단일 셀의 정밀도와의 연결을 공동 문화의 준비

요약

하나의 신경 세포의 미세 유체의으로 배열 및 생체 적합 물질 코팅의 칩 플라즈마 패턴 물 마스킹을위한 프로토콜을 설명합니다. 고도로 상호 공동 배양은 최소 셀 입력을 사용하여 제조 될 수있다.

초록

Campenot 실의 미세 유체 실시 예는 신경 과학 사회에서 큰 관심을 받고있다. 이러한 상호 공동 문화 플랫폼은 감염 및 질병 전파에 발달 및 기능 신경 생물학에 걸쳐, 다양한 질문을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 그러나, 기존의 시스템은 중요한 세포와 같은 기본 도파민 흑색질, 나선 신경절 및 Drosophilia melanogaster의 뉴런의 낮은 풍부 세포 연구에 대한 불충분 한 입력 (구획 당 수천), 및 높은 처리량 실험에 대한 허무가 필요합니다. 조밀 한 문화는 매우 로컬 두 문화를 상호 몇의 outgrowths (<10 %)과 얽혀있다. (I) 미세 유체 하나의 신경 세포는 방법으로 배열하고, 플라즈마 패터닝 생체 재료의 코팅 REGI을위한 (II) 물 마스킹 방법 :이 논문에서는 간단 미세 패터닝 프로토콜은 이러한 문제를 해결하는 설명되어 있습니다신경을 STER과 구획 사이의 파생물을 촉진합니다. 최소한의 신경 세포 공동 배양은 높은 수준 (> 85 %) intercompartment 연결로 제조 된 단일 셀 정밀도 높은 처리량 신경 생물학 실험에 사용될 수있다.

서론

신경 조직은 매우 복잡합니다; 공간적 세포 연락처 및 특히 축삭과 수상 돌기의 outgrowths를 통해 통해 정의 층과 구획 내에서 플라스틱 연결과 함께 주문 이종 세포 혼합물. 새로운 기술은 깊은 통찰력과 질병, 개발, 건강 기능 중심 해명 메커니즘을 얻기 위해 더 많은 실험적인 자유를 부여해야합니다. Campenot 챔버 ^1,2 그리고 더 최근의 마이크로 제조 실시 예 ^3,4는 선택적으로 다른 체세포 인구 느려지고 또한 신경 돌기의 outgrowths하는 기능과 네트워크의 연결 공동 배양의 생체 외 제조에 사용될 수있다. 이러한 마이크로 유체 장치는 예를 들어 화학 ^5,6 또는 레이저 axotomy ^6-8, 타우 병증 ^9, 바이러스 전파 ^{10, 11,} 및 축삭 ⁴ mRNA의 현지화 다음 축삭의 변성과 재생을 연구하는 데 사용되었습니다.

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신경 생물학의 범위를 확장하기 위해, 기술 개발은 최소한의 신경 세포의 공동 문화를 준비해야합니다. 이것은 하나의 세포 및 서브 셀룰러 정밀 시스템의 조사를 위해 신경 네트워크의 풀림을 할 수 있습니다. 최소한의 세포 수에....

프로토콜

프로토콜은 신경 과학자를 대상으로하고, 그림 2에 요약되어있다. 따라서 그것은 상업적 또는 기관 시설에 아웃소싱 PDMS 복제에 사용 된 SU-8 마스터의 미세을 추천합니다. 두 레이어 마스크 디자인은 화학 웹 사이트 ^(12)의 왕립 학회에 부가 정보 (ZIP)로 자유롭게 사용할 수 있습니다. 중요한 사실은, 제 SU-8 층은 2.5-3.0 ㎛의 깊이로 제조하고, 25 ~ 30 ㎛의 깊이까지 제되어야한다. 이러한 효과가 신경으로 배열에 필요한 주요 치수입니다. 3 미크론의 높이 제한은 신경 세포가 두 개의 구획 ⁽¹²⁾ 사이에 운반 또는 마이그레이션되지 않도록하는 것이 필요하다.

