방법 논문

생체 가교 접근 초파리 태아

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DOI:

10.3791/51387

⸱

2014년 4월 23일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Murray State University

이 논문에서

요약

다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.

초록

많은 세포 과정은 multisubunit 단백질 복합체에 의해 제어된다. 자주하는이 단지는 일시적으로 형성하고 조립하는 네이티브 환경을 필요로합니다. 따라서, 이러한 기능성 단백질 복합체를 식별하기 위해서는 세포 용해 및 후속 정제 전의 생체들을 안정화시키는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 Drosophila의 배아에서 대형 선의의 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 용이하게 세포막을 통과 할 수 알데히드의 낮은 농도를 사용하여 생체 내 가교에 의해 배아 내부 복합체 배아 permeabilization과 안정화에 기초한다. 이어서, 관심의 단백질 복합체는 겔 정제하여 질량 분석계로 분석 immunopurified된다. 우리는 생식 개발을위한 필수적인 튜더 단백질 복합체의 정화를 사용하여이 방법을 보여줍니다. 작은 - 튜더 여러 튜더 도메인을 포함하는 큰 단백질이며,표적 단백질의 메틸화 아르기닌 또는 리신과 상호 작용 모듈. 이 방법은 다른 생물과 조직에서 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다.

서론

multisubunit 단백질 어셈블리 및 DNA 또는 RNA-단백질 복합체의 분리는 단백질 복합체, DNA-결합 규제 단백질이나 RNA 결합 단백질의 RNA의 대상으로 인식 게놈 유전자 좌를 식별하기 위해 수행된다. 다른 방법은 특정 RNA 결합 단백질 (CLIP-서열) 2와 관련된 전사 인자 또는 염색질 단백질 (칩 - 서열) 1 RNA의 대상으로 인식 DNA 사이트의 게놈 전체의 식별을 할 수 있습니다. RNA 유래의 cDNA 또는 DNA의 대상 라이브러리는 다음 깊이 순서가됩니다. 이러한 방법은 화학 물질 또는 UV-유도 공부 착체의 단백질 성분에 대한 항체로 면역 침전 (IP)이어서 복합체를 안정화하는 가교를 사용한다.

생물체의 개발 과정에서 많은 단백질 복합체가 일시적으로 형성한다. 따라서, 어플을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생체 내에서 이러한 복합체 조성물 및 기능을 분석하는 데있어 매우 중요elopment. 이 상호 작용하는 구성 요소와 체외에서 세포의 생화학 적 환경의 기본 농도를 재현하는 것은 사실상 불가능하기 때문에 이러한 생체 분석은 체외 방법이 뛰어난 것입니다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로 Drosophila의 배아에서 큰 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 생체 내 접근 방식을 보여줍니다. 이 방법에서, 살아있는 배아 단백질 복합체는 저 알데히드 농도 및 후속 또한 단백질 복합체가 행 착체 및 질량 분광 분석의 겔 정제하여 착물의 알려진 성분에 대한 항체와 IP에 의해 절연되어 가교 아르 알 수없는 복잡한 구성 요소를 식별합니다. 포름 알데히드는 세포막을 투과 할 수 있으며, 2.3-2.7 3의 가교 범위를 가지고 있기 때문에, 단백질 복합체는 생체 내에서 가교 결합 될 수 있고, 복잡한 구성 요소는 서로에 근접 할 가능성이있다. 이 문서에 우리의예를 들어 튜더 (TUD) 단백질 복합체의 분리를 사용하여이 방법을 설명합니다. TUD는 생식 개발 4-7 필수적인 생식 단백질이다. 이 단백질은 다른 폴리 펩타이드 8-10의 메틸화 아르기닌 또는 라이신과 상호 작용하는 것으로 알려져 11 TUD 도메인이 포함되어 있습니다.

이전에, 우리는 기능 TUD 5 HA-태그를 표현하기 때문에, 특정 항-HA 항체 가교 후 TUD 단지를 아래로 당겨하는 데 사용되는 형질 전환 초파리 라인을 생성했다.

단백질 - 단백질 가교뿐만 아니라, 포름 알데히드는 핵산 - 단백질 가교를 생성 할 수 및 칩 SEQ 실험에 사용된다. 또한, 초파리, 포름 알데히드 가교 생체 내에서 바사 RNA 헬리 케이즈 단백질 (11)의 RNA 대상의 식별을 허용했다.

