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방법 논문

공 초점 현미경을 사용하여 살아있는 세포에서 세포 내 이입과 세포질 구획 동시 pH 측정

14.9K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51395

⸱

2014년 4월 28일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Health Sciences, Université de Sherbrooke, 2Biophotonics Core Facility, Centre de Recherche Clinique Etienne-Le Bel

이 논문에서

요약

세포 내 pH를 측정하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있지만 이 중 세포질 및 소기관 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포의 비율계량 이미징을 통해 세포질과 소포 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법론에 대해 자세히 설명합니다.

초록

세포 내 pH는 엄격하게 조절되며 세포질과 세포 기관 간의 pH 차이가 보고되었습니다1. 세포 pH의 조절은 단백질, DNA 및 RNA 합성, 소포 이동, 세포 성장 및 세포 분열을 포함하는 생리학적 과정의 항상성 제어에 중요합니다. 세포의 pH 항상성의 변화는 해로운 기능적 변화를 일으키고 다양한 질병의 진행을 촉진할 수 있다2. 세포 내 pH를 측정하기 위해 다양한 방법을 사용할 수 있지만 세포질과 세포 기관에서 pH를 동시에 측정할 수 있는 방법은 거의 없습니다. 여기에서는 살아있는 세포에 대한 컨포칼 현미경을 사용하여 세포질과 소기관 pH를 동시에 측정하는 빠르고 정확한 방법에 대해 자세히 설명합니다3. 이 목표는 선택적 세포 구획 분할을 갖는 두 가지 pH 감지 비율계량 염료를 사용하여 달성됩니다. 예를 들어, SNARF-1은 세포질 내부에 구획화되어 있는 반면 HPTS는 엔도솜/리소좀 소기관 내부에 구획화되어 있습니다. HPTS는 일반적으로 세포질 pH 지시약으로 사용되지만, 이 염료는 pinocytosis3,4에 의해 흡수된 후 엔도솜-리소좀 경로를 따라 소포를 특이적으로 표지할 수 있습니다. 이러한 pH 감지 프로브를 사용하면 내포성 및 세포질 구획 내에서 pH를 동시에 측정할 수 있습니다. HPTS의 최적 여기 파장은 pH에 따라 달라지며 SNARF-1의 경우 최적 방출 파장이 달라집니다. SNARF-1 및 HPTS를 사용한 로딩 후, 세포는 서로 다른 pH 보정 용액에서 배양되어 각 프로브에 대한 pH 표준 곡선을 구성합니다. 컨포칼 현미경 검사에 의한 세포 이미징을 통해 아티팩트와 배경 소음을 제거할 수 있습니다. HPTS의 스펙트럼 특성으로 인해 이 프로브는 약산성 엔도솜 구획을 측정하거나 엔도솜/리소좀 소기관의 알칼리화를 입증하는 데 더 적합합니다. 이 방법은 데이터 분석을 단순화하고 pH 측정의 정확도를 개선하며 외부 문제에 대한 세포 반응 중 pH 조절과 관련된 근본적인 질문을 해결하는 데 사용할 수 있습니다.

프로토콜

셀룰러 산도 교정을위한 해결책 1. 준비

  1. 교정에 사용되는 5 용액을 제조 5 개의 분리 50 ㎖ 원추형 튜브에 이하의 화합물을 추가
    • 염화나트륨 (1 M NaCl을 1 ㎖) (1 M NaCl을 10 ㎖의 H 2 0 = 0.58 g)
    • 의 KCl은 (7,425 1 M의 KCl ㎖) (1 M의 KCl은 10 ㎖의 H 2 0에서 825 g을 =)
    • 포도당 (1 M D-글루코스의 1 ㎖) (1M D-글루코스 = 10 밀리리터 H 1.80 g이 0)
    • MgS0 4 (0.05 1 M 망초의 ML) (1 M 망초 10 ㎖의 H 2 0 4 = 1.20 g)
    • 20 mM의 HEPES (1M HEPES 1 ㎖) (10 ㎖의 H 2 0 1 M HEPES는 = 2.38 g)
    • 염화칼슘 (1M 염화칼슘 0.05 ㎖) (10 ㎖의 H 1 M 염화칼슘 = 1.47 G 2 0)
      두 번 증류 된 H 2 O (DDH 2 O)의 모든 솔루션을 준비합니다.
  2. DDH 2 O 35 ㎖로 각각의 솔루션을 완료하고 그렇게 할 때까지 자석 교반기로 혼합lution가 달성된다.
  3. 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5의 pH 값을 얻기 위해 1 N KOH 또는 1 N HCl로 각 용액의 pH를 조정합니다. 이어서, 50 ㎖의 최종 부피의 탈 이온수를 사용하여 볼륨을 조절한다.
  4. 측정 5 nigericin의 MG 및 원액 nigericin 10 밀리미터를 준비하는 무수 EtOH 670 μL에 추가합니다.
    주의 : nigericin이 높은 독성과 큰 관심 (장갑, 보호 안경 및 마스크)로 처리해야합니다. nigericin가 완전히 용해 될 때까지 반전하여 솔루션을 섞는다.
  5. 각각의 보정 용액에 10 mM의 nigericin (최종 농도 10 μM)의 0.05 ML을 추가합니다. Nigericin은 세포막 투과성을 증가시키고, 세포의 K + 탈분극 농도의 존재 하에서 세포 내 및 세포 외 pH를 평형화 원인 이온 운반체이다.
  6. 교정 솔루션은 4 ° C에서 1개월까지 저장할 수 있습니다

