유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

나노 물질은 요즘 생물 의약 ¹ 잠재적 인 응용 프로그램을위한 생명 과학자의 관심을 고취하고 있습니다. 무기 및 유기 물질의 다양한 물리적 상이한 형상 및 화학적 특징으로 나노 구조체를 제조하는데 사용될 수있다. 이러한 구조 중, 구형의 설계 나노 입자 진단 및 번역 상 약 ² 큰 잠재력을 보여 주었다. 핵심 표면 디자인 가능한 애플리케이션에 의해 구동되고 있으며 나노 접촉과 상호 작용을 다음 표적 세포 반응의 심오한 연구를 의미한다. 의도적으로 인체에 투여 될 것으로 생각되고 나노 입자는 면역 세포의 여러 종류가 직접 닿지 것이다. 몸의 무결성을 유지하기 위해 자신의 책임은 그 나노 의학 ³ 조사의 중요한 주제 있습니다.

타고난 면역 시스템의 세포 부분은 주로 phago로 표현된다cytes. 그 중에서도, 단핵구 / 대 식세포 계통은 중추 신경계 상주 미세 아교 등 유래 세포는 면역 방어 ^4,5에서 중요한 역할을한다. 그들은 외국기구와 발생 후 몇 시간 이내에 보호 반응을 트리거 할 수 있습니다. 또한, 단핵 세포는 좌표와 사이토 카인의 방출을 통해 적응 면역 반응을 지시합니다. 이러한 모든 이벤트도 크게 면역 시스템 ^(6)에 의해 "비 자기"로 인식되는 설계 자료의 존재에 발생합니다.

역사적으로 세포 분석을위한 면역학에서 사용되는 방법 중, 가장 강력한 도구 중 하나를 나타내는 유동 세포 계측법. 또한, (종종 배제 또는 하나의 세포막 단백질의 존재를 악용) 특정 면역 모집단의 확인 또는 정제를위한 기술들은 허용 가능한 특정 일차 CE에 특정 나노 입자의 효과를 정밀 조사LL 형 ^7. 그러나 세포는 나노 입자에 노출 된 후 생리 및 형태 학적 변화를 제시 할 수있다. 뿐만 아니라, 나노 입자는 얻어진 결과 ^{8에 영향을} 미치는 정의 파장에서 같은 빛의 흡수 또는 방출과 같은 특정 광학 매개 변수를 방해 할 수 있습니다. 그래서, 사용 및 새로운 재료의 연구에 고전 면역 학적 분석의 궁극적 인 적응의 한계는 고려되어야한다.

이 작품은 유동 세포 계측법에 의해 기본 면역 세포와 나노 입자의 상호 작용의 검출에 관한 것이다. 이 문제를 해결하기 위해, 50 nm의 _FITC-SiO2로 나노 입자는 방법을 설명하기위한 모델 나노 재료로서 사용 하였다. 실리카 입자는 나노 미터 스케일에서 매우 정확한 방식으로 제조 할 수있다. 이러한 전하 또는 소수성과 같은 크기, 모양 및 표면 특성은 미세하게 자신의 생체 적합성 ^9를 증가하도록 조정 할 수 있습니다. _이 나노 입자들을 사용할 수 있도록 많은 기능의 SiO약물 전달을위한 모델은 ^{10 입자.} 또한, 형광 염료 또는 양자점 포획 또는 영상을 목적으로 ¹¹ 유용한 나노 도구를 제공하는이 입자에 연결 할 수 있습니다.

윤리 선언문

인간과 동물의 샘플이 건강의 이탈리아 교육부의 지침에 따라 처리 된 법 92분의 116 및 유럽 공동체위원회 지침 86/609/EEC.