이 문서에서 우리는 생체 가교 PUR하는 방법을 설명하는 동안Drosophila의 배아에서 단백질 복합체의 ification,이 방법은 다른 생물과 조직에 적용 할 수 있습니다.

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프로토콜

1. 큰 사과 주스 한천 플레이트를 준비

  1. 4 판을 만들려면, 1,000 ㎖의 플라스크에 375 ㎖의의 H 2 O, 12,375 g 플라이 한천 및 교반 막대를 추가합니다. 이 느슨하게 액체 제품에 대해 하나의 30 분 멸균 사이클에 덮인 플라스크의 뚜껑 믹스 A. 오토 클레이브 믹스입니다.
  2. 500 ㎖ 비커에 125 ㎖의 사과 주스, 12.5 g 테이블 설탕 및 교반 막대를 추가합니다. 믹스의 고압 증기 멸균이 완료 될 때까지 약 70 ° C의 교반 및 온도를 유지하면서 가열 된 플랫폼에서 혼합 B. 열 믹스 B입니다.
  3. 혼합이 완료되면 고압 증기 멸균, A. 부드럽게 결합 교반 유지 혼합하는 혼합 B를 전송하고 15 분 동안 냉각 할 수 있습니다. 를 통해 냉각 및 방부제를 첨가하기 전에 결과 한천 응고하지 마십시오.
  4. 에탄올 10 % (중량 / 부피) 메틸 4 - 히드 록시 솔루션을합니다. 이 방부제 역할을합니다. 위의 사과 주스 한천의 혼합물에 용액의 3.75 ML을 추가합니다. anothe 교반 유지5 분 R.
  5. 각 300cm 2 플라스틱이나 스티로폼 판에 방부제와 125 ㎖의 사과 주스 한천 혼합물을 부어. 이 실온으로 냉각 및 응고 보자. 붓는 동안 기포의 형성을 피할 것.
    참고 : 사과 주스 한천 플레이트 즉시 사용할 준비가 된 것입니다. 분명 랩으로 사용하지 않는 접시를 덮고 주까지 4 ℃에서 저장한다.

2. 초파리 배아의 수집 및 사전 가교 처리

  1. 배아가 수집 될에서 약 40,000 ~ 50,000 파리와 인구 케이지를 넣습니다.
  2. 두 접시 각 매체 (12) 표준 옥수수 가루-당밀 125 ㎖에 포함을 확인하고 각각의 접시에 건조 빵 효모의 약 4g을 뿌린다. 파리를 살찌하는 48 시간을위한 25 ° C의 배양기에서 인구 케이지에이 판을 놓습니다.
  3. 25 ° C.에 따뜻한 2 사과 주스 한천 플레이트 각 건조 빵 효모의 약 1g을 뿌려판. 0-1 시간 된 배아를 수집을 시작하는 인구 케이지의 2 판을 놓습니다.
  4. 1 시간 수집의 끝에서 접시를 꺼내. 컬렉션의 또 다른 라운드가 필요한 경우 2 개의 새 번호판으로 교체합니다.
  5. 플레이트를 커버하고 미세한 페인트 브러시로 부드럽게 배아를 재현 탁하기에 충분한 물을 추가합니다. 스테인리스 철망으로 만들어진이 층 체를 재현 탁 배아를 붓는다.
    참고 : 상단 층이 배아를 통해시키면서 큰 플라이 부분을 수집 매체의 기공 크기 (850 μm의) 메쉬 만든다. 바닥 층은 효모와 물을 통해시키면서 배아를 수집 미세 메시 (75 μM)로 만든다.
  6. 50 ML 튜브 및 미세 나일론 메쉬로 만든 컬렉션 바구니에 수집 된 배아를 전송하는 미세 페인트 브러시를 사용합니다. 물로 간단히 배아를 씻어 후 건조 종이 타월에 메쉬를 얼룩.
  7. 3 분 동안 부드러운 소용돌이와 50 %의 표백제에서 배아를 담근다. 철저한 린스LY 물에 남아있는 표백제를 제거합니다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
  8. (이것은 이상 30 초를 복용해서는 안된다) 15 초 동안 교반과 이소프로판올 또는 다중 배아 덩어리의 붕괴까지 dechorionated 배아를 담가. 완전히 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
  9. 재 부유를 유지하기 위해 배아에 헵탄을 스트리밍 할 수있는 피펫을 사용하는 동안 5 분 헵탄의 배아를 담근다. 건조 종이 타월에 메쉬를 더 럽히.
  10. 3 분 동안 0.1 % 트리톤 X-100 (PBST)를 포함하는 인산염 완충 생리 식염수, 산도 7.4 (PBS)의 스트림으로 배아를 씻어.
  11. 컬렉션 바구니를 분해하고 10 ㎖의 PBST를 포함하는 15 ML 튜브에 메쉬와 함께 배아를 전송합니다. 메시 떨어져 배아를 씻어 부드럽게 튜브를 반전.
  12. 튜브에서 메시를 제거합니다. 수직 위치에 튜브를 넣어 태아가 중력에 의해 튜브의 바닥에 가라 앉을 수 있습니다.
    참고 : 약 100-300배아 ㎕의 하나 케이지에서 1 시간 수집을 위해 예상된다.
  13. PBST를 제거하고 즉시 가교 수행을 계속합니다.