2. 휴대 준비

  1. 생물학적 보안 시스템에서35mm의 Y 후드, 씨 세포 X 10mm 배양 접시 10 % 소 태아 혈청과 항생제가 보충 된 성장 배지 2 ㎖에. 24 시간 후에 약 50 % 합류점을 보장하기 위해 필요한 셀의 양을 사용한다.
    주 : 우리의 실험에서, 우리는 HT-1080 세포주 및 플레이트 배양 접시 당 1 × 10 5 세포를 사용합니다.
  2. 교정에 사용되는 실험 및 플레이트 (5 건) 문화 요리에 필요한 배양 접시의 수를 결정합니다.
  3. 최소 24 시간 동안 37 ° C / 5 % CO 2 배양기에 넣고 배양 접시.

pH를 감지 프로브 3. 준비

  1. DDH 2 0에서 형광의 pH 프로브 8-hydroxypyrene-1, 3,6 trisulfonic 산, 삼 나트륨 염 (HPTS / pyranine)의 1M 주식 솔루션을 준비합니다. 이 솔루션은 실온에서 저장 빛으로부터 보호되어야한다.
  2. 는 thereâ라고, (및-6) - 카르 복실 seminaphthorhodafluor 아세 톡시 메틸 에스터 아세테이트 (C-SNARF-1 AM - 1 ~ 5 ㎜의 재고 솔루션을 준비합니다따고 SNARF-1) DMSO 1.76 ㎖에 SNARF-1의 1 MG를 용해하여. 철저 반복 피펫으로 혼합. SNARF-1 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다.

4. 셀 라벨

  1. 열 여섯 시간 라이브 세포 이미징 전에 완전 배지 2 ㎖를 포함하는 각 배양 접시에 1M HPTS 원액의 2 μL (최종 농도 1 ㎜)를 추가합니다.
  2. 배양기에 배양 접시를 돌려줍니다. HPTS 프로브 따라서 라벨에 프로브는 세포 작용에 의해 흡수되어야한다 소기관, 세포 impermeant입니다. 이 조건은 HPTS와 세포 배양 혈청이 첨가 된 배지에서 수행해야합니다.
  3. HPTS와 배양 후, 멸균 PBS로 두 번 세포를 세척하고 적어도 2 시간 동안 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다. SNARF -1 인큐베이션 혈청은 프로브의 흡수를 방지 할 수 있으므로 무 혈청 배지에서 수행 될 필요가있다.
  4. AF를 얻기 위해 1 ㎜ SNARF-1 원액의 10 μl를 추가합니다원고 판 5 μM의 농도와 세포가 희미한 빛 아래에서, 37 ° C에서 20 분 동안 배양 할 수 있습니다. C-SNARF-1 농도와 배양 시간은 세포의 종류에 따라 다를 수 있습니다.
  5. 부화의 끝에서, 멸균 PBS에 두 번 세포를 세척하고 무 혈청 배지 2 ㎖를 추가합니다.

산도 변조기 5. 추가

  1. 이 방법은 세포에 pH 변화를 감지 할 수 있는지 여부를 평가하기 위해, 세포 내 산도를 조절하는 다른 시약을 사용할 수 있습니다 :
    • Bafilomycin A1, V-ATPase의 5 특정 억제제
    • NA + / H의 + 교환기 이소 형 1 (NHE-1) ~ (6)
    • NH 4 망할 CIA, 세포 내 pH가 7 증가 약한베이스
    1. 위에서 언급 한 시약의 주식 솔루션을 준비 :
      • Bafilomycin A1 : 100 μM의 원액을 얻기 위해 DMSO 160 μL에 bafilomycin A1의 10 μg을 추가
      • EIPA :는 obtai 메탄올 1.67 ml로 EIPA의 25 밀리그램을 추가50 mm의 최종 농도 NA
      • NH4Cl 등 : 1 mM의 최종 농도를 구하는 DDH 2 O 10ml에 염화 암모늄 0.53 g을 용해.

