방법 논문

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

DOI:

10.3791/51385

⸱

2014년 4월 3일

 ,  , 
1Department of Chemistry and Biochemistry, University of Bern

이 논문에서

요약

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여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

초록

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화학 작용기의 도입을위한 전통적인 전략은 초기 체인 적절히 변경됨 포스 전구체를 추가하여 고상 합성을 사용하는 것이다. 그러나 오히려 짧은 시퀀스 합성 중에 사용 제한 조건이 방법론의 적용을 방해. 한편, 변형 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트는 핵산, 실제 응용의 광범위한 팔레트 변경됨 핵산의 사용을 위해 도로를 포장 전략으로 수많은 작용기 마일드 도입에 이용 된 빌딩 블록을 활성화 이러한 리보 자임하고 DNAzymes의 기능 태그 및 생성 등. 주요 과제 중 하나는 이러한 뉴 클레오 시드 유사체의 분리 및 특성에 이르는 방법론의 복잡함에 있습니다.

이 비디오 문서에서는, 우리는 살전의 합성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다전자 인 (III) 기반의 시약을 사용하여 유사체를 수정했습니다. 또, 생화학 적 특성 규명을위한 절차는 프라이머 신장 반응 및 TDT 테일링 중합에 중점으로, 누설된다. 이 상세한 프로토콜은 수정의 dNTPs 크래프트 조합 및 화학 생물학에서의 추가 사용을위한 사용이 될 것입니다.

서론

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5'-뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 ((D) NTPS)는 에너지의 보편적 인 통화되는 세포 물질 대사의 규제에 이르기까지 수많은 프로세스와 기능에 관련된 중요한 생체 분자의 종류를 나타냅니다. 이러한 기본적인 생물학적 변환에서의 역할뿐만 아니라, 자신의 수정 된 대응은 올리고 뉴클레오티드에 작용기의 도입에 대한 다양하고 가벼운 플랫폼, 잘 일반적으로 1,2 적용되는 자동화 된 고체상 합성을 보완하는 방법으로 전진했다. 사실, (D) NTPS은 RNA와 DNA 중합 효소 3 기판, 아미노산 4-13, 보론 산 14, 15, nornbornene 16, 다이아 몬도와 같은 잔류 17 일에 대한 사이드 체인 등의 기능 그룹의 풍부한 역할을 할 수 제공 organocatalysis 18 담즙산 19, 심지어 올리고 뉴클레오티드 (20)는 올리고 뉴클레오티드에 도입 될 수있다.

_content "> 핵산의 작용에 편리한 벡터를 나타내는 외에도, 수정의 dNTPs는 SELEX 및 수정 된 촉매 핵산 21-30과 다양한 실제 응용 프로그램 (10)에 대한 압 타머의 생성을위한 체외 선택 기타 관련 조합 방법에 종사 할 수있다 31-36. 수정의 dNTPs의 중합에 의해 도입 된 추가 사이드 체인은 선택의 실험 기간 동안 탐험 핵산 (37)의 다소 빈약 한 기능의 무기고를 보충 할 수있는 화학 물질 공간을 늘릴 생각된다. 그러나 이러한에도 불구하고 매력적인 특성과 합성 및 분석 방법 모두의 개발에서 만든 최근의 진보, 보편적으로 적용 가능하고 높은 항복 절차는 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 2.38의 씁니다 존재합니다.

이 의정서의 목적은 (때로는) 복잡한 절차 선도 t으로 빛을 발산하는 것입니다오 합성이 활성화 빌딩 블록 (그림 1B)의 생화학 적 특성. 특별한 강조가 종종 발견하기 어려운 또는 실험 섹션에 존재하지만 순수한 (D) NTPS의 분리 (그림 1)에 이르는 합성 경로의 성공적인 완료에 아직 중요한 모든 합성 세부 사항에 대해 설명하기로한다.

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프로토콜

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1. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 합성

선택의 합성 방법은이 방법은 일반적으로 신뢰성이 매우 몇 가지 측면 제품 (그림 1A) 39 리드 이후 루드비히와 에크 스테인에 의해 개발 된 절차를 따릅니다.

