여기에서 우리는 빠르게 PhenoRipper, 최근에 개발 된 이미지 분석 플랫폼을 사용하여 형광 현미경 이미지의 컬렉션을 분석하고 탐구를위한 워크 플로를 설명합니다.
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방법 논문
신속한 분석 및 형광 현미경 이미지의 탐사
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
높은 처리량 현미경의 급속한 발전에도 불구하고, 정량적 인 이미지 기반 분석은 여전히 중요한 도전을 제기. 전문 영상 분석 툴의 다양한 사용할 수 있지만, 대부분의 전통적인 이미지 분석 기반의 워크 플로우 (분석 매개 변수를 미세 조정에 대한) 가파른 학습 곡선을 가지고 이미징 및 분석 간의 긴 처리 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할은 이미지의 개별 셀을 식별하는 프로세스는,이 점에서 주요 병목 현상이다.
여기에서 우리는 PhenoRipper, 신속한 분석 및 현미경 이미지의 탐험을 위해 디자인 된 오픈 소스 소프트웨어 플랫폼을 기반으로 대체, 세포 분할이없는 워크 플로우를 제시한다. 여기에 제시된 파이프 라인은 세포 배양의 면역 형광 현미경 이미지를 최적화하고 최소한의 사용자 개입이 필요합니다. 반 시간 내 PhenoRipper은 일반적인 96 - 웰 실험 데이터를 분석하고 이미지의 프로파일을 생성 할 수 있습니다. 사용자 수다음 시각적으로 데이터를 탐색 자신의 실험에 품질 관리를 실시하고, 섭동에 대한 응답을 보장하고 반복 실험의 재현성을 확인합니다. 이 분석 및 분석 최적화시 매우 중요합니다 실험 사이의 신속한 피드백주기를 용이하게한다. 이 프로토콜은 단지 품질 관리를위한 제 1 패스 분석으로서 유용하지만 엔드 투 엔드 솔루션으로 사용될 수 있고, 특히 스크리닝. 여기에서 설명한 워크 플로우는 높은 처리량 스크린에 의해 생성 된 것과 같은 큰 데이터 세트로 스케일링하고, 정확하게 생물학적 시스템의 넓은 범위 표현형에 의해 그룹 실험 조건에 도시되었다. PhenoBrowser 인터페이스는 표현형 공간을 탐구하고 생물 주석에 이미지 속성을 관련하는 직관적 인 프레임 워크를 제공합니다. 종합적으로, 여기에 설명 된 프로토콜을 기반으로 화상 스크린의 정량 분석을 채택하는 장벽을 낮출 것이다.
서론
지난 10 년 동안 이미징 기술의 급속한 진보는 많은 실험실에게 높은 처리량 현미경을 수행 할 수있는 능력을 부여 하였다. 문제는 지금 분석 중 하나에 이미지 중 하나를 이동했다. 우리는 어떻게 비교, 특성, 그리고 일반적인 높은 처리량 영상 화면에 생성 된 복잡한 아직 미묘한 표현형의 급류를 탐험 할 수 있습니까?
이미지 분석 및 정보학 플랫폼의 숫자는 이미지의 큰 컬렉션에서 생체 정보를 추출하기위한 사용자 정교한 도구 상자 1-3을 받고 있습니다. 그러나 많은 중요한 장애물은 높은 처리량 이미지 기반 화면에서 데이터를 분석 남아있다. (그 시스템) 이미지와 알고리즘 파라미터의 미세 조정의 적절한 특성화를 선택과 관련된 어려움은 종종 특히 이미지 분석 전문 지식이없는 사용자를 위해 긴 설치 시간에 발생합니다. 특히, 셀 분할, 개별 셀을 식별하는 프로세스해당 화상은,이 점에서 주요 병목 현상이다. 분할은 세포 유형, 세포 밀도와 바이오 마커와 같은 실험적인 매개 변수에 매우 민감하고, 자주 큰 데이터 세트에 대한 반복 조정을 필요로 할 수 있습니다. 이러한 이유로, 이미지 분석은 종종 오히려 실험 플로의 통합 부분보다 전문가에 의해 수행 독립적 단말 단계이다. 이 분석 및 실험, 분석 개발의 중요한 부분의 신속한 피드....
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프로토콜
1. 준비 샘플 및 이미징
- 세포 배양
- 일상적으로 문화를 분할하고 20~70%의 합류에 유지한다. 이전 실험에 어느 날, (둘 베코의 수정 이글 중간 재료의 표 참조) DMEM에서 HeLa 세포의 성장과 10 % FBS (태아 혈청) 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신과 보충.
- 실험의 날에, 분할 세포 배양 (약 50 %의 합류)에서 성장.
- 몇 초 동안 트립신 / EDTA (에틸렌 디아민 테트라 아세트산)의 약 2 ㎖에 노출, PBS (인산염 완충 생리 식염수)으로 세포를 씻으십시오. 초과 트립신 / EDTA를 대기음 ~ 3 분 동안 실온에서 후드 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)의 박막에 목욕 세포를 유지.
