식물의 셀없는 시스템에서 프로 테오 저하 시금

요약

표적 단백질 분해는 세포 기능의 주요 조절기구를 나타낸다. 그런 다음 26S 프로 테아 좀에 대해 같은 분자 "태그"봉사하는 표적 단백질에 polyubiquitin 체인을 부착 보존 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로를 통해 발생합니다. 여기, 우리는 단백질의 프로 테오 저하에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 세포가없는 분석을 설명합니다.

초록

단백질 분해에 대한 유비퀴틴 - 프로 테아 좀 경로는 거의 모든 진핵 생물의 세포 기능의 다양한 스펙트럼의 규제를위한 가장 중요한 메커니즘 중 하나로 떠오르고있다. 구체적으로, 식물에서, 프로 테아 좀의 ubiquitin/26S 시스템 (UPS)의 단백질 분해를 조절하고 면역 반응, 개발 및 프로그래밍 된 세포 사멸을 포함한 공정의 넓은 범위의 발전에 크게 기여한다. 또한, 증가하는 증거는 아그로 박테 리움 등 다양한 식물 병원균, 식물 병원균 상호 작용에있는 UPS의 중요성을 강조하고, 효율적인 감염 호스트 UPS를 이용하는 것이 좋습니다.

UPS의 기질 특이성은 E1과 협력 작용 및 E2가 그들에게 유비퀴틴 분자 체인을 부착하여 열화로 향하는 특정 단백질 분자를 인식하고 표시하는 리가 제 E3 유비퀴틴 리가 제에 의해 달성된다. E3의 리가 제의 하나의 클래스가 SCF입니다 (Skp1 / C특히 UPS 기판을 인식하고 자사의 F-박스 단백질 구성 요소를 통해 유비퀴틴을 위해 그 (것)들을 대상으로 율린 / F 상자 단백질) 복잡한. 그 생물학적 과정에서 UPS의 잠재적 인 역할을 조사하기 위해, UPS 매개 단백질 분해에 대한 간단하고 신뢰할 수있는 분석을 고안하는 것이 중요합니다. 여기, 우리는 식물 세포가없는 시스템을 사용하여 하나의 분석에 대해 설명합니다. 이 분석은 F-박스 단백질 기판의 상호 작용에 특별한 중점을두고, 다양한 세포 과정의 조절 단백질 분해의 역할의 연구에 적용 할 수 있습니다.

서론

ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 경로는 다른 사람의 사이에서 전사 조절, 세포주기의 진행과 신호 전달 수용체 하향 조절 또는 엔도 시토 시스, ^1-4을 처리하는 등 다양한 생물학적 반응의 제어를위한 광범위한 메커니즘으로 부상하고있다. 이 경로에서, 목적 단백질은 제 유비퀴틴 활성화 효소 E1에 thiolester 결합을 통해 부착하고 유비퀴틴 접합 효소 E2의 시스테인 아미노산 잔기에 옭되는 잔기를 유비퀴틴로 태그되며 마지막으로, E2는 유비퀴틴 리가 제 E3와 상호 작용 , 단백질 기질의 polyubiquitination 결과. 궁극적으로, polyubiquitinated 단백질은 26S 프로 테아 좀에 의해 인식 저하된다. 이 메커니즘에서, E3 효소는 기질을 지정하고 ubiquitin/26S의 프로 테아 좀 시스템 (UPS)의 주요 구성 요소를 규정하는 역할을한다. E3 리가 제의 예 RING 도메인 리가 제로서, 또는 multisubunit의 SCF (S의 일부로서 역할을 할 수 독립적이러한 F-상자 도메인 리가 제와 같은 kp1/Cullin/F-box 단백질) 복잡한. SCF-매개 프로 테오 분해 경로는 전사, 세포주기, 신호 전달 ^5-10 많은 다른 주요 세포 기능의 조절에 관여하고 있습니다.