  1. 회 무수 피리딘 (2 ml)로하고, 밤새 진공 하에서 건조 후 적절 3'-OAC 보호 된 뉴 클레오 시드 (전형적 0.1 밀리몰)으로 공 증발. 동시에, 진공하에 밤새 건조 피로 인산 트리 부틸 암모늄 (0.13 mmol)을 첨가 하였다.
  2. 건조 피리딘 (0.2 ㎖)을 최소로 뉴 클레오 시드를 용해 및 공용 ​​매로 건조 디 옥산 (0.4 ml)에 추가합니다. 마지막으로, 2 - 클로로 -1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 온 (0.11 밀리몰)을 첨가하고 45 분 동안 실온에서 반응하도록 허용한다.
    주 : 특정 손질 2 - 클로로 -1,3,2 - benzodioxaphosphorin -4 - 온 시약으로 이동해야 주목할 만하다. 실제로, 불활성 가스 atmosp에서이 시약에서도 스토리지여기의 분해를 방지하기에 충분하지 않다. 따라서,이 분해에 형성되는 백색 고체를 사용하기 전에 긁어되어야 할 수있다.
  3. 건조 DMF (0.17 ㎖)에 트리 부틸 피로 인산 용액 및 새로 증류 부틸 준비 (58 μl를, 분 자체를 추가하지 않습니다). 반응 혼합물 (백색 침전물이 나타나지만 빨리 사라)로 생성 된 용액을 추가 45 분 동안 실온에서 반응하도록 허용한다.
  4. 요오드의 용액을 피리딘 (0.16 밀리몰) (0.98 ㎖) 및 H 2 O (20 μL)을 준비하고 (III) 중심 Pα를 산화시키기 위해, 반응 혼합물에 추가한다. 생성 된 짙은 용액은 실온에서 30 분 동안 교반하도록 허용.
  5. I 2 과잉을 해소하기 위해 NAS 2 O 3의 10 % 수용액을 사용합니다. 진공 하에서 용매를 제거 하였다 (회전 증발기의 수조의 온도는 30 ℃ 이하로 유지되어야한다). H 2 O (5 ㎖)을 추가하고 MI에게 허용환상 인산 잔기를 가수 분해 실온에서 30 분 동안 서서 xture.
  6. 이 단계에서, 보호기는 일반적으로 (3'-OAC 및 핵 염기의 측쇄에 개 즉) 제거된다. 결과적으로, 조 질의에 NH 4 OH (H 2 O, 10 ㎖의 30 %)을 추가하고, 실온에서 1.5 시간 동안 교반하고, 진공하에 용매를 제거한다.
  7. 2 튜브에 H 2 O 및 분할의 2 ML을 추가합니다. 30 분 동안 아세톤 원심 분리 (1,000 XG)에서 차아 염소산 나트륨 4의 2 % 용액의 12 ML을 추가합니다. 이 절차를 한 번 더 반복한다. 침전물을 따라서 실질적으로 계속되는 RP-HPLC 정제를 단순화 (침전 것) 트리 포스페이트로부터 합성에 사용되는 용매 및 시약의 분리를 허용한다.
  8. 유성 잔류 공기 건조 후, (표준 절차에 따라 재료 및 그림 3의 또한 목록 참조) 원유의 31 P-NMR 스펙트럼을 기록하고4 ML의 H 2 O에 용해
    주 :이 합성 절차는 주로 개질 옥시 뉴 클레오 시드 트리 포스페이트의 생성에 초점을 맞추고 있지만, 매우 유사한 절차 (단순히, 3'-비스-O-아세틸 화 된 전구체 '2를 사용하여) 자신의 RNA 대조를 위해 적용될 수있다.

2. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 H​​PLC 정화

  1. 트리 에틸 암모늄 바이 카보네이트 (TEAB)의 1 M 스톡 용액의 제조 : 40
    1. 증류시키고 여과 H 2 O.의 ≈ 600 ㎖에 트리 에틸 아민 1 몰 (139 ㎖)의 용액을 준비
    2. 거품 이산화탄소 (드라이 아이스와 가스 버블을 통해) 격렬하게 교반하면서 용액에 7.6의 pH가 (이 적어도 10 시간이 소요됩니다)에 도달 할 때까지. 이 원액은 최대 1 달 동안 냉장고에 저장 될 수있다.
  2. 정화 :
    1. 초순수에 50 mM의 TEAB 2 L (용출액 A) : 1 M 주식에서 두 개의 버퍼 용액을 준비차 50 %의 MeCN (용출액 B)에서 50 mM의 TEAB 1 L. 두 용리액 진공하에 20 분 동안 교반 드가이 (세심한주의가 탈기 중에 CO 2를 제거하여 pH를 변경하지 않도록 요구된다.)
    2. 300 ㎕의 증류수 H 2 O의 원유 인산의 10 μl를 용해하여 분석 샘플을 준비하고 반 예비 RP 컬럼 (C18)을 탑재까지 그라데이션을 사용하여 HPLC 시스템에 주입 40 분의 0 ~ 100 % B에서 (그림 4). 인산의 R 티셔츠 (일반적으로 크로마토 그램의 주 피크 인)와 (약간 낮은 R 티셔츠가) 인산에 따라 HPLC 프로그램을 조정합니다. 이러한 조건과 약간의 인산을 포함 할 수 있습니다 초기 분수를 제거를 사용하여 조 혼합물을 정제.
    3. 생성물을 포함하는 모든 분획을 합하고 동결 건조 (원하지 diphosph로 가수 분해를 최소화하기 위해, 회전 증발기에서 증발되는 것이 바람직) 먹었다. (용리액에서 남은 트리 에틸 아민을 제거하기 위해) 초순수 여러 번 공 증발. NMR에 의한 인산의 순도 표준 프로토콜의 응용 프로그램 (1 H와 31 P의 NMR 모두) 및 MALDI-TOF (그림 5 참조) 평가합니다. 이 프로토콜의 애플리케이션에 의해 얻어지는 전형적인 수율은 일반적으로 기판에 따라 30-70 %의 범위에 놓여.

