다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.
다 성분 단백질 복합체가 세포 기능 및 개발 과정에서 중요한 역할을한다. 여기에서 우리는 생체 가교 후의 구조 기능 분석을위한 가교 착물 정제하여 이후 초파리 배아로부터 네이티브 단백질 복합체를 분리하는 데 사용되는 방법을 설명한다.
많은 세포 과정은 multisubunit 단백질 복합체에 의해 제어된다. 자주하는이 단지는 일시적으로 형성하고 조립하는 네이티브 환경을 필요로합니다. 따라서, 이러한 기능성 단백질 복합체를 식별하기 위해서는 세포 용해 및 후속 정제 전의 생체들을 안정화시키는 것이 중요하다. 여기에서 우리는 Drosophila의 배아에서 대형 선의의 단백질 복합체를 분리하는 데 사용하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 용이하게 세포막을 통과 할 수 알데히드의 낮은 농도를 사용하여 생체 내 가교에 의해 배아 내부 복합체 배아 permeabilization과 안정화에 기초한다. 이어서, 관심의 단백질 복합체는 겔 정제하여 질량 분석계로 분석 immunopurified된다. 우리는 생식 개발을위한 필수적인 튜더 단백질 복합체의 정화를 사용하여이 방법을 보여줍니다. 작은 - 튜더 여러 튜더 도메인을 포함하는 큰 단백질이며,표적 단백질의 메틸화 아르기닌 또는 리신과 상호 작용 모듈. 이 방법은 다른 생물과 조직에서 네이티브 단백질 복합체의 분리를 위해 적용 할 수 있습니다.
multisubunit 단백질 어셈블리 및 DNA 또는 RNA-단백질 복합체의 분리는 단백질 복합체, DNA-결합 규제 단백질이나 RNA 결합 단백질의 RNA의 대상으로 인식 게놈 유전자 좌를 식별하기 위해 수행된다. 다른 방법은 특정 RNA 결합 단백질 (CLIP-서열) 2와 관련된 전사 인자 또는 염색질 단백질 (칩 - 서열) 1 RNA의 대상으로 인식 DNA 사이트의 게놈 전체의 식별을 할 수 있습니다. RNA 유래의 cDNA 또는 DNA의 대상 라이브러리는 다음 깊이 순서가됩니다. 이러한 방법은 화학 물질 또는 UV-유도 공부 착체의 단백질 성분에 대한 항체로 면역 침전 (IP)이어서 복합체를 안정화하는 가교를 사용한다.
생물체의 개발 과정에서 많은 단백질 복합체가 일시적으로 형성한다. 따라서, 어플을 제어하는 분자 메커니즘을 이해하기 위해 생체 내에서 이러한 복합체 조성물 및 기능을 분석하는 데있어 매우 중요elopment. 이 상호 작용하는 구성 요소와 체외에서 세포의 생화학 적 환경의 기본 농도를 재현하는 것은 사실상 불가능하기 때문에 이러한 생체 분석은 체외 방법이 뛰어난 것입니다. 여기에서 우리는 우리가 성공적으로
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1. 큰 사과 주스 한천 플레이트를 준비
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웨스턴 블롯 하였다 (도 1에 도시) 7 % 단계 겔 (도 2) - 가교 결합의 효과와 가교 TUD 단백질 착물의 정제는 성공적으로 3 %의 SDS-PAGE로 분석 하였다.
3 %를 사용하는 목적 - 7 % 스텝 겔 착물 잔존 미가 교 TUD 단백질 농도에서 가교 TUD 단백질 복합체의 효과적인 분리를 기반으로한다. 상기 우리 생체 가교 조건 하에서, TUD 단백질의 큰 비율은 미가 교 여전히 남아 있었다. 이 무료 TUD 단백질은 SDS-PAGE에 의해 분리 될 때까지 IP 동안 가교 복합체 copurify 것이다. 분명 유지하지 않고 7 % 국경 - 크기가 큰, TUD 단백질을으로 가교 있지만 (285 kDa의)은 3 %에 걸쳐 마이그레이션합니다. 큰 분자량 가교 TUD 단백질 복합체는 어려움이 일의 결과로, 젤 국경을 넘어 이주를해야합니다 반면전자 단지는 무료 TUD 단백질에서 분리, 따라서 &.......
