세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 내 pH는 엄격하게 조절되며 세포질과 세포 기관 간의 pH 차이가 보고되었습니다1. 세포 pH의 조절은 단백질, DNA 및 RNA 합성, 소포 이동, 세포 성장 및 세포 분열을 포함하는 생리학적 과정의 항상성 제어에 중요합니다. 세포의 pH 항상성의 변화는 해로운 기능적 변화를 일으키고 다양한 질병의 진행을 촉진할 수 있다2. 세포 내 pH를 측정하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있지만 세포질과 세포 기관에서 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 컨포칼 현미경을 사용하여 세포질과 소기관 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법에 대해 자세히 설명합니다3. 이 목표는 선택적 세포 구획 분할을 갖는 두 가지 pH 감지 비율계량 염료를 사용하여 달성됩니다. 예를 들어, SNARF-1은 세포질 내부에 구획화되어 있는 반면 HPTS는 엔도솜/리소좀 소기관 내부에 구획화되어 있습니다. HPTS는 일반적으로 세포질 pH 지시약으로 사용되지만, 이 염료는 pinocytosis3,4에 의해 흡수된 후 엔도솜-리소좀 경로를 따라 소포를 특이적으로 표지할 수 있습니다. 이러한 pH 감지 프로브를 사용하면 내포성 및 세포질 구획 내에서 pH를 동시에 측정할 수 있습니다. HPTS의 최적 여기 파장은 pH에 따라 달라지며 SNARF-1의 경우 최적 방출 파장이 달라집니다. SNARF-1 및 HPTS를 사용한 로딩 후, 세포는 서로 다른 pH 보정 용액에서 배양되어 각 프로브에 대한 pH 표준 곡선을 구성합니다. 컨포칼 현미경 검사에 의한 세포 이미징을 통해 아티팩트와 배경 소음을 제거할 수 있습니다. HPTS의 스펙트럼 특성으로 인해 이 프로브는 약산성 엔도솜 구획을 측정하거나 엔도솜/리소좀 소기관의 알칼리화를 입증하는 데 더 적합합니다. 이 방법은 데이터 분석을 단순화하고 pH 측정의 정확도를 개선하며 외부 문제에 대한 세포 반응 중 pH 조절과 관련된 근본적인 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.
프로토콜
셀룰러 산도 교정을위한 해결책 1. 준비
- 교정에 사용되는 5 용액을 제조 5 개의 분리 50 ㎖ 원추형 튜브에 이하의 화합물을 추가
- 염화나트륨 (1 M NaCl을 1 ㎖) (1 M NaCl을 10 ㎖의 H 2 0 = 0.58 g)
- 의 KCl은 (7,425 1 M의 KCl ㎖) (1 M의 KCl은 10 ㎖의 H 2 0에서 825 g을 =)
- 포도당 (1 M D-글루코스의 1 ㎖) (1M D-글루코스 = 10 밀리리터 H 1.80 g이 0)
- MgS0 4 (0.05 1 M 망초의 ML) (1 M 망초 10 ㎖의 H 2 0 4 = 1.20 g)
- 20 mM의 HEPES (1M HEPES 1 ㎖) (10 ㎖의 H 2 0 1 M HEPES는 = 2.38 g)
- 염화칼슘 (1M 염화칼슘 0.05 ㎖) (10 ㎖의 H 1 M 염화칼슘 = 1.47 G 2 0)
두 번 증류 된 H 2 O (DD....
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결과
세포 내 엔도 좀 / 리소좀 세포 구획 모두에서의 pH의 동시 측정을 위해, 비율 계량 형광 pH를 감지 SNARF-1 프로브 및 HPTS를 사용 하였다. HPTS가 엔도 솜 / 리소좀 구획의 비율 계량 산도를 측정 할 수있는 반면 SNARF-1은 세포 내 구획으로 제한됩니다. 16 시간 동안 HPTS있는 셀로드는 엔도 좀 / 리소좀 4의 선택적 지역화 할 수 있습니다. pH를 감지 프로브와 함께로드 HT-1080 세포에서 기록 된 형광의 전형적인 예는 그림 2A에 표시됩니다. HPTS는 엔도 좀과 리소좀 두 구획 레이블 증거는 알렉사 546 - 복합 트랜스페린 (엔도 솜) 또는 형광 lysotrophic 프로브 (Lysotracker 깊은 Reddye)와 공동 염색을 얻었다. 데이터는 명확하게 HPTS 두 구획 그림 2A 스테인드 것으로 나타났다.
