구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

Marijn Schouten; Giulia M. R. De Luca; Diana K. Alatriste González; Babette E. de Jong; Wendy Timmermans; Hui Xiong; Harm Krugers; Erik M. M. Manders; Carlos P. Fitzsimons

doi:10.3791/51276

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방법 논문

구조적 조명 현미경을 사용하여 쥐 차 해마 신경 세포의 돌기 쪽 이미징

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DOI:

10.3791/51276

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2014년 5월 4일

Marijn Schouten^*¹ , Giulia M. R. De Luca^*² , Diana K. Alatriste González¹ , Babette E. de Jong² , Wendy Timmermans¹ , Hui Xiong¹ , Harm Krugers¹ , Erik M. M. Manders² , Carlos P. Fitzsimons¹

¹Center for Neuroscience, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam, ²Van Leeuwenhoek Centre for Advanced Microscopy, Section Molecular Cytology, Swammerdam Institute for Life Sciences, University of Amsterdam

^* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

이 문서는 구조적 조명 현미경 (SIM)을 사용하여 체외에서 해마 신경 세포에서 이미지 돌기 쪽을 작동 프로토콜을 설명합니다. SIM을 사용하여 초 고해상도 현미경 개선 된 세부 사항과 함께 개별 돌기 쪽의 영상을 허용, 크게 세 가지 차원 공간에서 빛의 회절 한계를 넘어 이미지 해상도를 제공합니다.

초록

돌기 쪽은 신경 세포의 수상 돌기에서 나오는 돌출부이며, 뇌의 흥분성 입력의 기본 시냅스 대상을 나타냅니다. 기술의 발전은 신경 세포의 연결 및 시냅스 가소성의 핵심 요소로 이러한 구조를 발견했습니다. 광학 현미경을 사용하여 척추의 형태의 정량 분석에 의한 빛의 굴절 고유 제한과 관련된 기술적 인 한계에 대한 근본적인 문제가 남아있다. 돌기 쪽이 용이하게 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 길이 아닌 다른 척추 치수는 일반적으로 200 ㎚의 광학 현미경의 이론적 인 해상도 한계에 의해 고정 된 기존의 광학 해상도보다 작은 있기 때문에, 척추의 모양과 크기에 미묘한 변화를 측정하는 것은 어렵다.

몇 가지 최근에 개발 된 슈퍼 해상도 기술이 돌기 쪽을 포함하여 200 나노 미터보다 작은 이미지 세포 구조에 사용되어왔다. 티HESE 기술은 고전적인 원방 조작에 기초하기 때문에 시료의 표면을 넘어 기존의 샘플 준비 방법과 이미지를 사용할 수있게됩니다. 여기에 설명 된 기본 해마 신경 세포의 문화에 돌기 쪽의 영상을 초 고해상도 구조 조명 현미경 (SIM)을 적용하는 작업 프로토콜입니다. SIM의 가능한 응용 프로그램은 공 초점 현미경의 사람들과 겹칩니다. 그러나,이 기술은 다양한 적용 가능성을 제시한다. 공 초점 현미경으로 인해 실제 구멍의 사용에 초점 빛을 밖으로 제거의 비용으로 해상도 향상을 달성하면서 SIM은, 높은 효과적인 측면 해상도를 제공합니다. 이 프로토콜에서 기본 뉴런은 DNA 플라스미드는 형광 단백질을 인코딩하고 SIM을 사용하여 몇 군데로 형질 표준 프로토콜을 사용하여 유리 커버 슬립에 배양. 돌기 쪽이 체외에서 16-17일 후, 때 이미지가 있기 때문에 여기에 설명 된 전체 프로토콜은, 약 2 주 소요수지상 개발이 최적이다. 프로토콜을 완료 한 후, 돌기 쪽이 전문 소프트웨어를 사용하여 SIM 이미지 스택의 시리즈에서 3D로 재구성 할 수있다.

서론

수지상 척추 신경 막의 작은 돌기이다. 이 특징적인 구조는 일반적으로 단일 시냅스로부터 입력을 수신하도록 전문이 뉴런 사이의 물리적 접촉 면적을 나타내고있다. 대부분의 기능적 성숙 돌기 쪽은 구형 팁,라고 머리, 그리고 돌기 축에 머리를 연결하는 얇은 목으로 구성되어 있습니다. 그러나 등뼈가 정적되지 않고 적극적으로 이동하고 심지어 성인의 뇌 ^2에 지속적으로 형태를 변경합니다. 시간이 2 주 기간 내에서 후반 배아 또는 출생 초기 시간에서 파생 된 쥐 차 해마 신경 세포 배양은 척추와 같은 구조 ³ 초 filipodia 진화 수많은 막 돌기 복잡한 돌기 아버을 개발한다. 이러한 동적 동작과 다른 특성에 기초하여, 돌기 쪽은 메모리 저장 및 시냅스 전달의 ^4,5위한 해부 기판을 제공하는 것으로 생각된다.

일을 감안할 때돌기 척추의 크기와 모양이 시냅스 기능에, 정확하게 자신의 치수를 측정하는 것이 중요하다 것을 전자 중요한 역할. 등뼈의 길이는 약 200 내지 2000 나노 미터에서 변화 좀처럼 공 초점 레이저 주사 형광 현미경에 의해 식별 될 수있다. 그러나 길이보다 다른 척추의 크기는 일반적으로 이론적으로 200 나노 미터 ⁶ 주위 회절에 의해 고정 된 종래의....