      참고 : 모든 주식 솔루션은 -20 ° C에서 보관하고 빛으로부터 보호되어야한다 bafilomycin의 A1을 제외하고 4 ° C에 보관해야합니다.
    2. 별도의 배양 접시에서, 아래에 설명 된대로 시약 중 하나를 추가합니다 :
      • 100 μM의 bafilomycin A1의 2 μL (최종 농도 100 NM)
      • 50 mM의 EIPA 1 μL (최종 농도 25 μM)
      • 1M NH4Cl 등 (최종 농도 20 ㎜)의 40 μL
    3. 37 ℃에서 30 분 동안 세포를 품어
  2. 이미지 수집을 진행합니다.

6. 라이브 세포 이미징 현미경의 사양 및 취득 설정

  1. 사용하여 라이브 세포 이미징을 수행 40X 목적은 스펙트럼 반전 스캐닝 공 촛점 microsco에 장착퍼가기 전동 XY 스테이지, 환경 제어 (온도, 습도, CO 2) 단계 인큐베이터에서 유리 바닥 문화 요리를 수용하는 챔버를 탑재.
  2. 여기에 사용 된 공 초점 악기 (올림푸스 FV1000)가 장착되어 있습니다 :
    • 다이오드 레이저 405 nm의
    • 40 mW의 아르곤 레이저 (458 nm의, 488 nm의, 515 nm의)
    • 헬륨 네온 레이저 (543 nm의)
    • 형석 10X 목적, NA0.4
    • LUCPLFLN 40X 목적, NA0.60
    • PLAPONSC PLAN APO 60X 오일 목적, NA1.4
    • 다이크로 익 미러 DM 405/458/488/543
    • SDM (560) 및 SDM (640), 다이크로 익 필터
    • BA655-755 차단 필터
    • 빔 스플리터 BS20/80
    • 이미지 수집 및 분석을위한 데이터 분석 소프트웨어,
  3. 무대 인큐베이터가 37 ° C로 예열하고 현미경이 설정되면, 이전에 촛점 무대 영상 실에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시를 놓습니다.
  4. 관심 영역을 위치 따고, 소프트웨어 취득 설정도 1을 조정한다.
    • 두 개의 가상 채널 세트를 설정합니다.
    • 525 nm의 570에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 600 nm의 505에서 405 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 첫 번째 단계를 시작합니다.
    • 525 nm의 640에서 543 nm의 방출 수집에 SNARF-1 여기 - - 650 nm의 505에서 458 nm의 방출 수집에 HPTS 여기에 해당하는 두 번째 단계를 시작합니다.
    • 공 초점 조리개는 기본적으로 175 μm의 설정 및 최적의 조리개를 수동으로 300 μm의에서 설정 될 필요가있다.
    • 0.4 μm의 두께의 직렬 수평 광학 절 (800 × 800 픽셀)를 적층하여 이미지를 가져 가라.

참고 : 40X 목적은 동시에 여러 개의 세포를 관찰하는 데 유용하고 세포 기관보기에 적합합니다. 그러나, 공간 해상도 및 신호 강도는 베티 아르R은 60X 오일 목적을 사용하여 달성. 또한,이 색소 사이의 여진 또는 발광 크로스 토크는 없다.

pH를 감지 프로브의 7. 교정

  1. 교정하기 전에, 이전에 HPTS와 SNARF-1 배양 배양 접시에서 매체를 제거 멸균 PBS로 두 번 세척 한 다음 다섯 교정 솔루션 중 하나 2 ㎖를 추가합니다.
  2. 공 초점 무대 챔버로 배양 접시를 놓습니다.
  3. 다음 설정에 따라 시간 경과 이미지 수집을 진행 :
    1. 실험에 대한 이미지와 간격 기간의 횟수를 설정합니다.
      참고 : 우리는 일반적으로 최대 30 분 동안 이미지 사이에 1 분 간격을 사용합니다.
    2. 각 이미지의 취득 사이에 닫습니다 셔터를 프로그램.
  4. 스프레드 시트 소프트웨어에 분당 형광 강도를 기록하고 형광 강도가 상승 할 때의 시간을 결정한다. 20 분 - 세포 내 pH는 15 일 이후 일반적으로 안정적이다.
  5. REPEAT는 나머지 각 교정 솔루션을위한 새로운 배양 접시를 사용하여 7.4 7.1 단계를 반복합니다.

