면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.
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이 논문에서
요약
초록
본 논문에서 우리는 도구, 시약 및에 필요한 실제적인 단계를 설명 : 면역 조직 화학 염색에 대한 wholemount 망막의 1) 성공적인 준비를하고, 망막에서 칼슘 신호 전달을 매개 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 연구를위한 2) 칼슘 이미징 신경절 세포. 칼슘 촬상 방법 우리 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 우회 관한 문제를 설명한다.
서론
현재 1,2 채널 Ca는 전체 셀의 이들 성분의 약리 봉쇄를 통해 결정된 바와 같이 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포는) L-, N-, P / Q- 및 T 형 VGCC 표현. VGCC 송신기 자료, 유전자 전사, 세포 조절과 시냅스 가소성의 3,4,5에 참여하는 횡단 다중 체 단백질이다. 한 기공 채널의 생물 물리학 적 및 약리학 적 특성, 주로 세포 외 보조 α이 δ 소단위와 세포 내 β 서브 유닛을 설정 서브 유닛을 형성 α 대형, 횡단 : 기능 VGCCs은 서브 유닛 중 적어도 세 가지 클래스로 구성되어 있습니다. 다른 한 α 소단위와 후자의 두 형태 heteromeric 복합체와 세포막 6 채널의 게이팅 동력학 및 매매를 변경.
최근 수십 년 동안 많은 기술은 단백질 expre을 연구하기 위해 사용되었다이러한 면역 조직 화학, 효소 면역 분석법, 서부 분석 및 유동 세포 계측법 등 ssion. 이러한 기술은 주어진 관심 단백질의 검출을 위해 특정 항체의 사용을 필요로하고 다른 조직에서 지역화 특정 단백질의 분포를위한 강력한 도구를 제공한다. 항체가 용이하지 않을 때 예컨대 노던 블롯 분석과 같은 특정 단백질의 m....
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프로토콜
모든 실험은 인간의 실험실 동물의 관리 및 사용 및 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학 (UCLA) 동물 연구위원회에 미국 공중 보건 서비스 정책에 의해 발행 된 실험 동물의 복지에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 남성과 여성 성인 흰쥐 3-5주 세 사이 (찰스 리버 연구소, 윌 밍턴, MA)를 사용 하였다.
Wholemount 망막 및 면역 프로토콜에 대한 1 동물 및 조직 준비
- 해부 현미경, 아주 좋은 팁, 가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드와 두 집게 다음 재료 및 도구를 준비합니다.
- 깊이 단두대로 잘린 다음 1-3% 이소 플루 란 (isoflurane)와 동물을 마취에 의해 밀폐 된 챔버에 쥐를 안락사. 세포 외 용액을 포함하는 페트리 접시에 홍채 가위와 장소 한 쌍의 눈을 제거합니다. A, 에임스 나 최대 절전 모드dium 또는 생리 학적 솔루션을 권장합니다.
- [선택 단계 FLUO-4와 망막 신경절 세포의 채움이 필요한 경우]. 단계 2.3-2.4에 설명 된대로 FLUO-4 라벨을 수행합니다.
- 해부 현미경 (광량 : 1.6 x 10 8 포톤 / mm 2 ⋅sec)를 사용하여, 안구의 전면을 차단....
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결과
특정 항체를 Immunolabeling은 망막과 칼슘 이미징 기술에 대한 관심의 특정 단백질의 현지화를 연구하는 플랫폼을 제공하는 망막 신경절 세포 축색 돌기의 칼슘 역학 VGCCs의 기여에 대한 연구를 허용합니다.
신경절 세포 단백질 RBPMS에 대해 선택적으로 망막 신경절 세포 (19) 레이블 (다중 접합와 RNA 결합 단백질)을 항체를 사용하여, 우리는 FLUO-4 라벨은 신경절 세포 (그림 1)로 제한되어 있음을 보여줄 수 있었다. 루터 주입이 기술에서 예상 할 수있는 모든 신경절 세포의 라벨로 이어질하지 않습니다.
토끼 폴리 클로 날 항체는 상업적 공급 업체 (표 1)에 의해, RBPMS 폴리펩티드 (RBPMS 4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR의 N-말단에 대해 생성 하였다. RBPMS 높은 포유 동물.......
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토론
1) 면역 조직 화학 망막 wholemounts의 신경절 세포에 FLUO-4 현지화를 보여, 2) 칼슘 이미징 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 분석하기 위해이 문서에서 우리는 두 가지 기술을 설명했다.
wholemounts을 사용하여 면역 조직 화학 20-23 망막 설치류에서 단백질의 현지화를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 몇 가지 제한이있다. 염색의 품질은 그 각각의 항원과 관심 특정 층에 망막 조직에 침투하는 능력을 인식하는 항체의 능력에 크게 의존한다. 이러한 문제는 신경절 세포 층을 통해 항체의 확산을 허용하도록 여과지없이, 최대 7 일까지 차 항체의 잠복기를 증가 트리톤-X의 농도를 증가 및 / 또는 망막을 배양함으로써 개선 될 수 있고, 광 수용체. 또 다른 제한은 durati입니다에와 고정의 농도. 조직이 한 시간 동안 고정 될 때 다른 항체가 짧은 고정 기간을 필요로하지만 어떤 항체는 더 나은 작동합니다. 특정 항체가 4 % .......
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공개 사항
저자는 공시가 없습니다.
감사의 글
우리는 칼슘 이미징 프로토콜에 기여 박사 S. 스텔라와 헬렌 브엉 감사합니다. 우리는 인터뷰 장면을 촬영 박사 K. 시트 감사합니다. 우리는 원고에 그녀의 의견을 박사 아린 히라노 감사합니다. 이 연구 개발 프로젝트는 원격 진료 및 고급 기술 UCLA에서 의학의 데이비드 게펜 학교에서 저자에 의해 실시 된 미국 육군 의학 연구 및 물자 명령 (USAMRMC)에 의해 수여 및 투여 한 계약의 계약에 의해 가능하게되고, 계약 번호에서 MD 요새 Detrick에서 연구 센터 (TATRC) : W81XWH-10-2-0077. 이러한 연구에 대한 지원은 NIH의 EY04067 및 VA 훈장 검토 (NB)에서왔다. NCB는 VA 경력 연구원이다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 스트레이트 가위 | WPI | 14124-G | 해부 도구 |
| 스트레이트 집게 | WPI | 501985 | 해부 도구 |
| 곡선 홍채 가위 | WPI | 504487 | 해부 도구 |
| 셀룰로오스 여과지 | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | 벡터 | H-1000 | 형광용 매체 장착 |
| Fluo-4 펜타칼륨 | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurane | Abbott Laboratories | 05260-05 | 마취 |
| 현미경 슬라이드 | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Pascal 현미경 | Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0.8) 대물렌즈 렌즈 | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG (H+L) 항체 | 분자 프로브 | A-11034 | 보조 항체 |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | 토끼 다클론 항체 RBPMS의 N-terminus에 대해 생성되었습니다. 폴리펩티드(RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, 상업 공급업체(ProSci, Poway, CA)에 의해. |
참고문헌
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ga....
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재인쇄 및 허가
