재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 양성 유방의 생체 구조를 요점을 되풀이하고, 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별 할 수있는 유용한 방법입니다. 중요한 것은,이 시스템은 다른 조직에서 침습성 암 연구에 적용 할 수있다.
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이 논문에서
요약
초록
침윤성 암은 전이에 인접 조직과 성향의 침입을 특징으로 악성 상피 종양의 그룹입니다. 암세포 및 그들의 미시 사이에서 신호의 상호 작용은 유방암의 성장 및 생물학적 행동 하나에 강력한 영향을 미친다. 그러나, 세포 외 기질 (extracellular matrix)에서이 신호의 대부분은 손실되거나 세포가 단층으로 두 가지 차원의 문화 (2D)에서 재배 할 때의 관련성은 understudied 아르됩니다. 최근, 재구성 기저막의 입체 (3D) 문화는 양성 및 악성 유방 세포의 조직 구조를 다시 요약 선택의 방법으로 떠오르고있다. 3D에서 자란 세포는 세포 외 기질에서 중요한 단서를 유지하고 생리학 관련 생체 시스템 2,3을 제공합니다. 참고로, 제 4에 비해 3D로 성장하면 세포가 다르게 행동 것을 제안 성장하는 증거가있다. 3D 문화효과적으로 3 개인 양성 유방 표현형에서 악성 표현형을 구별하는 수단으로하고 세포 및 분자 시그널링을 뒷받침 위해 사용될 수있다. 양성 상피 세포의 구별되는 특징 중 하나는 꼭대기 세포질은 루멘으로하고 기초 세포질이 기저막에 달려있다 그래서 그들은 편광되는 것입니다. 이 apico - 기초 극성은 세포의 해체와 우연히 주변의 기질에 침투 세관을 anastomosing 및 분기의 형성을 특징으로 침윤성 암에 손실됩니다. 양성 선 및 침윤 암 사이의 이러한 조직 병리학 적 차이는 3D 6,7에서 재현 할 수 있습니다. 다른 분자 및 세포 생물학 기술, 3 차원의 cultur와 함께 세포 증식, 극성 및 세포 사멸에 대한 검증 분자 마커의 발현을 차등 한 라운드 선포 구조의 정량과 같은 적절한 읽기 아웃을하거나 사용전자 나은 악성 변환시와 책임 신호를 서술의 세포 변화를 이해하는 중요한 도구를 제공 할 수 있습니다.
서론
재구성 기저막에 유방 상피 세포의 3 차원 배양 (3D)는 복잡한 표현형 정상 유방과 유방암 2,3의 관련 신호를 연구하는 중요한 모델 시스템입니다. 유방의 기능 단위는 꽈리에있는 나뭇 가지의 작은 관으로 구성 터미널 덕트 소엽 단위 (TDLU)입니다. 선포 세포는 기저막 (5)에 의해 둘러싸여있다 두 세포층, 상피 및 근 상피 세포로 구성된 매우 조직 구조이다. 일반 선포 세포의 가장 두드러진 특징은 휴대 편광, 기본 기저막에 부착 전문 세포 - 세포 연락처입니다. 이 복잡한 조직은 침략 암에 중단됩니다. 세포는 단층으로 재배되는 널리 사용되는 2 차원의 문화, 선포 세포의 형성을 허용하지 않습니다. 따라서, 단층 배양 상피 세포 간의 복잡한 관계를 캡처하는 시스템을 제공 부족정상 유방과 유방암에서의 규제 완화. 유방 세포의 기능 monotypic 상피 문화는 여러 실험실 2,3에서 개발되었다. 3D 배양 Engelbreth-홀름 - 스웜 마우스 육종 세포 유래 가용화 엑기스이며 시판되고 리겔에 유방암 세포의 성장을 포함한다. 콜라겐 같은 다른 3D 하층은 I도 사용된다. 유방 세포는 세포가 매트 리겔이에 매립 배양 3D 임베디드 분석법에 의해 3 차원으로 배양 할 수있다. 또한, 세포는 또한 리겔의 적은 ....
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프로토콜
1. 재료의 준비 및 문화 미디어
- 4 ° CO / N.에 (GFR) 리겔 감소 해동 성장 인자
- 37 ° C.에 필요한 세포주에 대한 완벽한 미디어를 따뜻하게 MCF10A-ATCC는 미디어를 지정; HME-햄 F-12 배지는 5 % 소 태아 혈청, 1 ㎍ / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ㎖의 인슐린, 10 ng의 / ㎖의 표피 성장 인자, 및 100 NG / ㎖ 콜레라 독소로 보충; 5 % FBS, 2 ㎍ / ㎖의 하이드로 코티손, 5 ㎍ / ml의 인슐린 보충 SUM149 햄의 F-12 미디어; 및 MDA-MB-231-10% FBS-DMEM
- 얼음에 8 잘 챔버 슬라이드를 Precool.
