멀티 플렉스 분석은 기본 세포 메커니즘에 대한 유익한 정보를 제공하고 시약 및 불필요한 반복 실험의 낭비를 제거 할 수 있습니다. 우리는 팔 미트 산으로 산화 반칙으로 체외 시상 하부 모델에서 세포 생존을 결정하기 위해, 형광 및 발광 기반의 방법을 사용하여, 여기에 멀티 플렉스 카스파 3 / 7 활동 분석에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
복잡한 세포 메커니즘의 연구에서 분석을 다중화하는 능력은, 반복적 인 실험의 필요성을 없애 내부 제어를 제공하고, 비용 및 시약에 폐기물을 감소시킨다. 여기에서 우리는 96 - 웰에서 생존 세포 수와 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 위해 기반 분석법을 형광체 및 발광을 모두 사용하여, 시험 관내 시상 모델의 팔 미트 산 (PA)의 반칙 아폽토시스를 평가하기 위해 멀티 플렉스 분석의 최적화를 설명 마이크로 플레이트 형식입니다. PA의 반칙으로, 가능한 세포는 레사 주린 기반의 형광 분석에 의해 결정되었다. 카스파 제 3 / 7 활성은 luminogenic 기판 DEVD 및 세포 수로 정규화를 사용하여 측정 한 다음이었다. 이 다중 분석법은 포화 지방산 도전으로 사멸 자극, 다음 카스파 제 활성의 변화를 결정하기위한 유용한 기술이다. 포화 지방산 PA는 잠재적 importa을 나타내는 시상 산화 스트레스 및 세포 사멸을 증가시킬 수있다예컨대 그와 같은 분석법의 NCE은 포화 지방산과의 연결 기능 사이의 관계를 연구하는 기재.
서론
팔 미트 산 (PA) 등의 포화 지방산이 풍부한 다이어트는 비만과 심장 혈관 질환과 당뇨병 1, 2 등 다른 동반 질환에 연결되어있다. 고지방 사료 또한 산화 스트레스, 아폽토시스 및 시상 하부 신경 변성, 식욕 및 에너지 비용 3-7의 중요한 레귤레이터를 증가하는 것으로 나타났다. 높은 지방 다이어트 노출 시상 하부 조절 장애를 유발 통해 메커니즘을 이해하는 것은 비만에 대한 약물 치료의 발전을 위해 이렇게 중요합니다. 그러나,식이 지방이 신경 세포의 기능에 영향을 미치는 통해 세포 메커니즘은 불분명하다. 이러한 PA 등의 지방이 시상 하부의 세포 사멸 경로의 발병을 유발하는 방법의 더 나은 이해는이 목표를 향해 필요한 첫 번째 단계입니다. 이 문서의 목적은 시간의 연구에 사용하기 위해 개발 PA 노출에 신경 반응의 시험관 테스트를위한 다중 분석을 설명하는 것입니다ypothalamic 신경 퇴행. 우리는 PA 8 산화 공격 후 (A12)의 이용 차별화 된 불후의 성인 마우스 시상 하부 세포주에서 세포의 총 수 당 3 / 7 활동 카스파를 측정하기위한 시험 관내 96 - 웰 형식의 멀티 플렉스 분석에 대한 자세한 설명을 제공한다.
간단히, 세포 생존....
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프로토콜
세포 배양 1. 도금 및 유지
- 따뜻한 둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 배지 (DMEM + 10 % FBS + 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신) 37 ° C까지
- -80 ° C.에서 냉동 A12 세포의 주식을 확보
- 빠른 속도로 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동; 한 번 해동, 부드럽게 피펫 세포는 75cm 2 배출 문화 플라스크에 전송하고 배양 배지 10 ㎖를 추가 할 수 있습니다.
- 37 ° C에서 5 % CO 2 배양기에서 플라스크 하룻밤을 품어 미디어를 대기음 24 시간 후 신선한 용지로 교체합니다. 70-80% 합류는 (2 ~ 3 일 성장)을 얻을 때까지 세포 성장을 계속합니다.
2. 계수 및 도금 세포
- 따뜻한 DMEM 37 ° C.에 1X-트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 솔루션
- 세포와 미디어를 대기음은 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)로 2 회 세척한다.
- 트립신 용액 500 μl를 추가하고 2-5 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
- 분리스크레이퍼를 사용하여 미디어의 5 ML에있는 세포를 일시....
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결과
프로토콜은 위 세포 죽음의 메커니즘을 결정하는 다중 두 개의 분석 결과를 설명합니다. 그림 1 세포 생존 및 카스파 제 3 / 7 활동을 결정하는 프로토콜에 대한 개요를 보여줍니다. 카스파의 활동은 크게 2 시간 배양 (그림 2A 표 1) 후 PA에 도전 세포에서 증가했다. 세포막의 무결성의 손실은 PA (그림 2B)에 2 시간 노출 후 세포에서 명백한 세포 사멸 유도와 관련된 형태 학적 변화이다. 그림 3은 PA가 세포 사멸을 유도 배양 최적화의 중요성을 설명하는 잠재적 인 경로를 설명 DEVD 시약의 시간.
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토론
멀티 플렉스 분석은 PCR 마이크로 어레이, 면역 및 기타 단백질 기반 검출 방법 13, 14 등 다양한 응용 프로그램에서 과학자들에 의해 사용 된 잘 받아 기술이다. 최근, 다중 분석이 점점 체외 플레이트 기반의 실험에 이용하고 세포 독성을 평가하는 정확한 방법으로 검증하고 12 생존 한되었다. 위의 프로토콜에서는, 우리는 PA의 반칙으로 A12 세포에서 카스파 제 3 / 7 활동과 세포 생존을 결정하는 다중 형광 및 발광 분석법의 효과를 보여줍니다. 세포 생존이 가능한 세포의 신속하고 신뢰할 수있는 표현을 허용, 초기 PA 모욕의 10 분 이내에 결정 하였다. 그것은 rezasurin 기반 시약 측정 할 상기 끝점을 허용 생균 분석법임을 주목해야한다; 그러나, 카스파 제 3 / 7 활성을 측정하기 배양 시간을 최적화 된 essentia입니다유용한 결과 15를 얻기 위해 L.
아폽토시스는 외부 자극,.......
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공개 사항
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
감사의 글
여기에 설명 된 작업은 재향 군인의 업무의 미국학과 생물 의학 연구소 연구 개발 BX001686-1A1와 VA 재활 연구 및 개발에 의해 투자되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 성체 쥐 Hypothalamus 세포주 mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. (셀루션스 바이오시스템즈) | CLU172 | |
| 둘베코' 의 변형된 독수리' s 미디엄 | 인비트로젠 | 10313-039 | |
| 소태아 세럼 | PAA Labs | A15-751 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 인비트로겐 | 15070-063 | |
| 팔미트산 | 시그마-알드리치 | P0500 | |
| 디메시 설폭사이드 | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue 세포 생존도 시약 | Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 분석 시스템 | Promega | G8091 | |
| 96 W 광학 바닥 플레이트, 검은색 폴리스티렌, 세포 배양 처리, 뚜껑 포함, 멸균 | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 다중 모드 마이크로플레이트 | 분자 장치 |
참고문헌
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, ....
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재인쇄 및 허가