수집 된 배아의 3. 생체 가교

  1. 사용 직전에 PBST에서 0.2 %의 포름 알데히드를 준비합니다. 배아에 포름 알데히드 정착액의 10 mL를 넣고 10 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다. 하루의 끝에서 사용하지 않는 정착을 폐기하십시오.
  2. 가교 반응을 켄 칭하고
    1. 가교의 끝에서, 배아는 튜브의 바닥에 가라하자.
    2. 포름 알데히드 용액을 제거합니다. 즉시 가교 반응을 종결 PBST 0.25 M 글리신 10 ㎖를 추가합니다. 5 분 동안 회전 진탕 기에서 교반과 함께 25 ° C에서 알을 품다.
    3. 배아가 튜브의 바닥에 가라하자. 급냉 솔루션을 제거합니다. PBST 10 ㎖로 3 회 배아를 씻으십시오.
    4. 완전히 P에게 제거피펫을 사용하여 BST 세척 솔루션입니다. -80 ° C까지 사용에 보관 배아.

4. 단백질 샘플 준비 및 면역 침전

  1. 2 ml의 용해 완충액에 다운스 균질화기를 사용하여 500 μL 가교 배아 균질화 (0.5 M 우레아, 0.01 % SDS, 2 % 트리톤-X 100, PBS 2 ㎜ 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드 [PMSF] 및 프로테아제 억제제 칵테일).
    참고 : 별도로 명시하지 않는 한 RT에이 다음과 같은 단계를 수행합니다.
  2. 1.5 ㎖의 원심 분리기 튜브에 해물을 전송하고 부드럽게 철저한 용해를 보장하기 위해 15 분 동안 회전 플랫폼에 바위. 세포 파편 펠렛 5 분 16,000 XG에서 해물을 원심 분리기. 깨끗한 15 ML 튜브에 뜨는을 저장합니다.
  3. 항-HA 아가로 오스 비즈가 뜨는에 슬러리 40 μl를 추가하고 2.5 시간 동안 회전 플랫폼에 품어.
  4. 5 분 2,500 XG에서 원심 분리하여 구슬을 펠렛. 뜨는을 제거하지만 APPRO를 남겨튜브 ximately 250 μL. 나머지 상층 액에 구슬을 재현 탁하고 10 μm의 기공 필터를 1.5 ml의 스핀 열을 전송할 수 있습니다.
  5. 10 초 동안 12,000 XG에 스핀 열을 원심 분리를 통해 흐름을 폐기하십시오.
  6. 200 μL 세척 버퍼 (0.1 M 글리신, 1 M의 NaCl, 1 % IGEPAL CA-630, 0.1 % 트윈 20, PBS에있는)를 추가하여 구슬을 씻으십시오. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리 및 세척을 버린다. 세척이 더 번 반복합니다.
  7. 비즈 40 μL 용출 버퍼 (2 ㎎ / ㎖ PBS에서 HA-펩타이드)를 추가하고 교반과 5 분마다 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다. 10 초 동안 12,000 XG에서 열을 원심 분리기 및 용출액을 수집합니다.
  8. 항-HA 항체 (13)를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의한 복합의 용출을 확인합니다.

