biotinylatable 융합 단백질을 개발하는 연구의 다양한 분야에서 많은 잠재적 인 응용 프로그램이 있습니다. 재조합 단백질 공학은 맞춤 설계된 단백질의 높은 수율을 제공하는 비용 효율적인 정직 절차입니다.
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이 논문에서
요약
초록
재조합 단백질 공학은 대장균에게 (대장균) 식으로 거의 4 수십 년 동안 시스템, 오늘을 활용했다 E. 대장균은 여전히 가장 널리 사용되는 숙주이다. 시스템의 유연성은 (스트렙 트 아비딘 상호 작용을위한) 비오틴 태그와 같은 잔기 및 녹색 형광 단백질 또는 체리 적색 단백질과 같은보다 큰 단백질의 기능성 또한 허용한다. 또한, 번역 후 변형을 부여하는 금속 이온의 킬레이트 고유 반응성 작용기, 분광 프로브, 분자와 같은 부 자연스러운 아미노산의 통합은 단백질의 특성과 기능을 더 잘 조작을 가능하게했다. 따라서이 기술은 연구의 다양한 분야에 대한 중요한 유틸리티를 제공하는 사용자 정의 융합 단백질을 생성합니다. 보다 구체적으로, biotinylatable 단백질 서열 때문에 아비딘 및 스트렙 타비 딘과 비오틴 사이의 높은 친 화성 상호 작용의 다양한 표적 단백질에 통합 된. 이 추가 태그 단백질의 검출 및 정제를 강화뿐만 아니라 세포의 정렬과 같은 보조 응용 프로그램을위한 길을 열어 주었있다. 따라서, 비오틴 표지 분자는 바이오 산업 및 생명 의학 분야에서 증가하고 광범위한 영향을 보여줍니다. 우리의 연구의 목적을 위해 우리는 신경 성장 인자 (NGF) 및 semaphorin3A (Sema3A) 기능 영역을 포함하는 비 오티 닐화 재조합 융합 단백질을 설계했다. 우리는 이러한 비오틴 융합 단백질은 다른 활성 단백질 서열과 함께, 조직 공학 및 재생을 위해 생체 적합 물질에 닿는 할 수있는 방법을 이전에보고했다. 이 프로토콜은 T7의 락의 유도 성 벡터와 E를 활용하여, 밀리그램 규모 엔지니어링 biotinylatable 단백질의 기본 사항을 설명합니다 변환하는 스케일 업 (scale-up) 및 정화부터 대장균 발현 호스트.
서론
단백질은 궁극적으로 적절한 조직 형성과 조직에 이르는 많은 생물학적 기능에 대한 책임은 생체 분자의 넓은 범위를 커버. 이 분자는 인체 내에서 평형을 유지, 규제 업 및 / 또는 아래로 조절 유전자와 다른 단백질의 제어 신호 전달 경로의 수천을 시작합니다. 하나의 단백질의 중단은 치명적인 장애 또는 질병의 발병으로 이어질 수있는 신호의이 웹 전체에 영향을 미칩니다. 실험실에서 각각의 단백질을 설계하는 것은 이러한 부작용을 퇴치하기위한 하나의 솔루션을 제공하고 작은 분자 약물에 대한 대안을 제공합니다. 1977 년 14 아미노산 소마토스타틴 서열을 코딩하는 유전자가 E.을 사용하여 만든 제 설계 폴리펩티드 중 하나였다 대장균 1. 곧 1979 년, 인슐린, 플라스미드 나 pBR322에 복제 변형, 표현, 2 정제 하였다. 그 이후로, 재조합 단백질은 입술의 여러 필드에 자신의 영향력을 확대earch 등 생체 적합 물질, 약물 전달, 조직 공학, 바이오 의약품, 농업, 산업 효소, 바이오 연료 등 (리뷰를 참조에게 3-8 참조). 이 기술을 포함한 목적 주문형 화학 잔기 또는 단백질 서열의 첨가를 통해 제공하고 있지만, 표적 단백질 식별, 안정화 및 정제에 한정하지 않는 것이 범용성 크게....
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프로토콜
1. 대상 단백질의 설계
- 생명 공학 정보를 웹 사이트에 대한 국립 센터를 사용하면 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 계정으로 관심 및 스플 라이스 변종의 종류를 복용 표적 단백질에 대한 아미노산 서열을 얻을 수 있습니다. 또한 단백질의 활성 영역에 해당하는 아미노산 서열을 선택한다.
참고 : Sema3A를 들어, 아미노산 21-747가 선택되었다. 융합 단백질 barstar, 아미노산 1-90의 서열, NGF 아미노산 122-241에 첨가 NGF로 설계 하였다. - N-말단은 다음 시퀀스에 추가하려면 : 정화 6X - 그의 태그 (HHHHHH), 담배 식각 바이러스 그의 태그의 제거 (TEV) 단백 분해 효소 절단 사이트 (ENLYFQG을), 비오틴은 K (GLNDIFEAQKIEWHE)에서 단백질의 바이오 티 닐화에 대한 일련의 태그 적절한 단백질 접힘 (EFPKPSTPPGSSGGAP)를위한 공간을 허용 할 틈 유연한 힌지.
참고 :이 시퀀스는 원하는 융합 제자에 따라 달라질 수 있습니다EIN. - 원하는 호스트 종과 합성 유전자 설계 / 최적화를 위해 회사 전체 아미노산 서열을 보냅니다. 키트를 사용하여 효소 BamHI-NotI을 사이....