- 조직 문화 후드 및 용품을 준비합니다.
8 잘 회의소 슬라이드 2. 3 차원 문화
- 코트 각 GFR 마트 리젤의 40 μL와 8 아니라 슬라이드의 잘. 슬라이드의 중앙에 리겔을 추가 한 다음 P200 피펫 팁을 사용하여 확산. 거품을 피하고으로 이어질 수있는 overspreading, 가능한 한 균일 확산을 시도메 니스 커스 (meniscus)를 형성.
- 5 % CO 2에서 37 ° C에서 슬라이드를 품어. 리겔이....
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결과
3D 배양 효과적으로 양성 유방에서 인간 유방 상피 세포의 악성 표현형을 구별 할 수있다. 리겔에 도금 단일 양성 세포는 쉽게 위상 콘트라스트 이미지를 사용하여 하나의 평면에 하나의 둥근 플랫 선포 세포로 이미지화 할 수있는 조직 구형 구조로 성장한다. 마트 리겔에 도금 한 악성 세포가 우연히 성장 매우 높은 굴절률을 표시 한 평면에서 이미지 어렵다. 도 1에 도시 된 바와 같이 고도로 전이성 유방암 세포주 SUM149 및 MDA-MB-231이 그들로부터 나오는 프로세스와 관형 구조 분파으로 성장하는 반면, 양성 HME 및 MCF10A 세포는 구형 찾고 선포 세포를 형성한다. 양성 표현형에서 이러한 편차로 사용할 수있는 악성 형질 전환을 확인하기 위하여 판독 및 종양 억제 또는 종양 촉진제로서 분자의 기능을 정의하기 위해 사용될 수있다. 도 2, 종양 억제 유전자의 CCN6 t의 녹다운 (KD)에 나타낸 바와 같이악성 변환을 조립 정비공. 아래 렌티 바이러스 매개 형.......
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토론
우리는 여기에서 재구성 기저막에 유방 상피 세포의 세 가지 차원의 문화와 악성 대 양성 유방 표현형을 구별하는이 시스템의 유용성을 설명했다. 이 시스템은 또한 다른 선의 조직 배양에서 다른 세포 유형에 이용 될 수 있고, 성공적으로 12-14 몇 가지 이름을 배양 전립선 상피 기관지 상피 및 갑상선 상피 세포에 사용 된 것으로보고되었다. 3D 배양의 중요성은 생리 학적으로 관련 모델이라는 사실에있다. 3D 문화가 악성 변환하는 동안 선의 건축의 중단에 이르게 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수있는 방법을 제공합니다. 또한 암 치료를위한 새로운 치료 표적을 선별에 도움이 될 수있는 작업 모델 시스템을 제공합니다. 2D 문화에 효과가 발견되는 많은 약물 종종 실험 및 임상 applictai에 거의 영향을 미치지기능 15. 이러한 3D 문화로 생체 내에서 화합물의 효과를 예측하는 중요한 임상 도구를 제공 할 수있다.
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R01 CA107469, R01 CA125577 및 CG KLEER, 미시간의 암 센터 지원 대학에 U01CA154224에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 성장 인자 감소 Matrigel | BD Biosciences | 354230 | 반복 동결 해동을 피하십시오 |
| Lab-Tek 유리 햄버 슬라이드 8-웰 | Thermo Fisher Scientific 177402 | 얼음 위에서 미리 냉각 | |
| Lab-Tek 유리 챔버 슬라이드 2-웰 | Thermo Fisher Scientific | 177380 | 얼음 위에서 예열 |
| 염소 안티 마우스 F(ab´)2 fragment | Jackson Immunoresearch | 115-006-006 | |
| Normal goat serum | Jackson Immunoresearch | 005-000-121 | |
| Fluorescent conjugated Alexa antibodies | Molecular Probes | 분자 프로브 웹사이트를 참조하십시오. | |
| Molecular Probes | P36935 | 로 금 퇴색 방지 시약을 연장하십시오 | |
| 수확 키트 | Trevigen | 3448-020-k | |
| Anti-Apha-6-integrin | Fisher Scientific | MAB1378 | Biosciences에 대한 1:100 희석 |
| 610822 | IF | ||
| Anti-phospho-histone 3 (Ser10)FITC Conjugated | Fisher Scientific | 16-222 | 1:100 희석, IF |
| Anti-Cleaved caspase 3 (Asp 175) | 세포에 대한 1:100 희석 IF | 9661s | 1:50 희석 |
| 610181 | IF에 대한 1:200 희석 |
참고문헌
- Arendt, L. M., Rudnick, J. A., Keller, P. J., Kuperwasser, C. Stroma in breast development and disease. Semin. Cell Dev. Biol. 21, 11-18 (2009).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial aci....
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재인쇄 및 허가