1. 단핵구 세포 배양

1. 10 % 인간 혈청, 50 U / ㎖ 페니실린 및 50 ㎎ / ㎖ 스트렙토 마이신, 5 % CO _2에서 37 ° C에서 0.05 MM의 β-머 캅토 에탄올로 보충 RPMI-1640 배지가 포함 된 T-75 플라스크 문화 인간 THP-1 세포.
2. 분리 배양 할 때 합류 (매 3-5 일).

2. 버피 코트에서 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC를)의 분리

1. 분리 프로토콜을 시작하기 전에 인산 완충 식염수 (PBS)의 pH 7.2의 용액을 준비하고, 2 mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 버퍼 (세척 1 95 ml로 5 ㎖ BSA 스톡 용액을 첨가 0.5 % 소 혈청 알부민 (BSA), : (20) 희석). 버퍼 가스를 제거하고 2-8 (차가운 곳에 보관° C).
   중요 : 거품이 분리 컬럼 (단계 3.2 참조)를 차단할 수 있기 때문에 버퍼가 최적이보다 결과가 발생할 수 있습니다 가스를 제거하지 못하면.
   참고 : 항응고제 시트르산 덱 스트로스 식-A (ACD-A) 또는 시트 레이트 포스페이트 덱 스트로스 (CPD)가 대안 적으로 사용될 수있다. 반대로, 다른 종의 다른 알부민 단백질이나 혈청 BSA를 대체 할 수있다. ^{칼슘 +} 마그네슘 또는 ^{2 +를} 포함하는 버퍼를 사용하지 마십시오.
2. (20~60년 이전 세) 건강한 기증자 버피 코트를 얻습니다.
3. 밀도 기울기 원심 분리 50 ML 원뿔 튜브를 준비합니다. 혈액을 처리 (각 관 희석 혈액의 35 ML을 처리 할 수​​ 있습니다) 각각의 빈 튜브에 피콜-Paque 15 ㎖를 추가 할 필요 튜브의 수를 결정합니다.
4. PBS / BSA / EDTA 용액 (1:4 희석) 24 ㎖의 혈액 8 ㎖를 희석.
5. 조심스럽게 (밀도 = 1.077 g / ㎖) 50 ML 원뿔 튜브의 각 피콜-Paque 위에 희석 된 솔루션을 계층. 혼합하지 마십시오혈액과 피콜-Paque.
   중요 : 혈액과 피콜-Paque의 혼합을 방지하기 위해 45 ° 각도로 튜브를 잡고 천천히 혈액 혼합물 층.
6. 4 ℃에서 30 분 400 XG에 원심 분리기 단핵 세포 (다국적 기업) 과립구 및 적혈구 침전물 반면 인해 피콜-Paque의 삼투압에 높은 밀도, 플라즈마 피콜-Paque 인터페이스에 남아있을 것입니다.
7. 4 ℃에서 10 분 동안 300 XG에 PBS / BSA / EDTA와 원심 분리기로 가득 찬 새로운 50 ㎖ 튜브에 계면 세포 (말초 혈액 단핵 세포, PBMC를)을 전송
8. 혈소판을 제거하는 PBS / BSA / EDTA로 두 번 펠렛을 씻으십시오. 4 ℃에서 10 분 동안 200 XG에 스핀
9. 10 % 인간 혈청과 항생제 또는 단핵 세포 정화를 진행 완료 RPMI-1640 문화가 세포.

