방법 논문

세포 표면 단백질 체학 (Proteomics)에 대한 글리코 펩타이드 캡처

DOI:

10.3791/51349

⸱

2014년 5월 9일

 , 
1Department of Chemistry, Simon Fraser University

이 논문에서

요약

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세포 표면 단백질은 생물학적으로 중요하고 광범위 글리코 실화이다. 우리는 손쉬운 LC-MS 기반 단백체 분석을 위해이 단백질을 용해 풍부하고 deglycosylate 여기 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다.

초록

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세포 외 기질 단백질을 포함한 세포 표면 단백질은, 이러한 성장, 분화, 증식 등의 모든 주요 셀룰러 프로세스 및 기능에 참여합니다. 이 단백질의 포괄적 인 특성은 바이오 마커 발견, 세포 유형 식별 및 약물 표적 선택뿐만 아니라, 세포 생물학 및 생리학에 대한 우리의 이해를 사전에 도움 풍부한 정보를 제공합니다. 표면 단백질은, 그러나, 그들의 본질적으로 낮은 풍부, 소수성, 무거운 번역 후 변형의 중요한 분석 과제를 포즈. 표면 단백질에 널리 당화을 활용, 우리는 여기에 몇 가지 기존의 N-glycoproteomics 수단의 장점을 통합하는 높은 처리량 글리코 펩타이드 캡처 방법을 소개합니다. 우리의 방법은 표면 단백질에서 파생 된 글리코 펩타이드를 풍부하게하고 LC-MS를 사용하여 손쉬운 프로테오믹스에 대한 자신의 글리 칸을 제거 할 수 있습니다. 확인 된 N-glycoproteome는 INF를 포함한다단백질의 정체성과 양뿐만 아니라 포도당의 자신의 사이트의 ormation. 이 방법은 암, 줄기 세포, 약물 독성을 포함한 영역에서 일련의 연구에 적용되어왔다. 방법의 한계는 샘플의 상대적으로 많은 양의 세포질 단백질을 중심으로 연구와 비교하여 본 분석에 필요한되도록 표면 막 단백질의 낮은 풍부에있다.

서론

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세포 표면 단백질은 세포 외 환경과 상호 작용하는 세포의 외부에서 내부로의 신호를 중계. 따라서, 세포 외 기질 단백질을 포함하여 이러한 단백질은 세포 생물학 및 증식, 성장, 이동, 분화에서 등 노화에 이르기까지 생리학의 모든 측면에서 중요한 역할을한다. 표면 단백질이 다른 세포, 단백질과 작은 분자 1-3와 상호 작용에 의해 작동합니다. 약물의 60 % 이상이 세포 표면 단백질 4를 대상으로하는 등 세포 표면 단백질의 분자 특성은 생물 학자뿐만 아니라, 제약 회사를위한뿐만 아니라 큰 관심입니다.

뛰어난 감도, 정확성 및 단백질과 펩티드의 식별을위한 처리량 텐덤 질량 분석법 (MS)는 글로벌 프로테오믹스 연구 5,6를위한 강력한 도구이다. 그러나, 표면 단백질은, MS-기반 프로테오믹스에 상당한 도전을 제기대부분의 표면 단백질은 낮은 수량과 무거운 수정으로 존재한다. 표면 단백질의 막에 걸친 영역들을 소수성 렌더링; 이것은 특히 다중 경로 막 횡단 단백질에 대한 경우이다. 이 세제의 도움없이 수용액에 막 단백질을 용해하는 것이 곤란하다; 그러나 세제의 사용은 일반적으로 단백질 식별의 HPLC와 MS -1,7,8,8의 성능을 억제한다. 따라서, 막 단백질은 가난....

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프로토콜

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1. 수확 막

  1. 세포 펠렛 (~ 10 8 셀)에 프로테아제 억제제 칵테일 저장성 버퍼 (10 MM 트리스 - 염산, 10 밀리미터의 KCl, 1.5 mM의 MgCl2를, 산도 8.0)을 추가하고 얼음에 15 ~ 30 분 동안 품어. 를 Lyse 주사기 바늘 (5 ~ 10 패스)를 통해 샘플을 통과하거나 다운스 호모 게 나이저 (15 ~ 30 타)로 샘플을 균질화하여 세포. 용해의 효율을 확인하는 혈구와 트리 판 블루 염색법을 사용합니다.
  2. 3000 GX 15 분에 용해 액의 차등 원심 분리하여 미세 소체 분획을 확보 한 다음에 10 GX 2 시간. 우선 원심 분리 핵 분획 인 펠렛을 취득하고, 상층 액의 원심 분리 이후의 원형질막뿐만 아니라 막 - 결합 세포 기관 (8)를 포함 마이크로 솜 분획 인 제 펠릿을 생성한다. 최종 상층 액을 세포질 부분입니다. 더 분​​석가를위한 -80 ° C의 냉동고에 미세 소체 분수를 저장아래와 같습니다.