3. 뇌관 확장 반응과 TDT 중합

  1. 프라이머의 5'-말단 라벨링
    1. 프라이머 30 pmol의 혼합 (예 : P1, 재료 목록) 배 폴리 뉴클레오티드 키나제 (PNK) 버퍼, γ-[32 P] ATP, PNK 1 μL, 그리고 DDH 2 O 3 μL (용의 4 μL와 40 μl의 총 반응 부피). 30 분 동안 37 ° C에서 반응 혼합물을 품어 후 키나제 (70 ° C에서 10 분) 열 비활성화합니다.
    2. 라벨 반응 준비 중실란 화 된 유리 섬유와 1 ㎖ 피펫 팁을 연결하고 G10 솔루션 (DDH 2 O 10 %, 멸균)과 팁을 작성하여 G10 세파 덱스 컬럼. 스핀 다운 및 500 μL의 DDH 2 O 50 μL의 DDH 2 O. 한 최종 세척로 3 회 세척 (무료 방사성 라벨을 제거하기 위해) G10을 통해 반응 혼합물을 실행합니다.
    3. 젤 (PAGE 20 %) 방사성 동위 원소 표지 된 프라이머를 정화하고 호감을 적용하여 복구 (15)에 대해 72 ° C에서 1 % LiClO 4, 1 mm 순중량 3 (산도 8)을 함유하는 수용액 500 μL와 방법 (즉, 용출을 흡수 분). 에탄올 침전 및 G10은 용출 올리고 뉴클레오티드를 탈염.
  2. 프라이머 신장 반응
    1. 단련 한 방사성 동위 원소 표지 된 프라이머 P1의 pmol의 10 pmol의 프라이머 P1, 10 (사용되는 효소의 공급 업체에서 제공) 10 배 반응 버퍼에서 템플릿 T1 (자료 목록)의 pmol의 t을 배치하여우베 뜨거운 (90 ~ 95 ° C) 물에 서서히 (45 분 이상) 실온까지 냉각 할 수 있도록하여.
    2. 얼음에 튜브를 넣고 (다시)의 dNTP 칵테일 추가 (수정과를 모두 포함을 자연 트리 포스페이트, 100 μM 최종 농도)와 DNA 중합 효소의 1 U (엑소 (환기 - 클레 나우, PWO 또는 11 ° N) m)와 20 μL의 총 반응 부피를위한 물 ()를 완료하십시오. (-)를 사용하고 공기 빼기 (엑소 30 분 동안 예를 들어, 60 ° C) 효소의 최적의 작동 온도에서 배양한다.
    3. 스톱 솔루션 (포름 아미드 (70 %), 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA, 50 mM의), 브로 모 페놀 블루 (0.1 %), 자일 렌 cyanol (0.1 %))의 20 μl를 추가, 샘플 (95 ° C, 5 분) 가열, 냉각 아래로 (0 ° C), 및 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기를 변성하여 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화.
  3. TDT 중합
    1. 단일 가닥의 7 pmol의 희석레이블이 지정되지 않은 프라이머 P2 (자료 목록), 1 μL의 TDT 버퍼 10 배의 방사성 동위 원소 프라이머 1 pmol의.
    2. 얼음에 튜브를 넣고 (다시) (10 및 200 μM 사이를 포함 적절한 농도)의 dNTP 칵테일 및 TDT 중합 효소 (4 U)를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다. 정지 용액 10 μl를 추가, 샘플 (95 ° C, 5 분) 열 (0 ° C)를 냉각, 및 (PAGE 15 %) 폴리 아크릴 아마이드 겔 전기를 변성하여 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화.

4. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트와 PCR

  1. 모두 앞으로의 8 pmol의 혼합 및 증폭되는 템플릿의 0.5 pmol의와 역방향 프라이머. 10X 반응 버퍼 (200 μM 최종 농도)의 dNTP 칵테일을 추가하고 얼음에 튜브를 넣어. 20 μL의 최종 볼륨에 도달 한 DNA 중합 효소의 U와 H 2 O를 갖춘 추가. PCR 유리 병에 혼합물을 전송하고 30 PCR주기를 실시하고 있습니다.
  2. 배 크로스로드 버퍼의 10 μL와 10 μl를 희석하고 전기 영동 (에티 디움 브로마이드로 염색) 아가로 오스로 2 %를 해결할 수 있습니다. phosphorimager으로 시각화.

