Wholemount 쥐의 망막에서 면역 조직 화학 및 칼슘 이미징 방법

요약

면역 프로토콜은 망막에있는 특정 단백질의 현지화를 연구하는 데 사용됩니다. 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 연구하기 위해 사용된다.

초록

본 논문에서 우리는 도구, 시약 및에 필요한 실제적인 단계를 설명 : 면역 조직 화학 염색에 대한 wholemount 망막의 1) 성공적인 준비를하고, 망막에서 칼슘 신호 전달을 매개 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCC)의 연구를위한 2) 칼슘 이미징 신경절 세포. 칼슘 촬상 방법 우리 신경절 세포 층에서의 변위 무 축삭 세포의 비특이적 로딩 우회 관한 문제를 설명한다.

서론

현재 ^1,2 채널 Ca는 전체 셀의 이들 성분의 약리 봉쇄를 통해 결정된 바와 같이 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포는) L-, N-, P / Q- 및 T 형 VGCC 표현. VGCC 송신기 자료, 유전자 전사, 세포 조절과 시냅스 가소성의 ^3,4,5에 참여하는 횡단 다중 체 단백질이다. _한 기공 채널의 생물 물리학 적 및 약리학 적 특성, 주로 세포 외 보조 _α이 δ 소단위와 세포 내 β 서브 유닛을 설정 서브 유닛을 형성 α 대형, 횡단 : 기능 VGCCs은 서브 유닛 중 적어도 세 가지 클래스로 구성되어 있습니다. 다른 _한 α 소단위와 후자의 두 형태 heteromeric 복합체와 세포막 ⁶ 채널의 게이팅 동력학 및 매매를 변경.

최근 수십 년 동안 많은 기술은 단백질 expre을 연구하기 위해 사용되었다이러한 면역 조직 화학, 효소 면역 분석법, 서부 분석 및 유동 세포 계측법 등 ssion. 이러한 기술은 주어진 관심 단백질의 검출을 위해 특정 항체의 사용을 필요로하고 다른 조직에서 지역화 특정 단백질의 분포를위한 강력한 도구를 제공한다. 항체가 용이하지 않을 때 예컨대 노던 블롯 분석과 같은 특정 단백질의 mRNA 발현 수준을 검출하고 정량화하기 위해 사용되는 기술은, RT-PCR은 실시간 정량 RT-PCR은, 동일계 하이브리드 화에서의 cDNA 마이크로 어레이 및 리보 뉴 클레아 제 보호 어 세이는 대안적인 접근법을 제공한다 특정 단백질을 사용할 경우 또는 발현 수준 ⁷ 낮다. 그러나, 이러한 분자 기술의 사용에 대한 제한은 하나의 유전자 서열의 신분증이다.

망막에서 단백질을 지역화하기 위해 면역 조직 화학 염색은 wholemount 망막 수행 할 수 있습니다. 망막 신경절 세포의 접근성, wholemount 인해준비는 RGC의 세포체와 축색 돌기 특정 단백질의 현지화를 연구 할 수있는 훌륭한 플랫폼을 제공합니다.

현지화 외에도, 망막 신경절 세포에서 VGCCs 일부 기능적 특성은 칼슘 이미징 기술의 사용을 통해 입증 될 수있다. 우리는 선택적으로 세포 내 칼슘의 동력학을 측정하는 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포에 레이블 칼슘 촬상 프로토콜을 설명한다. 다른 세포 구획에서 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여도는 특정 서브 타입 칼슘 채널 차단제를 이용하여 분리 할 수​​있다.

아마도 여기서 설명 칼슘 이미징 기술의 가장 이로운 측면 중 하나는 독립적으로 동시에 다수의 망막 신경절 세포 및 그들의 축삭에서 기록하는 기능이다. 이러한 전체 세포 패치 클램프 녹음 등 많은 생리 학적 기술은 높은 시간 해상도 막 전류의 기록, 신체 또는 살전의 축삭 소스를 제공하지만기록 된 전자 전류는 구별 될 수없고 레코딩은 한번에 하나의 신경 세포로부터 제조 될 수있다. 다중 전극 배열 (다자간)는 동시에 여러 셀들로부터 스파이크를 기록 할 수 있지만, 검출되지도의 활성화를 구별, 칼슘 채널의 예를 들면, 상이한 서브 타입 둘 수있다. 우선적으로 대형 스파이크 ^구를 생성하는 세포에서 주어진 전극 ⁽⁸⁾ 기록에 가까이에있는 세포에서 기록 MEAS. 광학 이미징 방법은 단일 세포 미세 전극 및 패치 클램프 기록 MEA 기록에 의한 정보로 통합 될 수있는 세포의 전체 인구의 동시 독립적 녹화 가능하도록 대체 전략을 제공한다. 여기에 설명 된 칼슘 이미징 기술은 망막 신경절 세포의 칼슘 동역학을 연구하기 위해 사용되었지만, 패치 클램프 및 다자간 또한 상기 이온 전류 및 망막 신경절 세포의 특성을 규명 급상승 병렬로 사용될 수있다.