3. PBMC를 차에서 단핵구의 정화

1. 험을 사용하여 자기 비드 분리가 된 PBMC에서 단핵 세포를 분리팬 단핵구 분리 키트 :
   1. 가능한 세포 덩어리를 제거하기 위해 30 μm의 나일론 메쉬 (preseparation 필터, 30 μM)을 통해 세포를 전달합니다.
   2. 혈구를 사용하여 세포 수를 결정합니다.
   3. 실온 (RT)에서 10 분 300 XG에 원심 분리기 세포 현탁액. 대기음이 완전히 뜨는.
   4. 10 ⁷ 전체 세포 당 PBS / EDTA / BSA 버퍼 30 μL의를 Resuspend 세포 펠렛.
   5. 10 ⁷ 전체 세포 당 차단 시약 10 μL의 FcR를 추가합니다.
   6. 10 ⁷ 전체 세포 당 비오틴 항체 칵테일의 10 μl를 추가합니다.
   7. 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 5 분 동안 품어
   8. 10 ⁷ 전체 세포 당 버퍼의 30 μl를 추가합니다.
   9. 10 ⁷ 전체 세포 당 안티 - 비오틴 마이크로 비즈의 20 μl를 추가합니다.
   10. 잘 혼합하고 2-8 ℃에서 10 분 동안 배양
   11. PBS / EDTA / BSA 버퍼 500 μL에 10 ⁸ 셀을 재현 탁.
2. 자기 저전압 회로 차단기ATION
   1. 이에 따라 총 세포 수에 적절한 MACS의 기둥 및 MACS 분리기 (MACS 열 시트를 참조하십시오)를 선택합니다.
   2. MACS 분리기의 자기장에 열을 놓습니다.
   3. PBS / EDTA / BSA 버퍼의 적절한 양의 세척에 의해 열을 준비 (MS 열 : 500 μL, LS 열 : 3 ㎖).
      참고 : 열은 "흐름 정지"하고 건조 실행되지 않습니다.
   4. 칼럼에 세포 현탁액을 적용합니다. 풍부한 단핵구 분율을 나타내는 레이블이없는 세포를 포함하는 흐름을 통해 수집합니다.
   5. PBS / EDTA / BSA 버퍼 (MS 500 μL 및 세척 당 LS 3 ml)로 열 배를 씻으십시오.
   6. 풍부한 단핵구 세포를 대표하는, 통과 레이블이없는 세포를 수집하고, 3.2.4 절에서 흐름을 통해 추가 할 수 있습니다.
      참고 : 열 저수지가 비어있는 경우에만 PBS / EDTA / BSA 버퍼 분주을 추가하여 열을 씻으십시오.
   7. (선택 사항)에서 열을 제거구분과 적절한 포집 관에 놓습니다. 칼럼에 버퍼를 피펫 (1 ㎖를, LS 열 : MS 열 5 ㎖). 즉시 단단히 열에 플런저를 밀어 자기 표시 nonmonocyte 세포를 세척하십시오.
   8. 문화는 10 % 인간 혈청과 항생제로 완전한 RPMI-1640 단핵 세포를 정제.

4. 전체 혈액에서 단핵구 차의 정화

1. 제조업체의 지침에 따라 전체 혈액 단핵 세포 분리 키트를 사용하여 전혈에서 단핵 세포를 정화.

5. 혈액 백혈구 및 정제 된 단핵 세포에 나노 입자의 국제화

1. 12 - 웰 플레이트에 고립 된 PBMC 또는 정제 된 CD14 양성 단핵 세포 접시 5 × 10 ⁵ 세포 / ㎖ (1 ㎖ / 웰).
2. 100 nm의 작업 농도에 완전 배지에서 소용돌이 FITC-그런가 ₂ 나노 입자 원액과에 resuspend.
3. 작업 nanop의 10 μl를 추가합니다1 nm의 나노 입자의 최종 농도에 도달하는 처리 샘플 문서 서스펜션 (100 NM). 각 웰에 처리되지 않은 컨트롤에 대한 완전한 매체의 동일한 볼륨을 추가합니다.
4. 1 시간의 내면화는 1.5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 샘플을 수집하고 RT에서 6,000 XG에서 3 분을 원심 분리 한 후.
5. RT에서 6,000 XG에서 버퍼 3 분의 실행 1 ㎖로 펠렛을 씻으십시오.
6. 버퍼를 실행 200 μL에 펠렛을 Resuspend. 세포는 이제 유동 세포 계측법에 의해 읽기위한 준비가되어 있습니다.