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결과

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그들은 핵산 (41)에 작용기의 광대 한 배열의 손쉬운 도입을 허용 이후 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 합성 목표를 매혹됩니다. 그러나, 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 분리 및 특성 규명은 종종 힘든 것으로 밝혀진다. 따라서, 여기에 기술 된 결과를 상기 합성, 생화학 적 절차 (그림 1B) 내에서 여러 단계를 수행하기 위해 도움의 손길을 제공 할 것으로 생각된다.

특히,도 3은 인 센터의 특성상 신호 (즉, 관찰 될 수있는 변성의 dNTP 전형적인 조 (31) P-NMR 스펙트럼 (특히이 경우 하위 사용자 BPU TP (4) (18),도 2)을 나타낸다 -5.02 (P의 γ)에 이중 어, -10.44 (P의 α)에서 이중선 및 -20.55 ...

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토론

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핵산에 수정이 포함되어 있다고 안티센스 및 antigene 에이전트의 개발 42, 43, 라벨 및 올리고 뉴클레오티드 (41)의 기능 태그 등 다양한 실제 응용 프로그램에 대한 관심, 그리고 유전 알파벳 44-46을 확장하기 위해 노력합니다. 화학 변경 및 작용기는 일반적으로 표준 자동화 고체 상 합성 프로토콜을 적용하여 핵산에 도입된다. 그러나, 포스 빌딩 블록은 다시 화학적 기능 (47)의 특성에 심각한 제한을 부과하는이 방법에 의해 부과 오히려 가혹한 조건에 반발 할 필요가있다. 유일한 제한은 그들이 중합 효소 1,2 기질 역할을하는 것이 있기 때문에 대신 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 효소 - 매개 중합, 기능의 넓은 범위를 도입 할 수 있습니다. 세대의 눈에 부족하다하더라도erally 적용 방법론, 신뢰성과 강력한 합성 및 분석 방법이 수정의 dNTPs의 합성을 위해 개발되었습니다. 또한, 때문에 자신의 고...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 N PZ00P2_126430 / 1 ° 및 PZ00P2_144595)에 의해 지원되었다. 교수 C. Leumann 대해 감사의 실험실 공간 및 장비를 제공뿐만 아니라, 자신의 지속적인 지원에 대해 인정 받고 있습니다. 양 고소 KNECHT는 유익한 토론을위한 인정 받고 있습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
트리부틸암모늄 피로인산염 Sigma AldrichP8533흡습성 고체, Ar
2-Chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one 아래에 보관 Sigma Aldrich324124수분 민감성
피리딘Sigma Aldrich82704분자체
DioxaneSigma Aldrich296309분자체
Dimethylformamide (DMF)Sigma Aldrich40248분자체
Acetonitrile Fisher ScientificHPLC 등급
트리에틸아민시그마 알드리치90342
트리부틸아민시그마 알드리치90781
ddH2OMilli-Q탈이온화 및 정제수, 디에틸피로카보네이트(DEPC
)디에틸피로카보네이트(DEPC)시그마 알드리치159220
D2O케임브리지 동위원소 연구소, Inc.DLM-4-25
γ-[32P]-ATPHartmann AnalyticsFP-301
Natural dNTPPromegaU1420
Vent (exo-) DNA 중합NEBM0257S
DNA 중합효소 I, 대형(Klenow) 단편NEBMO210S
9° Nm DNA 중합효소NEBMO260S
말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(TdT)PromegaM828A
Pwo DNA 중합효소Peqlab01 01 5010
T4 PNKThermo ScientificEK0032
아크릴아미드/비스아크릴아미드(19:1, 40%)Serva10679.01
아가로스아폴로 사이언티픽BIA1177
G10 Sephadex시그마G10120
우레아아폴로 사이언티픽BIU4110
목성 반분취 RP-HPLC 컬럼 (5μ C18 300 Å)Phenomenex
Gene Q Thermal CyclerBioconceptBYQ6042E
PCR 바이알Bioconcept3220-00
HPLC 시스템Amersham Pharmacia BiotechÄ kta basic 10/100
모든 올리고뉴클레오티드는 Microsynth에서 구입하여 PAGE
5'-CAAGGACAAAATAC
로 정제했습니다. CTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATCATGAGAGA
CATCGCCTCTGGGCTA
ATAGGACTACTTCTAAT
CTGTAAGAGCAGATCC
CTGGACAGGCAAGGAA
TACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
실험 절차 및 장비에 대한 자세한 내용은 다음 문서에서 확인할 수 있습니다.
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320-13330
Org. 바이오몰. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F
효소

참고문헌

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