상술 된 방법을 사용하여 살아있는 세포에서의 세.......
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토론
다른 세포 구획의 라이브 세포 이미징 양적 pH 측정은 정확하게 외부의 도전에 대한 세포 반응에서의 pH의 변화를 측정하기 위해 필요합니다. 그러나 남아있는 주요 장애물 중 하나는 쉽게 구체적으로 세포 구획을 대상으로하는 것입니다. 이 점에서, 몇 가지 연구는 일렉트로 또는 마이크로 인젝션 8-10 의해 세포 내로 도입 세포 내 pH를 지표로 HPTS의 사용을 강조했다. 이 기술은 즉 일렉트로 세포에 광범위한 피해를 발생시키고 미세 주입은 특수 장비 및 기술 능력을 필요로 심각한 결점으로 고통. 그 중에서, 힌튼 외. 이전 HPTS가 세포 작용의 과정에 의해 세포에 의해 다루어 SNARF-1 및 HPTS의 조합 / 리소좀 구획 3 세포질과 엔도 솜의 pH를 모니터링하는데 사용될 수 있다는 될 수 있다고보고했다 . 우리는 리소좀 / 엔도 좀 compartm에서의 pH 변화를 기록하기 위해이 속성을 사용했습니다라이브 HT-1080 세포의 이비인후과. HPTS이 구획에 위치했다.......
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공개 사항
이해 상충이 선언되지 않았습니다.
감사의 글
원고를 비판적으로 읽어주신 Gilles Dupuis 박사님께 감사드립니다.
자금 조달
이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)의 지원을 받았으며 보조금 # MOP-126173을 받았습니다. C.M.D는 FRSQ(Fonds de la Recherche en Santé)의 자금 지원을 받는 Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel의 회원입니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 교정 | |||
| : 염화나트륨 | Fischer | L-11621 | |
| 염화칼륨 | Fischer | M-12445 | |
| D-포도당(덱스트로오스) | Fischer | D16-1 | |
| 황산마그네슘 | Fischer | M65-500 | |
| HEPES, | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Calcium chloride dihydrate | Fischer | M-1612 | |
| 탈이온수 | N/A | /A | |
| Nigericin | Calbiochem | 481990 | 흡입 또는 피부 접촉에 의해 독성 |
| 4°C에서 빛으로부터 보호하십시오. C | |||
| 배양 접시 & 35mm | BD Biosciences | 354456 | |
| pH 감지 프로브 | |||
| 8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS) | Life technologies | H-348 | 실온에서 빛을 멀리하십시오 |
| 5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, Acetate | Life technologies | C-1271 | -20 °에서 빛과 습도로부터 멀리 유지하십시오. C |
| 디메틸 수폭사이드(DMSO) | 피셔 | BP231-1 | 해로운 |
| 인산염 완충 식염수(PBS) 100X | |||
| 염화칼 | Fischer | M-12445 | 20g |
| 인산나트륨 일염기 | Fischer | S369-1 | 115g |
| 인산칼륨 일염기 | J.T Baker | 3246-01 | 20g |
| 탈이온수 | N/A | N/A | 1L |
| 오토클레이브를 만들고 pH를 7.4 | 로 조정합니다. | ||
| 인산염 완충 식염수(PBS) 1X | |||
| PBS 100X | N/A | N/A | 50ml |
| 염화나트륨 | Fischer | L-11621 | 40.5g |
| 탈이온수 | N/A | 5L | |
| pH 조절제 | |||
| Bafilomycin A1 | Sigma-Aldrich | B-1793 | |
| 5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드(EIPA) | 시그마-알드리치 | A3085 | |
| 염화암모늄 피 | 셔 | A649-500 |
참고문헌
- Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
- Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
- Hinton, A., et al.
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재인쇄 및 허가