6. 주 혼합 된 아교 문화의 절연 (Bertero보기 등. ⁷⁾

7. 혼합 된 아교 플루 세포 배양을 Replating

1. 다음 센과 10 ㎖를 추가하고 5-7 분 동안 37 ° C에서 알을 품다, (W / CA ^{2 +} / 마그네슘 ^{2 +} O) PBS 10 ㎖로 한 번 T-75 플라스크를 씻으십시오.
2. T-75의 표면에서 세포를 분리하고 해산하기 위해 위아래로 여러 번 뜨는을 피펫세포 집합체.
3. 15 ML의 폴리 프로필렌 튜브에 세포 현탁액을 전송합니다. 혈구와 세포를 세는 세포 현탁액의 소량을 모은다.
4. RT에서 300 XG에서 5 분 동안 세포 현탁액을 원심 분리기.
5. 상등액을 제거하고 신경교 완전 배지에서 5 ^× 105 세포 / ml의 최종 농도로 펠렛을 재현 탁.
6. 24 웰 플레이트에 0.5 ㎖ / 잘 플레이트 및 세포 나노 입자 치료 전 2-4 시간 동안 정착하자.

8. 소교 세포에 나노 입자 국제화

1. 각 웰 (치료 컨트롤에 대한) 완전한 아교 세포 배양 배지 500 μL 또는 (처리 샘플에 대한) 완전한 아교 배지에서 2 배 로다 민 - 그런가 ₂ 나노 입자 현탁액 500 μl를 추가합니다.
2. 선택한 시점에서 nonrapid 고착 세포의 분리를 허용하고 2 ㎖의 폴리 프로필렌 튜브를 수집하는 세포를 피펫.
3. 500 μl를 추가합니다센과의 각 웰에 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어 다음 나머지 세포 분획을 분리하고 이전 단계의 해당 nonadhering 세포를 각각의 샘플을 수집합니다.
4. RT에서 300 XG에서 3 분 동안 원심 분리.
5. 버퍼를 실행 AutoMACS 100 μL에 펠렛을 Resuspend.

9. 는 CD11b-VioBlue로 염색

1. 버퍼를 실행에 세포 현탁액 (1시 11분 비율) 100 μL에 VioBlue-CD11b를 인간 / 마우스 항체의 10 μl를 추가하고 4 ℃에서 10 분 알을 품다
2. 버퍼를 실행의 1 ML을 추가하고 세포 현탁액을 섞는다.
3. 300 X g에서 3 분 동안 원심 분리기 각 샘플.
4. 뜨는을 취소하고 버퍼를 실행하는 100 ~ 150 μL에 펠렛을 재현 탁.
5. 사이토에 샘플을보기 (마지막 두 단계 사이에 4 ° C에서 샘플을 저장).
   중요 : 샘플을 분석하기 전에, 중복 신호의 보상을 진행 난N 방출 스펙트럼은 서로 다른 형광 색소 (fluorochrome가 공역 나노 입자 또는 항체) 사이에서 관찰.