변위 무 축삭 세포 ¹⁰ 망막 마우스의 신경절 세포 층에서의 신경 인구의 약 60 %를 차지하기 때문에, 우리의 목표는 선택적으로 합성 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포를 라벨 로딩 기술을 사용하는 것이었다 wholemount 준비. 합성 칼슘 지표 염료는 세포 내 칼슘 역학 연구를위한 훌륭한 플랫폼을 제공하지만, 널리 사용은 효과적으로 주어진 네트워크 내에서 신경 세포의 특정 인구를로드 할 수없는 방해하고있다. 같은 대량로드 ^(11)와 일렉트로의 ^8,12와 같은 많은 기술은 세포의 전체 인구는, 그러나, 이러한 기술은 특정 세포 유형을 구별하지 않는로드하기 위해 수행되었다. 유전자 칼슘 지표 선택적으로 세포의 특정 집단 레이블을 할 수있는 능력을 제공하는 부호화 그러나 이러한 방법은 형질 전환 동물 ^(13)의 생성을 요구한다. 우리의 기술 방식 운전 방식을 설명d를 선택적으로 칼슘 지시 염료의 시신경 그루터기 주입을 통해 wholemount 준비 망막 신경절 세포 레이블을.

이와 함께,이 문서에 설명 된 구조와 생리 학적 기술은 망막 신경절 세포와 축색 돌기의 현지화 및 칼슘 신호에 VGCCs의 기여를 공부하는 플랫폼을 제공합니다.

프로토콜

모든 실험은 인간의 실험실 동물의 관리 및 사용 및 캘리포니아 로스 앤젤레스 대학 (UCLA) 동물 연구위원회에 미국 공중 보건 서비스 정책에 의해 발행 된 실험 동물의 복지에 대한 지침에 따라 수행 하였다. 남성과 여성 성인 흰쥐 3-5주 세 사이 (찰스 리버 연구소, 윌 밍턴, MA)를 사용 하였다.

Wholemount 망막 및 면역 프로토콜에 대한 1 동물 및 조직 준비

1. 해부 현미경, 아주 좋은 팁, ​​가위, 셀룰로오스 필터 종이, 플라스틱 피펫과 현미경 슬라이드와 두 집게 다음 재료 및 도구를 준비합니다.
2. 깊이 단두대로 잘린 다음 1-3% 이소 플루 란 (isoflurane)와 동물을 마취에 의해 밀폐 된 챔버에 쥐를 안락사. 세포 외 용액을 포함하는 페트리 접시에 홍채 가위와 장소 한 쌍의 눈을 제거합니다. A, 에임스 나 최대 절전 모드dium 또는 생리 학적 솔루션을 권장합니다.
3. [선택 단계 FLUO-4와 망막 신경절 세포의 채움이 필요한 경우]. 단계 2.3-2.4에 설명 된대로 FLUO-4 라벨을 수행합니다.
4. 해부 현미경 (광량 : 1.6 x 10 ⁸ 포톤 / mm ² ⋅sec)를 사용하여, 안구의 전면을 차단하여 각막을 제거한다. 집게 안쪽 망막 표면에서 렌즈와 유리체를 제거합니다. 유리체를 제거하려면 한 forcep으로 꽉 공막을 잡고 안구를 안정. 조심스럽게 다른 forcep와 망막의 중앙으로 유리체 기반을 벗겨. 이 단계에서 준비 저온부에 사용되는 아이 컵, 불린다. 저온부에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 ^{(14, 15)에서} 찾을 수 있습니다.
5. 아이 컵에서 망막을 제거합니다. 그런 다음, 네 상처는 망막 눕혀 할 수 있도록 할 수 있습니다. 조심스럽게 광 수용체 층 위로 현미경 슬라이드에 망막을 탑재합니다. 망막에 용액을 한 방울을 추가하고 CE 마크를 넣어망막에 llulose 필터 종이. 망막 여과지에 부착되면, 다시 용액 망막 배치. 필요한 경우, 브러시 또는 집게로 망막을 평평.
6. 고정 10 ~ 15 분 동안 4 % PFA에 wholemounted 망막을 놓습니다.
7. 0.1 M 인산염 완충액 (PB), pH가 7.4에서 30 분 동안 wholemounted 망막을 세 번 씻으십시오. 밤새 4 ° C에서 0.3 % 트리톤 X-100, 0.1 % NaN의 _3을 포함하는 0.1 PB 5 % 정상 염소 혈청 또는 당나귀 혈청 망막을 차단합니다. 우리는 차단 솔루션과 항체를 저장하기위한 모든 단계 500 μL의 최종 볼륨을 권장합니다.
8. 다음 날, 4 ° C에서 차 항체 5-7일와 망막의 wholemounts을 배양한다. 최적의 희석은 사용자에 의해 결정되어야한다.
9. PB 0.1 M에서 망막 3 × 30 분 씻고 차 항체 (농도 1 : 1000)의 종류에 대하여 지시 된 해당 형광 접합 된 이차 항체에 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
10. PB 30 분 각각의 세 최종 세척 후, 중간 장착의 망막을 탑재합니다. 장기간 보관을위한 매니큐어와 커버 슬립을 봉쇄. 저장 샘플 4 ° C에서와 빛으로부터 보호합니다.