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결과

웨스턴 블롯 하였다 (도 1에 도시) 7 % 단계 겔 (도 2) - 가교 결합의 효과와 가교 TUD 단백질 착물의 정제는 성공적으로 3 %의 SDS-PAGE로 분석 하였다.

3 %를 사용하는 목적 - 7 % 스텝 겔 착물 잔존 미가 교 TUD 단백질 농도에서 가교 TUD 단백질 복합체의 효과적인 분리를 기반으로한다. 상기 우리 생체 가교 조건 하에서, TUD 단백질의 큰 비율은 미가 교 여전히 남아 있었다. 이 무료 TUD 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리 될 때까지 IP 동안 가교 복합체 copurify 것이다. 분명 유지하지 않고 7 % 국경 - 크기가 큰, TUD 단백질을으로 가교 있지만 (285 kDa의)은 3 %에 걸쳐 마이그레이션합니다. 큰 분자량 가교 TUD 단백질 복합체는 어려움이 일의 결과로, 젤 국경을 넘어 이주를해야합니다 반면전자 단지는 무료 TUD 단백질에서 분리, 따라서 &...

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토론

포름 알데히드는 일반적으로 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산 상호 작용을 식별하기위한 가교제로서 사용되고있다. 함께 하류 질량 분석 절차와 호환성과의 우수한 용해도 및 세포막 투과성은, 세포 내 가교 애플리케이션 3,15-17 알데히드 이상적인 후보 약제 만든다. 특히, 성공적 바사, 초파리 (11)에서 중요한 생식 세포 RNA 헬리 카제와 관련된 mRNA를 식별하는 데 사용되었다. 가까이에 존재하는 단 분자 표적 단백질의 상호 작용 파트너의 특이성을 강화하고, 적절한 조건 하에서 가교 결합 될 수 있음을 의미 시판 가교제들 - (2.7 2.3), 또, 포름 알데히드는 최단 스페이서 아암 중 하나가 여기 . 상술 된 이유로, 포름 알데히드는 우리 프로토콜 가교제로서 선택되었다. 그러나,이 U이 제외 안된다Drosophila의 배아에 대한 생체 내 응용 프로그램의 다른 가교제의 sefulness. 그러나, 우리는 더 명백 TUD는 디티 오...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

우리는이 연구와 기술적 도움 요르단 데이비스, 야니 린, 에릭 샤 들러와 Jimiao 청 감사합니다. 이 작품은 ALA에 MCB-1054962에게 부여는 NSF 경력에 의해 지원되었다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Drosophila 한천Lab Scientific (http://www.labscientific.com/)FLY-8020-1사과 주스 플레이트가 깨지기 쉬울 수 있으므로 물과 한천 혼합물을 장기간 고압멸균하지 마십시오
메틸 4-하이드록시벤조에이시그마 (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)H5501다른 이름: TEGOSEPT
개체군 케이지플라이스터프 ( http://www.flystuff.com/)59-104
파인 나일론 메쉬플라이스터프 (http://www.flystuff.com/)57-102수집 바구니를 만들 때 단단히 밀봉되도록 매 튜브 캡의 개구부보다 약간 큰 메쉬를 자르
Dounce 균질화 시그마 (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)D8938-1SET단백질 분해를 방지하기 위해 사용하기 전에 균질화기를 얼음에 식히고 차가운 용해 버퍼로 미리 헹굽
. 프로테아제 억제제 칵테일 Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa)4693132001PBS는 집중된 프로테아제 억제제 스톡 용액을 준비하는 데 사용될 수 있습니다
Anti-HA 아가로스 비즈MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8이 키트에는 HA-펩타이드와 스핀 컬럼도 포함되어
HA-펩타이드MBL International (http://www.mblintl.com/)561-8PBS로 2 mg/ml까지 준비하십시오.
스핀 컬럼MBL international (http://www.mblintl.com/)561-8스핀 컬럼은
이소프로판올Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)
트리톤 X-100피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/‎)BP151-500
헵탄피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/‎)H350-4
PBSInvitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html)AM9625사용하기 전에 nanopures로 10X에서 1X에 묽게
포름알데히드Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP531-500
글리신바이오라드 (www.bio-rad.com/‎)161-0724
SDS바이오라드 (www.bio-rad.com/‎)161-0301
우레아바이오라드 (www.bio-rad.com/‎)161-0730
페닐메탄설포닐 플루오라이드시그마(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)P7626-1G이소프로판올에 200mM 원액을 준비한 다음 용해 완충액에서 2mM의 작동 농도로 희석
IGEPAL CA-630Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html)I8896-50ML
Tween 20Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)BP337-100
15ml 튜브USA Scientific (http://www.usascientific.com/)1475-0511
BleachClorox brand동일한 부피의 나노 순수로 희석하여 50% 표백제
50ml 튜브만들기 BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp)352098
최상층 체Fisher Scientific (www.fishersci.com/‎)04-884-1AK
바닥층 체피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/‎)04-884-1BA
트 십시오 니다. 있습니다. 키트의 일부로 포함되어 있습니다.BP26324는 한다 합니다.