8. 데이터 수집

  1. 교정이 완료되면, 필드 당 15 ~ 20 세포를 포함하는 4-5 무작위로 선택한 분야에서 샘플 데이터를 수집. 두 이미지는 각 필드에 대해 얻을 수 있습니다 : HPTS 라벨 (소포)와 SNARF-1 라벨 (세포질)에 대한 두 번째 하나.
  2. 배경 형광 (세포 외 영역)는 디지털 두 프로브의 형광 이미지에서 차감됩니다. 각각의 저장된 이미지에서 레이블이 소포 및 세포질은 바이너리 마스크를 사용하여 선택됩니다. 각각의 pH를 감지 프로브를 들어, 형광 강도는 수치 척도 (0-4,095 회색 수준의 규모)에 측정된다. 소기관 또는 세포질 내의 모든 픽셀의 평균 휘도가 계산되고 형광 값의 비율을 계산하는 데 사용된다.

9. 데이터 분석

  1. 다양한 소프트웨어 패키지는 데이터 분석을위한 상업적으로 이용 가능하다. 즉Fluoview 소프트웨어.
  2. 다음 스프레드 시트, 레코드 값과 형광 비를 계산 HPTS의 경우, R = (F 458 ㎚ / F 405 NM)와, SNARF-1, R = (F 644 ㎚ / F 584 ㎚의 경우 ).
  3. 같은 그래프 패드 프리즘 과학적 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 그린다. 플롯은 산도 (X 축)의 함수로서 형광 비율 (Y 축) 묘사한다. 커브 피팅 비선형 회귀 분석을 사용하여 달성된다.
  4. 단계 20.7에 기재된 바와 같이 샘플의 형광 농도 모아서 형광 비율을 계산한다. pH 값으로 비율을 변환하는 보정 곡선을 사용합니다.

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결과

세포 내 엔도 좀 / 리소좀 세포 구획 모두에서의 pH의 동시 측정을 위해, 비율 계량 형광 pH를 감지 SNARF-1 프로브 및 HPTS를 사용 하였다. HPTS가 엔도 솜 / 리소좀 구획의 비율 계량 산도를 측정 할 수있는 반면 SNARF-1은 세포 내 구획으로 제한됩니다. 16 시간 동안 HPTS있는 셀로드는 엔도 좀 / 리소좀 4의 선택적 지역화 할 수 있습니다. pH를 감지 프로브와 함께로드 HT-1080 세포에서 기록 된 형광의 전형적인 예는 그림 2A에 표시됩니다. HPTS는 엔도 좀과 리소좀 두 구획 레이블 증거는 알렉사 546 - 복합 트랜스페린 (엔도 솜) 또는 형광 lysotrophic 프로브 (Lysotracker 깊은 Reddye)와 공동 염색을 얻었다. 데이터는 명확하게 HPTS 두 구획 그림 2A 스테인드 것으로 나타났다.

상술 된 방법을 사용하여 살아있는 세포에서의 세...

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토론

다른 세포 구획의 라이브 세포 이미징 양적 pH 측정은 정확하게 외부의 도전에 대한 세포 반응에서의 pH의 변화를 측정하기 위해 필요합니다. 그러나 남아있는 주요 장애물 중 하나는 쉽게 구체적으로 세포 구획을 대상으로하는 것입니다. 이 점에서, 몇 가지 연구는 일렉트로 또는 마이크로 인젝션 8-10 의해 세포 내로 도입 세포 내 pH를 지표로 HPTS의 사용을 강조했다. 이 기술은 즉 일렉트로 세포에 광범위한 피해를 발생시키고 미세 주입은 특수 장비 및 기술 능력을 필요로 심각한 결점으로 고통. 그 중에서, 힌튼 외. 이전 HPTS가 세포 작용의 과정에 의해 세포에 의해 다루어 SNARF-1 및 HPTS의 조합 / 리소좀 구획 3 세포질과 엔도 솜의 pH를 모니터링하는데 사용될 수 있다는 될 수 있다고보고했다 . 우리는 리소좀 / 엔도 좀 compartm에서의 pH 변화를 기록하기 위해이 속성을 사용했습니다라이브 HT-1080 세포의 이비인후과. HPTS이 구획에 위치했다...