칼슘 표시기 염료와 쥐 Wholemount 망막의 신경절 세포와 축삭의 2 라벨링

1. 95 _%, O2 / 5 % CO 버블 포유 동물 링거 포함 125 염화나트륨, 3의 KCl, 2 _{염화칼슘,} 1.25의 NaH ₂ PO _4, 1 _MgCl2를, 25 _탄산 수소 나트륨 (mm 단위)의 1,000 ml의 10 포도당을 준비 ^­ _2.
2. 단계 1.2-1.4에 설명 된대로 절개를 수행합니다.
3. 주사기를 사용하여 안구에 약 1mm 후방 시신경 그루터기에 FLUO-4 pentapotassium 염 (H ₂ O에서 40 밀리미터 주)의 0.5 μl를, 칼슘 지시 염료와 망막 신경절 세포 (망막 신경절 세포)와 축색 돌기를로드 삽입하려면 . [CA에 신경절 세포의 동적 인 상승을 측정하기 ²⁺ ] _나는 그런 FLUO-4 345 nm의의의 K의 _D와 높은 친 화성을 ​​가진 지표는 최적입니다. FLUO-4에 결합 할 때 칼슘> 100 배의 방출 증가의 결과로 매우 높은 양자 효율을 갖는 추가적인 이점을 제공한다.
4. 포유 동물 링어의 95 % O 버블 ₂ / 5 % CO에 아이 컵을 놓고 ^­ _이 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안.

망막 신경절 세포와 축삭을위한 3 칼슘 이미징 프로토콜.

1. 단계 1.1 ~ 1.4에 설명 된대로 눈, 렌즈와 유리체를 제거합니다. 아이 컵에서 망막을 분리하고 사분면으로 나눕니다. 마운트 사분면의 신경절 세포의 유리 슬라이드에면을 위로하고 안정 하프 슬라이스 그리드를 사용합니다. 어두운 적응 다른 조각을 유지 포유 동물 링어의 95 % O 버블 ₂ / 5 % CO에 ^­ 나중에 사용하기 위해 얼음에 _2.
2. 포유류 링거액으로 기록 챔버와 Superfuse95 _%, O2 / 5 % CO _2와 함께 지속적으로 버블 링 솔루션을 유지한다.
3. 이미지 현미경 조직. 실온 (~ 23 ° C에서) 또는 행동 실험, 무대를 따뜻하게 시편에서 물 목욕을 가열 또는 시료의 표면에 따뜻한 공기를 적용하여 생리 온도를 얻을 수 있습니다.
   주 : 많은 세포 기능은 세포 내 항상성 ^(16)를 유지에 중요한 역할을 온도에 의해 조절된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 그러나 온난화 대책의 도입은, 열팽창 ¹⁷ 의한 중간 포커스 드리프트의 증발을 photobleaching에의 속도를 증가시킬 수있다. 실내 온도의 사용은 FLUO-4 ^(18)의 세포 내 구획화을 감소시킨다.
4. 약물의 부재에 두 쌍의 높은 K ⁺ 펄스들의 제어를 수행한다. 활성화하기 위해 각 펄스 동안 33 초 60는 3mm _O를 [K ^+]를 높여 망막 신경절 세포와 축삭 RGC을 탈분극여덟 채널 중력 구동 superfusion 시스템 VGCCs. 높은 K ^{+ 용액} isosmolarity을 유지하기 위해 57 mm 정도 나 ^+를 줄입니다.
5. 일반 또는 특정 칼슘 채널 차단제의 사용과 칼슘 신호에 다른 VGCCs의 기여를 평가한다. 예를 들어, 비 특정 칼슘 채널 차단제, 코발트 투여 칼슘 신호의 감소는, 높은 K ⁺ -evoked 칼슘 신호 VGCCs의 기여의 반 정량적 측정 값을 제공 하였다.
6. (도 2) 관심 망막 신경절 세포 주변의 관심 (ROI)의 영역을 배치하여 형광 강도 값을 획득.
7. 제 높은 K ⁺ 피크에 의해 생성 된 변화에 제 높은 K ⁺ 피크에 의해 생성 된 형광 강도의 변화를 정규화한다. 이어서, 특정 칼슘 채널 차단제의 테스트를 위해, 단지 한 쌍의 제 높은 K ^{+ 펄스} 동안 약물을 적용하고이 피크에 대해 정상화제 1 피크 값. 이 높은 K ⁺ 피크에 약물의 영향을 측정하기 위해 제의 의하여 제 K ⁺ 피크의 진폭을 나눈다. 분석은 약물의 부재하에 측정 한 쌍의 높은 K ⁺ 피크로부터 유도 그들의 정합 제어에 대하여 이러한 값을 수행하여야한다.
8. 5 초 간격으로 이미지를 획득. 광 탈색을 방지하기 위해 가능한 한 낮은 레이저 구동을 유지한다. 광전자 증 배관은 505 나노 LP 필터로 형광 방출을 수집하면서, 아르곤 레이저의 488 nm의 라인으로 음원을 제공한다.