PDMS 1. 미세 유체 장치 복제

1. 10:1 비율로 경화제 (184)로 철저히 PDMS의 예비 중합체를 혼합하고 통상적으로 20 분 동안 진공 데시 케이 혼합물을 탈기. 대안 적으로, 혼합 두어50 ML 팔콘 튜브의 낮은 g을 사용 진짜야 탈 가스 원심 분리.
2. 80 ° C의 열판에 2 층 미세 구조화 SU-8 웨이퍼를 놓고 웨이퍼의 각 장치에 폴리머 프레임을 맞 춥니 다. ≥ 5mm의 깊이까지의 범위에 PDMS를 부어> 1 시간 열 경화가....

결과

물 마스킹 공격은 표면 장력. 공기 - 액체 계면에서의 압력 공차는 곡률 [반경 반비례 비늘 , 미세 유체 차원에서 매우 안정적인 인터페이스를 생성. micropillars 효과적으로 대신 물 마스크 앵커. 워터 마스크 형성은 가열에 의해 증가 된 속도로, 마이크로 유체 포트에서 증발에 의해 구동된다. 낮은 배율 (4X - 10X)에서 열을 사용하여 현미경 조명, 물 마스크는 일반적으로 ≤ 5 분에 설립되었다. 증발은 또한 물 마스크의 최종적인 붕괴에 이르게한다. ~ (플라즈마 박아 실용적인) 15 분은, 18 NL 저장 구조는 문화 구획의 상류에 위치 된 것으로 물 마스크의 수명을 증가시킵니다. 물 마스크 형성과 붕괴의 비율은 다를 수 있고, 간헐적으로 관찰 플라즈마 t에 적합한 기간을 확인하는 것이 좋습니다reatment. 그럼에도 불구하고, 여러 장치를 동시에 제조 할 수.......

토론

미세 유체으로 ​​배열 기술은 최소한의 문화 구축을위한 정밀 단일 신경 세포의 처리를 가능하게 최초의 것입니다. 미세 구조와 세포의 패턴을 정렬하는 현장 생체 적합 물질 패터닝 방법에있어서, 강력한 접근 방식과 함께, 이러한 최소한의 문화가 감소 된 지역의 얽힘 높은 intercompartment 연결 수준이. 심플한 디자인 수정이 시각화 및 정량 분석​​을위한 개별 축삭을 분리 잠재력이 이러한 기능은 간 구획 전송의 효율적인 학습을 위해 사용될 수있다. 예를 들어, 다음 세대에서 삼지창 구조체가 다발을 형성하는 복수 축삭의 확률을 줄이기 위해 신경 세포 당 하나의 가지 채널로 대체 될 수있는 디자인. 이러한 기능은 크게 신경 과학 등의 응용 프로그램의 다양한 혜택을 누릴 수 있습니다; 나노 입자의 독성 ^(24)과 망간 전파 ^25, 활동 SYN간질 chronization 같은 프리온 ^(26), 알츠하이머 병 ⁹ 아밀로.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PDMS Sylgard 184	다우 코닝
PDMS Elastosil RT 601	Wacker
Coverslips	VWR	630-1590	130-160 mm 두께
3mm 생검 펀치	Kai Medical		Handle with care - 매우 날카로운
Tygon 튜빙	Fisher Scientific	S-50-HL	1.65 mm ID; 3.35 mm OD
1 ml 주사기 ( Inkjekt 및 Omnifix)	Braun	6064204
4-Way 튜빙 커넥터	VWR 또는 Fisher Scientific
Flow regulator	Harvard Apparatus	722645
0.5 mm 핀	양재부
PLL-g-PEG	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	저장의 안정성이 문제가 될 수 있습니다
poly-D-lysine	Sigma-Aldrich	P6407
폴리리신-FITC	시그마-알드리치	P3069
폴리오르니틴	시그마-알드리치	P4957
피브로넥틴	시그마-알드리치	F2006
라미닌	시그마-알드리치	L2020
PBS	시그마-알드리치	P4417
도립 형광 현미경
흡인 펌프의 예	KNF Neuberger, Laboport	N811KVP
휴대용 코로나 방전 장치	Leybold-Heraeus, USA	VP23	해당 국가의 안전 표준을 준수하지 않을 수 있습니다.
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