참고문헌

  1. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome research. 22, 1813-1831 (2012).
  2. Murigneux, V., Sauliere, J., Roest Crollius, H., Le Hir, H. Transcriptome-wide identification of RNA binding sites by CLIP-seq. Methods. , (2013).
  3. Sutherland, B. W., Toews, J., Kast, J. Utility of formaldehyde cross-linking and mass spectrometry in the study of protein-protein interactions. Journal of mass spectrometry : JMS. 43, 699-715 (2008).
  4. Creed, T. M., Loganathan, S. N., Varonin, D., Jackson, C. A., Arkov, A. L. Novel role of specific Tudor domains in Tudor-Aubergine protein complex assembly and distribution during Drosophila oogenesis. Biochemical and biophysical research communications. 402, 384-389 (2010).
  5. Arkov, A. L., Wang, J. Y., Ramos, A., Lehmann, R. The role of Tudor domains in germline development and polar granule architecture. Development. 133, 4053-4062 (2006).
  6. Boswell, R. E., Ptudor Mahowald, A. a gene required for assembly of the germ plasm in Drosophila melanogaster. Cell. 43, 97-104 (1985).
  7. Thomson, T., Lasko, P. Drosophila tudor is essential for polar granule assembly and pole cell specification, but not for posterior patterning. Genesis. 40, 164-170 (2004).
  8. Arkov, A. L., Ramos, A. Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology. 20, 482-490 (2010).
  9. Gao, M., Arkov, A. L. Next generation organelles: Structure and role of germ granules in the germline. Molecular reproduction and development. , (2012).
  10. Liu, H., et al. Structural basis for methylarginine-dependent recognition of Aubergine by Tudor. Genes & development. 24, 1876-1881 (2010).
  11. Liu, N., Han, H., Lasko, P. Vasa promotes Drosophila germline stem cell differentiation by activating mei-P26 translation by directly interacting with a (U)-rich motif in its 3. UTR. Genes & development. 23, 2742-2752 (2009).
  12. Matthews, K. A. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. Methods in Cell Biology. Goldstein, L. S. B., Fyrberg, E. A. 44, Academic Press. 13-32 (1995).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  14. Thomson, T., Liu, N., Arkov, A., Lehmann, R., Lasko, P. Isolation of new polar granule components in Drosophila reveals P body and ER associated proteins. Mechanisms of development. 125, 865-873 (2008).
  15. Vasilescu, J., Guo, X., Kast, J. Identification of protein-protein interactions using in vivo cross-linking and mass spectrometry. Proteomics. 4, 3845-3854 (2004).
  16. Klockenbusch, C., Kast, J. Optimization of formaldehyde cross-linking for protein interaction analysis of non-tagged integrin beta1. J Biomed Biotechnol. 2010, 9275-9285 (2010).
  17. Nowak, D. E., Tian, B., Brasier, A. R. Two-step cross-linking method for identification of NF-kappaB gene network by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 39, 715-725 (2005).
  18. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41, 694(2006).
  19. Liu, N., Dansereau, D. A., Lasko, P. Fat facets interacts with vasa in the Drosophila pole plasm and protects it from degradation. Current biology : CB. 13, 1905-1909 (2003).

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