이징 전 및 PI TrypLE Express로 염색 전 세포 헹굼 |
| ; | Invitrogen | A12177-01 | 표면에서 세포를 제거하는 데 사용됩니다 |
참고문헌
- Fernandes, T. G., Diogo, M. M., Clark, D. S., Dordick, J. S., Cabral, J. High-throughput cellular microarray platforms: applications in drug discovery, toxicology and stem cell research. Trends in Biotechnology. 27, 342-349 (2009).
- Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Coppa, A., Roda, A.
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재인쇄 및 허가