- 기계적으로 두 번 플라스크를 흔들어 혈청 보충 미디어 세포를 분리. 세포를 세어 미디어의 5,000 cells/50 μL로 희석 즉시 아니라 자동화 된 액체 처리 로봇 (30를 사용하여 384도 유리 바닥 판에 50 μL / 웰 플레이트플레이트들)은 여기에 사용됩니다.
- 웰 소재 가장자리 효과를 최소화하기 위해 30 분 동안 RT에서 플레이트를 배양한다. 하룻밤 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에서 RT 배양, 장소 ....
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결과
여기에서 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물이 워크 플로의 능력을 시험했다. 헬라 세포는 384 - 웰 플레이트의 30 우물에 씨앗을 품고 및 DNA / 말라 / α-tubulin에 대한 염색 하였다. 사용 된 특정 기본 항체, 형광 표지 된 이차 항체 및 기타 형광 얼룩은 재료의 표에 나열되어 있습니다. 웰스는 세 기계론의 클래스 (히스톤 탈 아세틸 화 효소의 억제, 미세 소관 타겟팅 및 DNA 손상) 24 시간 동안 20 배 목표 배율 표면 형광 현미경을 사용하여 몇 군데에 속하는 15 약물로 치료했다. 열 여섯 이미지 480 이미지 (배 채널)의 총, 잘 각각 인수했다. 여기에 설명 된 데이터는 www.phenoripper.org에서 다운로드 할 수 있습니다.
전술 한 바와 같이, PhenoRipper은 이러한 이미지를 분석하는 데 사용 하였다. 전경 임계 값은 5 % (최대 가능한 강도, 즉 5 %) 및 20 픽셀 블록 크기
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토론
여기에 설명 된 워크 플로는 빠르고 쉬운 특성과 현미경 이미지의 비교를 할 수 있습니다. 우리는 먼저이 워크 플로는 빠르게 현미경 이미지에 대한 품질 관리를 수행하여, 예를 들어 실험의 최적화를 할 수있는 방법을 보여 주었다. 다음으로, 우리는 높은 처리량 검사 데이터를 분석에 대한 가능성을 보여 주었다 : 우리는 그들의 행동 메커니즘을 기반으로 그룹의 약물에 수 있었다. 약물의 그룹은 PhenoRipper 빨리 규모의 명령에도 불구, 더 복잡한 방법 6을 사용하여 발견에 필적했다.
우리는 모든 이미지 기반의 접근 방식으로, 산발적 실험 변동에 대한 강력한이 방법을 발견했지만, 판독 체계적인 비 생물학적 효과에 의해 영향을받을 것입니다. 예를 들어, 마커 강도 플레이트에 플레이트 변화는 관심의 생물학적 효과를 마스크 할 수 있습니다. 이러한 아티팩트의 영향은 적절한 교정 07에 의해 감소 될 수 중에는, P 8판 정상.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
우리는 아담 코스터와 도움의 의견과 토론 Altschuler와 우 실험실의 다른 모든 구성원 감사합니다. 이 연구는 건강의 국립 연구소에 의해 지원되었다 R01 GM085442 및 CA133253 (SJA), R01 GM081549 (LFW), CPRIT RP10900 (LFW), 그리고 웰치 재단 I-1619 (SJA)를 부여하고 I-1644 (LFW).
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM, High Glucose | Invitrogen | 11965 | High Glucose, L-Glutamine |
| Marker Hoechst 33342 | Invitrogen | H1399 | DNA stain, dilution 1:2,000 of 5 mg/ml |
| stock Marker phalloidin-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A12379 | Conjugated phallotoxin, dilution 1:200 |
| Primary Antibody α-tubulin | Sigma | T9026 | Primary Ab, mouse monoclonal, dilution 1:200 |
| Secondary Antivody anti-Mouse TRITC | Jackson | 115-025-166 | Conjugated secondary Ab, 0.5 mg in 1 ml PBS + 1 ml glycerol |
| Aldosterone | 농도 사용: 0.2 μ | ||
| 사용 된 아피시딘 | 농도 : 20 μ | ||
| 콜히친 | 농도 사용 : 0.16 μ | ||
| M 코티솔 | 농도 : 0.2 μ | ||
| 사용된 덱사메타손 | 농도: 0.2 μ | ||
| 도세탁셀 | 농도 사용: 0.2 μ | ||
| M344 | 농도 사용: 20 μ | ||
| MS-275 | 농도 사용 : 5 μ | ||
| 노코다졸 | 농도 사용 : 0.3 μ | ||
| 프레드니솔론 | 농도 사용: 0.2 μ | ||
| RU486 | 농도 사용 : 0.2 μ M | ||
| Scriptaid | 농도 사용: 70 μ | ||
| 탁솔 | 농도 사용 : 0.3 μ M | ||
| 트리코스타틴 A | 농도 사용: 0.2 μ | ||
| Vinorelbine | 농도 사용 : 0.3 μ 미디엄 |
참고문헌
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. Biotechniques. 43, 25-30 (2007).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7, (2006).
- Shamir, L., Delaney, J. D., Orlov, N., Eckley, D. M., ....
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재인쇄 및 허가