10. 보상 이상의 스펙트럼 유출

1. "기기 설정"상자 (모든 기기의 소프트웨어 프로그램에 존재)를 엽니 다.
   주 : 자료 표에보고 된 것과 다른 악기를 사용하는 경우, 수집 정보의 악기 별 설명서를 참조하십시오.
2. 낮은 유체 속도 (기기에 의해 허용 된 경우)에서 (나노 입자없이) 처리되지 않은 샘플을 획득. 획득 동안, 수동으로 채널 전압을 조절함으로써 조절 전방 및 측면 산란 (각각 FSC와 SSC,).
   참고 : 최상의 음모에 전체 세포 인구를 시각화하기 위해 SSC와 FSC 축 스케일을 수정합니다. 그 각각의 세포 유형에 대한 템플릿을 설정하는 계기가 만들어 저장하고 미래의 인수를 사용할 수 있습니다.
3. 특정를 엽니 다소프트웨어의 "지역"탭을 선택합니다. 원하는 인구의 주위에 적절한 큰 지역 ( "문")을 그립니다.
   참고 : 나노 입자의 국제화가 세포의 SSC 변화를 유도한다. 게이트가 너무 밀접 그 세포 집단의 주위에 제한되는 경우에, 취득 된 데이터가 아마도 검출 될 셀 부분을 놓칠 것이다.
4. 두 흠 샘플, 빈 샘플로 사용하기 위해 하나 PI 염색 (선택 사양)에 대한 보상을위한 하나, 보상 될 각 형광 채널에 적합한 형광 색소와 하나의 스테인드 샘플을 사용합니다.
   참고 : 실험 라벨에 사용되는 각 형광 색소 - 공액 항체 다른 1.5ml의 샘플 튜브를 사용한다.
5. "기기 설정"상자에서 "보상 탭"을 엽니 다. 증가 또는 유출 채널에서 형광 강도는 형광 색소 POS 대해 대략 동일 할 때까지 수집하는 동안 보상 계수를 감소을 직관적이고 부정적인 인구.
6. 보상이 조정 된 후 나노 입자 처리 된 샘플을 획득.

계측법 다른 셀을 식별하고 특성화하는 유용한 도구이고 그런 단핵구, 과립구, T 세포, B 세포, 자연 살해 (NK) 세포, 수지상 세포와 같은 특정 면역 세포를 식별하는 선택의 기술이다 ​​흘러 백혈구의 다른 모집단.

더 나은 나노 입자에 대한 응답으로 백혈구 동작을 특성화하기위한 노력의 일환으로, 우리는 (THP-1 세포, 그림 3) 건강한 기증자의 혈액 (그림 1, 2)에서 인간 단핵구 세포주에 고립 된 차 백혈구와 국제화 분석을 수행 .

도 1a에보고 된 바와 같이, 세 가지 주요 혈액 백혈구 모집단 명확 PBMC를 분리 한 후에 전방 및 측면 산란에 의해 확인되었다. 또한, FITC-SiO2를 처리 한 후, 림프구 (회색), 단핵 세포 (파란색)와 과립구 (적색) 다른 N이같은 녹색 형광 강도 (그림 1B)로 표시 anoparticle의 국제화 속도. 설명 프로토콜 된 PBMC에서 기본 CD14 양성 단핵 세포의 정화. 그림 2A는 FITC-그런가 2의 존재 CD14 + 단핵 세포의 도트 플롯 유동 세포 계측법을보고 할 수 있습니다. 그림 2b는 표시 같은 세포에서 계량 및 표현 FITC-SiO2를 내면화 로그 스케일 히스토그램.

유사 내재화 실험은 FITC-SiO2로 나노 입자의 농도 증가로 처리 THP-1 단핵 세포에서 수행 하였다. 처리되지 않은 세포는 대조군으로 사용 하였다. 그림 3a는 THP-1 세포주에서 산란 변경 전방과 측면 산란 용량 의존적 증가를 보여줍니다. 그림 3b에 함께 각 시험 FITC-그런가 2 나노 입자의 농도 SSC와 FSC의 히스토그램, 형광 강도를 의미 (MFI) 정량화가 표시됩니다. 이 데이터는 FITC-그런가 2 나노 입자 치료는 세포 단위의 향상 (측면 산란)과 형광 (녹색 채널)에 의해 강조 단핵 세포에서 농도 의존적 내면화를 유도하는 것이 좋습니다.