프로토콜

1. 단백질 발현

1. 발현 시스템의 선택
   시스템, 즉, 벡터 및 특정 모델 생물 / 세포에 대한 관심의 단백질의 발현에 가장 적합한 벡터 전달 방법을 선택합니다. 우리의 분석에 가장 세포의 많은 수의 일시적 변화에 의해 달성된다 쉽게 검출 가능한 양의 시험 단백질의 발현을 필요로합니다. 식물에서, 예를 들어, 이는 유용한 전달 시스템과 같은 발현 벡터 및 아그로 이진 플라스미드를 사용하여 달성된다.
2. 바이너리 발현 벡터의 구축
   에피토프 태그에 단독으로 또는 번역 융합 하나를 발현 벡터에 관심의 단백질 (들)의 코딩 서열 (들)을 복제합니다. 사용은 선택 발현 시스템 및 유전자 복제에 대한 표준 분자 생물학 절차에 적합한 벡터. 아그로 박테 리움 매개 유전자 전달을 위해, standa를 사용하여도, 이진 벡터를 고용하고 그들을 소개식물 조직의 후속 접종 등 EHA105으로 아그로 박테 리움 균주로 RD 프로토콜.
3. 식물 종의 선택
   관심의 단백질 (들)로 표현 될 수있는 식물 종을 선택합니다. 아그로 박테 리움 매개 유전자 변형의 영향을 모든 식물 종은 사용할 수 있지만, 그주의, 선택의 우리의 식물 종은 쉽게 아그로 ....

결과

Zaltsman 등. ^17에서 적응 그림 1은 세포가없는 시스템에서 프로 테오 저하의 검출을위한 대표적인 실험을 보여줍니다. 특히, 우리는 N.의 SCF ^{VBF 경로를} 통해 VBF F-박스 단백질에 의한 식물 방어 관련 단백질 VIP1의 불안정을 보여 benthamiana. 애기 VBF 및 HA-태그 VIP1 (HA-VIP1) 단백질을 일시적으로 동시 발현하고, 표현 잎의 추출물 내의 HA-VIP1 콘텐츠 단백질은 서양 블로 팅에 의해 분석 하였다. 이 분석은 VBF과 동시 발현 때 VIP1의 양이 상당한 수준으로 감소되었다는 것을 보여 주었다, 그러나 VBF의 동시 발현 (그림 1A)의 부재에 상대적으로 안정적으로 유지. VBF없이 VIP1 내용에 약간의 감소가 내생 담배 VBF 활동의 낮은 수준으로 인해이 발생할 수 있습니다. VBF로 VIP1의.......

토론

이 분석은 식물 조직에서 시험 단백질의 발현에 의존하고, 따라서, 잠재적 인 프로 테오 분해 과정은 분명히 생체 조직 내에서 이미 발생한다. 우리는 제로 샘플은 초기 기준점으로서의 시간만을 추출한 그러나 단백질 불안정화를 분석 실험. 따라서, 우리는 세포가없는 분석으로 정의합니다.

이 분석의 성공에 대한 한 가지 중요한 측면은 시험 단백질 (들)이 생성 될 것이다에서 발현 벡터의 올바른 선택이다. 테스트 단백질에 대한 특이 항체를 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 그것은 에피토프 태그 웨스턴 블로 팅에 의해 검출해야한다. 태그 단백질은 아그로 박테 리움 이진 벡터에서 표현되어야한다. 이러한 많은 벡터가 ²⁶ 사용할 수있는 반면, 우리는 pPZP-RCS2 이진 플라스미드로 발현 카세트의 1 단계를 삽입 할 수 있습니다 모듈 식 PSAT 플라스미드 시스템 ^(24)에서 파생 된 벡터를 사용하는 것이 좋습니다^{24 ~ 2.......}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
단백질 분석 키트	Bio-Rad	500-0001
단백질분해효소 억제제 칵테일	Sigma-Aldrich	S8820
Mini-Protean 시스템	Bio-Rad	165-8000
반건조 웨스턴 블로팅 SD 전기 전달 시스템	Bio-Rad	170-3940
Affinity Purified Rabbit Anti-Ha	ICL Lab	RHGT-45A-Z
염소 안티 토끼 IgG Peroxidase Conjugate	Thermo Scientific	31460
BioTrace, NT 니트로셀룰로오스 전사 멤브레인	Pall Corporation	27377-000
Immobilon western chemiluminescent HRP substrate	EMD Millipore	WBKL S0 050
MG132	EMD Millipore	474790-1MG
Lactacystin	Sigma-Aldrich	L6785
Thermo Scientific Pierce Fast Western Blot Kit, ECL Substrate	Pierce	35055