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공개 사항

이해 상충이 선언되지 않았습니다.

감사의 글

원고를 비판적으로 읽어주신 Gilles Dupuis 박사님께 감사드립니다.

자금 조달

이 연구는 캐나다 보건 연구소(Canadian Institutes for Health Research)의 지원을 받았으며 보조금 # MOP-126173을 받았습니다. C.M.D는 FRSQ(Fonds de la Recherche en Santé)의 자금 지원을 받는 Centre de Recherche Clinique Étienne LeBel의 회원입니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
교정
: 염화나트륨FischerL-11621
염화칼륨FischerM-12445
D-포도당(덱스트로오스)FischerD16-1
황산마그네슘FischerM65-500
HEPES,Sigma-AldrichH3375
Calcium chloride dihydrateFischerM-1612
탈이온수N/A/A
NigericinCalbiochem481990흡입 또는 피부 접촉에 의해 독성
4°C에서 빛으로부터 보호하십시오. C
배양 접시 & 35mmBD Biosciences354456
pH 감지 프로브
8-Hydroxypyrene-1,3,6-trisulfonic acid (HPTS)Life technologiesH-348실온에서 빛을 멀리하십시오
5-(and-6)-Carboxy SNARF®-1, Acetoxymethyl Ester, AcetateLife technologiesC-1271-20 °에서 빛과 습도로부터 멀리 유지하십시오. C
디메틸 수폭사이드(DMSO)피셔BP231-1 해로운
인산염 완충 식염수(PBS) 100X
염화칼FischerM-1244520g
인산나트륨 일염기FischerS369-1115g
인산칼륨 일염기J.T Baker3246-0120g
탈이온수N/AN/A1L
오토클레이브를 만들고 pH를 7.4로 조정합니다.
인산염 완충 식염수(PBS) 1X
PBS 100XN/AN/A50ml
염화나트륨FischerL-1162140.5g
탈이온수N/A5L
pH 조절제
Bafilomycin A1Sigma-AldrichB-1793
5-(N-에틸-N-이소프로필)아밀로라이드(EIPA)시그마-알드리치A3085
염화암모늄 피셔A649-500
용 용액, , , , N륨 성 성

참고문헌

  1. Demaurex, N. pH Homeostasis of cellular organelles. News Physiol Sci. 17, 1-5 (2002).
  2. Webb, B. A., Chimenti, M., Jacobson, M. P., Barber, D. L. Dysregulated pH: a perfect storm for cancer progression. Nat Rev Cancer. 11, 671-677 (2011).
  3. Hinton, A., et al. Function of a subunit isoforms of the V-ATPase in pH homeostasis and in vitro invasion of MDA-MB231 human breast cancer cells. J Biol Chem. 284, 16400-16408 (2009).
  4. Overly, C. C., Lee, K. D., Berthiaume, E., Hollenbeck, P. J. Quantitative measurement of intraorganelle pH in the endosomal-lysosomal pathway in neurons by using ratiometric imaging with pyranine. Proc Natl Acad Sci U S A. 92, 3156-3160 (1995).
  5. Drose, S., Altendorf, K. Bafilomycins and concanamycins as inhibitors of V-ATPases and P-ATPases. J Exp Biol. 200, 1-8 (1997).
  6. Pedersen, S. F., King, S. A., Nygaard, E. B., Rigor, R. R., Cala, P. M. NHE1 inhibition by amiloride- and benzoylguanidine-type compounds. Inhibitor binding loci deduced from chimeras of NHE1 homologues with endogenous differences in inhibitor sensitivity. J Biol Chem. 282, 19716-19727 (2007).
  7. Alfonso, A., Cabado, A. G., Vieytes, M. R., Botana, L. M. Calcium-pH crosstalks in rat mast cells: cytosolic alkalinization, but not intracellular calcium release, is a sufficient signal for degranulation. Br J Pharmacol. 130, 1809-1816 (2000).
  8. Han, J., Burgess, K. Fluorescent indicators for intracellular pH. Chem Rev. 110, 2709-2728 (2010).
  9. Giuliano, K. A., Gillies, R. J. Determination of intracellular pH of BALB/c-3T3 cells using the fluorescence of pyranine. Anal Biochem. 167, 362-371 (1987).
  10. Willoughby, D., Thomas, R., Schwiening, C. The effects of intracellular pH changes on resting cytosolic calcium in voltage-clamped snail neurones. J Physiol. 530, 405-416 (2001).

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