면역 세포와 나노 입자 사이의 상호 작용의 타입으로 추가 통찰력을 얻기 위해, 주 혼합 신경교 배양 격리시키고, 미세 아교 세포는 중추 신경계 상주 면역 세포를 정제 하였다. 녹색 형광 미세 아교 세포를 발현하는 형질 전환 마우스 모델의 사용은 다른 신경 염증 기전의 시각화를 허용한다. 이 작품에 사용 된 형질 전환 마우스 B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J는 CX3CR1 프로모터 (12)의 제어하에 녹색 형광 단백질 (GFP)을 표현한다. 시험 관내 (DIV) 7 일 후, 형광 현미경은 성상 세포의 큰 숫자 (GFP 부정적인 자기편 세포와 혼합 차 아교 문화를 보여줍니다들) 및 일부 녹색 세포 (GFP 양성,도 5a). GFP - - (성상 교세포 및 다른 신경 교세포), 미세 아교 세포는 CD11b + GFP + 세포의 제 별개 기 및 제 CD11b를이 마우스 모델에서, 세 가지 폐해 모집단은 단일는 CD11b 항체 염색하여 유동 세포 계측법에 의해 구별 될 수있다 세 번째는 CD11b +의 GFP - 모집단 (그림 4A). 분석 (그림 4B) 유동 세포 계측법에 의해 도시 된 바와 같이이 두 후자의 모집단은 모두 (CX3CR1 프로모터의 전사에 의한 순찰 미숙 미세 아교 세포를 나타내는) GFP + 인구에 의해 약간의 효율성 향상과 나노 입자를 내면화 할 수 있습니다. 발생한 내재화 더욱도 5b에 도시 된 바와 같이 로다의 SiO2 나노 입자의 동일한 최종 농도를 사용하는 공 초점 현미경에 의해 확인 될 수있다.

대 (FSC)를 산란 FITC-그런가 2 나노 입자 CD14의 내면화 + 정제 단핵구.) 대표 전진 (SSC)로 정제하여 CD14 양성 단핵 세포의 도트 플롯 유동 세포 계측법. B) 녹색 형광 히스토그램 플롯 1nM 중에 FITC-그런가 1 시간 동안 2 나노 입자 (+45 MV는). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3. THP-1 세포 측 scatterin 대 (FSC)을 산란.) 대표 포워드에 FITC - 그런가 2 나노 입자의 내면화에 미치는 영향G는 (SSC) 앞으로 (FSC)와 녹색 산란, 측면 산란의 농도. B) 농도 의존적 변화 (SSC)를 증가 FITC-그런가 2 나노 입자의 1 시간 노출 다음, THP-1 단핵구 세포 라인의 도트 플롯 유동 세포 계측법 FITC-그런가 1 시간 동안 2 나노 입자 (+45 MV)의 존재 형광. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4. 홍보의 도트 플롯 세포 계측법는 CD11b-VioBlue 흐름 대 로다 민 - 그런가 B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J 생쥐에서 분리 된 주요 미세 아교 세포에 2 나노 입자의 국제화.) 녹색 형광 단백질 (GFP)B6.129P-CX3CR1 tm1Litt / J 생쥐에서 분리 imary 혼합 된 아교. 는 CD11b + GFP +와는 CD11b + GFP -. 인구 (30)에 대해 각각 오른쪽 상단과 오른쪽 하단 사분면, B) 1 nM의 로다 민 - 그런가 2 나노 입자 (+45 MV)의 존재에있는 미세 아교 세포의 모집단의 적색 형광 오버레이 히스토그램 플롯에 표시됩니다 분 제어 (회색 막대 그래프) 대 (빨강 막대 그래프). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 5. 7 DIV와 (B) 공 초점 현미경에 GFP + - 미세 아교 세포의 시각화. (A) 형광 현미경로다 민 - 그런가 2 나노 입자의 내면화 GFP + - 미세 아교 세포 (빨간색 화살표). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

저자는있는 Miltenyi 생명 공학 GmbH의이 원고의 제출을​​ 후원하는 것을 선언합니다. HIQ 나노 회사 ( http://www.hiq-nano.com/index.html )는 나노 기술 IIT에서 생겨 회사를 분사합니다.