결과

특정 항체를 Immunolabeling은 망막과 칼슘 이미징 기술에 대한 관심의 특정 단백질의 현지화를 연구하는 플랫폼을 제공하는 망막 신경절 세포 축색 돌기의 칼슘 역학 VGCCs의 기여에 대한 연구를 허용합니다.

신경절 세포 단백질 RBPMS에 대해 선택적으로 망막 신경절 세포 ⁽¹⁹⁾ 레이블 (다중 접합와 RNA 결합 단백질)을 항체를 사용하여, 우리는 FLUO-4 라벨은 신경절 세포 (그림 1)로 제한되어 있음을 보여줄 수 있었다. 루터 주입이 기술에서 예상 할 수있는 모든 신경절 세포의 라벨로 이어질하지 않습니다.

토끼 폴리 클로 날 항체는 상업적 공급 업체 (표 1)에 의해, RBPMS 폴리펩티드 (RBPMS _4-24) GGKAEKENTPSEANLQEEEVR의 N-말단에 대해 생성 하였다. RBPMS 높은 포유 동물...

토론

1) 면역 조직 화학 망막 wholemounts의 신경절 세포에 FLUO-4 현지화를 보여, 2) 칼슘 이미징 망막 신경절 세포 축색 돌기 칼슘 역학을 분석하기 위해이 문서에서 우리는 두 가지 기술을 설명했다.

wholemounts을 사용하여 면역 조직 화학 ^20-23 망막 설치류에서 단백질의 현지화를 나타 내기 위해 사용되었다. 그러나, 몇 가지 제한이있다. 염색의 품질은 그 각각의 항원과 관심 특정 층에 망막 조직에 침투하는 능력을 인식하는 항체의 능력에 크게 의존한다. 이러한 문제는 신경절 세포 층을 통해 항체의 확산을 허용하도록 여과지없이, 최대 7 일까지 차 항체의 잠복기를 증가 트리톤-X의 농도를 증가 및 / 또는 망막을 배양함으로써 개선 될 수 있고, 광 수용체. 또 다른 제한은 durati입니다에와 고정의 농도. 조직이 한 시간 동안 고정 될 때 다른 항체가 짧은 고정 기간을 필요로하지만 어떤 항체는 더 나은 작동합니다. 특정 항체가 4 % ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
스트레이트 가위	WPI	14124-G	해부 도구
스트레이트 집게	WPI	501985	해부 도구
곡선 홍채 가위	WPI	504487	해부 도구
셀룰로오스 여과지	Millipore	HABP04700
Hibernate A	Invitrogen	A12475-01	Media
Vectashield	벡터	H-1000	형광용 매체 장착
Fluo-4 펜타칼륨	Invitrogen	F-14200
Isoflurane	Abbott Laboratories	05260-05	마취
현미경 슬라이드	Fisher Scientific	22-178-277
Zeiss LSM 5 Pascal 현미경	Zeiss
Axioplan 40X (NA 0.8) 대물렌즈 렌즈	Zeiss
Alexa Fluor 488 염소 항토끼 IgG (H+L) 항체	분자 프로브	A-11034	보조 항체
RBPMS	ProSci, Poway, CA		토끼 다클론 항체  RBPMS의 N-terminus에 대해 생성되었습니다. 폴리펩티드(RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, 상업 공급업체(ProSci, Poway, CA)에 의해.