2., 용해 변성, 소화 막 단백질

  1. 변성 버퍼 (40 MM 트리스, 10 mM의 EDTA, 10 mM의 TCEP, 0.5 % Rapigest, 산도 8)에서 마이크로 솜 분획을 용해 ....

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결과

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실험 절차의 대표적인 흐름도는도 1에 요약되어있다. 라벨 및 상기 분류 단계는 선택적이며 상세는 최근 간행물 (18)에 기재되어있다. 또 다른 옵션은 수지와 반응하지 않는 비 변형 펩티드를 분석하는 것이다. 변형되지 않은 펩티드를 분석의 장점은 단단한 접합부에서 claudins 같은 비 - 글리코 실화 된 펩티드 및 단백질의 가능성 식별을 포함한다; 추가적인 장점은보다 정확한 정량이다. 이러한 장점을 바탕으로, 우리는 불리는이 방법 G lycocapture-ssisted-G의 lobal의 Q uantitative P의 roteomics (gagQP), 그리고 최근의 출판물 (18)에 분석을 자세히 설명합니다.

농축 방법 후에 취한 전형적인 글리코 펩티드 스펙트럼은도 2에 도시된다. 수득 글리코 펩타이드에서 N-글리 칸을 글리 칸 부착 아스파.......

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토론

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여기에서 우리는 세포 표면 단백질 프로파일에 대한 글리코 펩타이드 캡처 전략을 소개합니다. 방법은 분비 된 혈액에서와 단백질뿐 아니라 기타 체액 또는 세포 배양 배지에서 연구에 적용될 수있다.

방법의 성공은 샘플의 완전 분해에 의존한다; 따라서 소화 효율의 SDS-PAGE 특성화 특히 시료의 처음 분석을 위해 필요하다. 완전한 소화는 막 단백질에 대한 도전 할 수 있고, 단지 막 분획의 철저한 가용화 후 가능할 수있다. 가용화 처리는 세제가 도입 될 때 시작하고 우레아의 배양 후 종료한다. 구름 양이 요소를 추가하기 전에 샘플로 제시하지만, 요소 배양 후에 사라 따라서, 가용화 충분하다. 막 분획이 녹기 어려운 경우에는, 사용되는 세제의 양을 증가시킨다. 막 풍부한 조직 샘플에 대한뇌 및 지방 조직으로, 5 % Rapigest가 이용 될 수있다. 때때로, 강수량은 이전에 더 자주 인간 혈청 샘플에서 관찰 된 트립신 소화에 샘플을 희석하는 동안 나타날 수 있습니다. 이러한 침전.......

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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이 연구는 사이먼 프레이저 대학의 시작 기금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DTTSigma646563
TCEPSigma646547
IodoacetamideSigmaA3221
Rapigest SFWaters186001860
Sodium periodateSigma311448
PNGase FNew England BiolabsP0704S
Affi-Gel Hz 하이드라지드 겔Bio-Rad153-6047
TrypsinWorthington BiomedicalLS02115
Sep-Pak C-18 카트리지WatersWAT054955
Oasis MCX 카트리지Waters186000252
프로테아제 억제제 coctailSigmaP8340
UreaAmersco568
아황산나트륨Caledon8360-1
인버타제시그마I0408
&알파;-1 트립신시그마F2006
Ribonulease B시그마R7884
Avidin시그마A9275
오브알부민시그마A5503
콘알부민시그마C0755

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cho, W., Stahelin, R. V. Membrane-protein interactions in cell signaling and membrane trafficking. Annual review of biophysics and biomolecular structure. 34, 119-151 (2005).
  2. Tadevosyan, A., Vaniotis, G., Allen, B. G., Hebert, T. E., Nattel, S. G.

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Glycopeptide CaptureCell Surface ProteomicsN GlycoproteomicsPeptide EnrichmentLC MS AnalysisMembrane Protein IsolationGlycan OxidationPNGase F TreatmentSolid Phase ExtractionBiomarker Discovery

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