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포름 알데히드는 일반적으로 단백질 - 단백질 및 단백질 - 핵산 상호 작용을 식별하기위한 가교제로서 사용되고있다. 함께 하류 질량 분석 절차와 호환성과의 우수한 용해도 및 세포막 투과성은, 세포 내 가교 애플리케이션 3,15-17 알데히드 이상적인 후보 약제 만든다. 특히, 성공적 바사, 초파리 (11)에서 중요한 생식 세포 RNA 헬리 카제와 관련된 mRNA를 식별하는 데 사용되었다. 가까이에 존재하는 단 분자 표적 단백질의 상호 작용 파트너의 특이성을 강화하고, 적절한 조건 하에서 가교 결합 될 수 있음을 의미 시판 가교제들 - (2.7 2.3), 또, 포름 알데히드는 최단 스페이서 아암 중 하나가 여기 . 상술 된 이유로, 포름 알데히드는 우리 프로토콜 가교제로서 선택되었다. 그러나,이 U이 제외 안된다Drosophila의 배아에 대한 생체 내 응용 프로그램의 다른 가교제의 sefulness. 그러나, 우리는 더 명백 TUD는 디티 오.......
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저자가 공개하는 게 없다.
우리는이 연구와 기술적 도움 요르단 데이비스, 야니 린, 에릭 샤 들러와 Jimiao 청 감사합니다. 이 작품은 ALA에 MCB-1054962에게 부여는 NSF 경력에 의해 지원되었다
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Drosophila 한천 | Lab Scientific (http://www.labscientific.com/) | FLY-8020-1 | 사과 주스 플레이트가 깨지기 쉬울 수 있으므로 물과 한천 혼합물을 장기간 고압멸균하지 마십시오 |
| 메틸 4-하이드록시벤조에이 | 시그마 (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | H5501 | 다른 이름: TEGOSEPT |
| 개체군 케이지 | 플라이스터프 ( http://www.flystuff.com/) | 59-104 | |
| 파인 나일론 메쉬 | 플라이스터프 (http://www.flystuff.com/) | 57-102 | 수집 바구니를 만들 때 단단히 밀봉되도록 매 튜브 캡의 개구부보다 약간 큰 메쉬를 자르 |
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| . 프로테아제 억제제 칵테일 | Roche (http://www.rocheusa.com/portal/usa | )4693132001 | PBS는 집중된 프로테아제 억제제 스톡 용액을 준비하는 데 사용될 수 있습니다 |
| Anti-HA 아가로스 비즈 | MBL international (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | 이 키트에는 HA-펩타이드와 스핀 컬럼도 포함되어 |
| HA-펩타이드 | MBL International (http://www.mblintl.com/) | 561-8 | PBS로 2 mg/ml까지 준비하십시오. |
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| 이소프로판올 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | ||
| 트리톤 X-100 | 피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/) | BP151-500 | |
| 헵탄 | 피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/) | H350-4 | |
| PBS | Invitrogen (https://www.lifetechnologies.com/us/en/home.html) | AM9625 | 사용하기 전에 nanopures로 10X에서 1X에 묽게 |
| 포름알데히드 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP531-500 | |
| 글리신 | 바이오라드 (www.bio-rad.com/) | 161-0724 | |
| SDS | 바이오라드 (www.bio-rad.com/) | 161-0301 | |
| 우레아 | 바이오라드 (www.bio-rad.com/) | 161-0730 | |
| 페닐메탄설포닐 플루오라이드 | 시그마(http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | P7626-1G | 이소프로판올에 200mM 원액을 준비한 다음 용해 완충액에서 2mM의 작동 농도로 희석 |
| IGEPAL CA-630 | Sigma (http://www.sigmaaldrich.com/united-states.html) | I8896-50ML | |
| Tween 20 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | BP337-100 | |
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| 50ml 튜브 | 만들기 BD Biosciences (http://www.bdbiosciences.com/home.jsp) | 352098 | |
| 최상층 체 | Fisher Scientific (www.fishersci.com/) | 04-884-1AK | |
| 바닥층 체 | 피셔 사이언티픽 (www.fishersci.com/) | 04-884-1BA |
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