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결과
복제 및 테스트 식
도금이 정상적으로 수행 될 때, 하나의 고립 된 콜로니를 형질 전환 박테리아 클론 세포 (도 2A)를 버릴 가능성을 증가시키기 위해 형성한다. 너무 많은 세포를 도금하는 경우에는, 플레이트는 37 ° C의 또는 변환에 너무 오래 배양 식민지는 한천 플레이트를 덮거나 세포의 큰 집계 (그림 2B 및 2C)를 형성 할 수있다, 의문이다. 테스트 식 중, NGF와 Sema3A 먼저 37 ° C에서 4 시간 동안 유도 SDS-PAGE 분석은 두 단백질이 가용성 분획 (그림 2D)에 위치하고 있었다 결정되었다. 단백질 발현은 공정하고, 따라서 18 ° C에서 하룻밤 유도와 다른 테스트 식을 조사 하였다 보였다. Sema3A (그림 2E)과 눈에 띄는 차이는 없었다 반면 NGF.......
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토론
재조합 단백질 공학은 여러 분야에 걸쳐있는 매우 강력한 기술이다. 이것은 맞춤 설계 단백질의 높은 수율의 생산을 허용하고 경제적 동조하고 비교적 간단한 절차이다. 이는 설계 및 표적 단백질을 발현하는 것은 항상 간단 아니라는 것을주의하는 것이 중요하다. 기초 표현 및 재조합 단백질의 안정성은 벡터, E.의 특정 선택에 따라 달라집니다 대장균 세포주, 펩타이드 태그 추가 및 재배 매개 변수입니다. 우리의 특정 설계 기준은 잘 확립 E.을 활용 대장균은 단백질 공학에 대한 균주. 또한, 플라스미드 벡터는 T7의 lac 프로모터와 안정 재조합 단백질 발현에 대한 암피실린 내성 유전자가 포함되어 있습니다.
고순도 서브 클로닝 된 플라스미드를 얻은 후, 최초의 주요 절차가 성공적으로 숙주 세포에 표적 단백질을 변형 및 용해도를 결정하는 것이다단백질. 시험 .......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는이 작업을 지원하는 자금 애 크런 대학을 인정하고 싶습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-Hydroxyethylmercaptan β-Mercaptoethanol | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| 아세트산, 빙하 | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| Agar | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| Ampicillin 나트륨 염 | 시그마-알드리치 | A9518 | 25g |
| 소포제 204 | 시그마-알드리치 | A6426 | 500g |
| 바스타-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 &마이크로; g | |
| BL21(DE3) 유능 세포 | Novagen | 69450 | 1ml; 발현 호스트 |
| Bradford 시약 | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| 젤 여과 표준 | Bio-Rad | 151-1901 | 6 바이알 |
| Glycerol | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| 구아니딘 하이드로 디오라이드 amioformamidine hydrochloride | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA 수지 | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| 염산 | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| 이미다졸 | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli 샘플 버퍼 | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| Lauryl sulfate sodium salt, Sodium dodecyl surface | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB Broth | Sigma-Aldrich | L3022 | 1kg |
| NovaBlue 역량 세포 | Novagen | 69825 | 1ml; 클로닝 호스트 |
| 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 |
| 염화칼 | Chem-Impex International | 01247 | 1kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 &마이크로; g | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1kg |
| 수산화나트륨 | Fisher Scientific | S318-500 | 500g |
| 인산나트륨 디아염기성 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500g |
| 인산나트륨 일염기 | Sigma-Aldrich | S5011 | 500g |
| Terrific Broth | Bioshop | TER409.5 | 5kg |
| 테트라사이클린 염산염 | Chem-Impex International | 667 | 25g |
| 트리스/글리신/SDS 완충액, 10x | Bio-Rad | 1610732 | 1L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1kg |
| 트립톤, 췌장 | EMD | 1.07213.1000 | 1kg |
| 효모 추출물, 과립 | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| &오믈; KTApurifier10 | GE 헬스케어 | 28-4062-64 | 키트 및 액세서리 포함 |
| 벤치탑 오비탈 쉐이커 | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | 효소는 반응 완충액과 비오틴 용액이 함께 제공됩니다 |
| 투석 Casette | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer (Extra Strength) |
| 투석 튜빙 | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | MWCO: 25,000 및 50,000 |
| 유량 전환 밸브 FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter 비오틴 정량 분석 키트 | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 튜브 랙, 랙 C | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| 분획 수집기 Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | 키트 및 액세서리 |
| 포함 가열/냉장 순환기 | VWR | 13271-102 | 모델 1156D |
| 가열 오븐 FD 시리즈 | 바인더 | 모델 FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | 중단--교체 제품: HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti 원심분리기 | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 로터 | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 로터 | Beckman Coulter | 969329 | 포함 1L 폴리포르필렌 병 |
| JS 5.3 로터 | Beckman Coulter | 368690 | |
| 층류 후드 | Themo Scientific | 1849 | Forma 1800 시리즈 클린 벤치 |
| 마이크로플레이트 리더 | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8004 | 4-gel vertical 전기영동 시스템 |
| Mini-PROTEAN TGX 프리캐스트 겔 | Bio-Rad | 456-9036 | Any kDa, 15-well comb |
| Ni-NTA 컬럼 | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml 볼륨 ECONO-Column |
| Plasmid Miniprep Kit | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC 전원 공급 장치 | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V, 3 A, 300 W |
| 라운드 바닥 폴리프로필렌 공중합체 튜브 | VWR | 3119-0050 | 50 ml JA 25.50 로터 |
| 튜브 Spin-X UF Concentrators | Corning | 431488, 431483 | 20 및 6 ml; MWCO: 10,000 Da |
| 서브클로닝 서비스 | GenScript USA Inc. | 단백질 서비스 | |
| 초음파 프로세서 | Cole-Parmer | 18910445A | 모델 CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | 모델 G560 |
참고문헌
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
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