방법 논문

정량적 RT-PCR에 의해 개별 인간 배아 줄기 세포를 프로파일 링

DOI:

10.3791/51408

⸱

2014년 5월 29일

 ,  , 
1Institute for Cell Engineering, Department of Neurology and Neuroscience, Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

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단일 세포 유전자 발현 분석은 줄기 세포 이질성을 이해하는데 필요하다.

초록

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줄기 세포 인구의 이질성은 다른 계통쪽으로 분화 성향으로, 줄기 세포 생물학에 대한 자세한 이해를 방해한다. 단일 세포 사체 분석은 개인차를 해부하기위한 새로운 접근 방식이 될 수 있습니다. 우리는 하나의 셀 QRT-PCR 방법을 개발하고,이 방법은 여러 유전자 발현 프로파일에서 잘 작동하는지 확인했다. 단일 세포 수준에서 OCT4으로 분류되어 각각의 인간 배아 줄기 세포, :: EGFP 양성 세포는 OCT4 높은 표현하지만, NANOG 표현의 다른 수준이 있습니다. 우리의 단일 세포 유전자 발현 분석은 인구의 이질성을 심문하는 것이 유용 할 것이다.

서론

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가장 높은 진핵 생물의 인구가 풀링 인구의 분석에 따라서 이기종 있으며, 그것은 자신의 휴대 전화 기능을 해석하는 것이 어렵습니다. 인구 내의 개별 세포가 미묘하게 다를 수 있습니다, 그리고 이러한 차이는 전체 인구의 1, 2의 속성과 기능에 중요한 영향을 미칠 수 있습니다. 특히, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 섬세 독특한 방법으로 3, 4의 혈통 사양을 능성의 서로 다른 수준의 다양한 잠재력을 일으키는 이기종 것으로 알려져있다. 예를 들어, 다른 세포 표면 항원이 미분화 다 능성 줄기 세포를 분류하기 위해 사용될 수있다, (5) 및 오스틴 스미스 그룹은 그들의 형태, 감별 성향 및 통로 6 시그널링 종속성에 기초하여, 마우스 배아 줄기 세포의 다 능성의 상이한 레벨을 제안 하였다. 이러한 현상은 인간의 배아에 가설 된NIC 줄기 세포 12. 전체적인 연구는 다른 줄기 세포가 아닌 개별 단일 줄기 세포 사이에 수행 된 반면, 잠재적으로 모든 체세포 계통쪽으로 분화 능력에 영향을 단일 세포 수준에서 다 능성의 상이한 레벨을 분석하는 것은 매우 흥미로운 일 수 있었다.

세포 및 분자 이질성은 '단일 세포의 사체'라고하는 전....

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프로토콜

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96 - 웰 플레이트의 1. 준비

  1. 9 μL 하나의 세포 용해 용액에 하나의 세포 DNase1 1 μl를 섞는다.
  2. 96 - 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 10 ㎕를 혼합 용액을 넣어.

FACS 정화 2. 분리 및 인간 배아 줄기 세포

  1. 인간 ES 매체와 중화 된 37 ° C에서 20 분간 1 ㎖ Accutase와 60mm 접시,에서 OCT4 :: EGFP ES 세포주를 분리합니다.
  2. FACS는 버퍼 1 ML에 세포 인구를 준비하고 1 X 10 6 세포 / ml로 셀을 조정합니다.
  3. 35 μm의 셀 스트레이너 캡 튜브를 통해 세포 샘플을 전달합니다.
  4. 셀 정렬하기 전에 얼음에 튜브를 저장합니다.

96 - 웰 플레이트의 각 웰에 FACS 정제 된 단일 셀의 3. 용해

  1. 숙련 된 운전자와 셀 분류기에 EGFP 양성 세포의 샘플을 정렬합니다. 96 - 웰 PCR 플레이트에 하나의 세포 Lysis/DNase1 솔루션으로 단일 셀을 넣습니다. 필요한 경우, 구샘플 6 - 웰 플레이트 한 달 미만 -80 ° C 냉동고에 저장 ....

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결과

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효율적이고 강력한 단일 세포의 RNA 증폭

인간 배아 줄기 세포 사이의 전사 변화를 최소화하기 위해, 우리는 OCT4을 사용 :: FACS 정화용 EGFP hESC의 클론. 96 - 웰 플레이트에 OCT4 :: EGFP 양성 세포를 선별 한 후, 각 세포는 용해 버퍼에 용해하고 SMA-T15 (GACATGTATCCGGATGTTTTTTTTTTTTTTTT) 프라이머를 사용하고 SMA-A (ACATGTATCCGGATGTGGG로 고정 된 전체 길이의 cDNA에 폴리 (A) + RNA를 변환 ) SMART 템플릿 스위칭 기술을 사용함으로써. 과량의 올리고 뉴클레오티드는 다음 SMA-P2 (GACATGTATCCGGATGT) 13의 cDNA의 PCR 증폭의 18-20 회 반복, ExoSAP-IT 시약으로 분해 하였다. 우리는 QRT-PCR에 대한 템플릿 (그림 1)

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토론

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단일 세포 유전자 프로파일은 단일 세포의 기능이나 전체 인구를 예측할 수있는 중요한 도구가 될 수 있습니다. 기술적 인 제한으로 전체 유전자 프로파일 분석은 인구의 평균으로 제한하고있다. 유전자 발현 패턴 및 개별 세포 모집단 사이 수준의 변화는 잘못된 해석을 일으키는 것으로 제안되어왔다. 이러한 다양한 셀룰러 양태는 인간 배아 줄기 세포에서 발견 될 수 있고, 그들의 이질성 능성 운명 특정 처리를 유지하기위한 미묘한 차이를 유발 능력.

우리가 개발 한 개별 세포의 유전자 발현 연구를 위해 간단하지만 강력한 방법을 제공한다 단세포 정량적 RT-PCR에 대해 검증. 우리의 프로토콜의 유효성을 검사하려면, FACS 정제 된 단일 세포의 용해 액은 절반으로 나누어 정확도를 확인하기 위해이 방법을 적용 하였다. 하나의 세포와 우리의 결과는 희석 한 총 RNA 샘플을 뒷받침하고, 우리는 일관된 결과 B 발견etween 세포 용 해물의 각 반 (그림 4)........

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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우리는 원고에 대한 가치있는 토론을위한 이명박 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이명박 실험실에서 작업 세포 연구 기금 (TEDCO를) 줄기 뉴욕 줄기 세포 재단의 로버트슨 조사자 포상에서 메릴랜드에서 교부금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
96웰 PCR 플레이트USA Scientific1402-8900
Ambion 세포 용해 키트Life Technologies4458235
SMARTScribe 역전사 효소Clonetech639536
ExoSAP-ITUSB78200
Platinum Taq DNA 중합효소 고충실Invitrogen11304
10mM dNTP 믹스, PCR 등급Invitrogen18427
SYBR Universal 2X Master MixKapa biosystemKR0389
AccutaseInnovative Cell TechS-1100-1
FACS 버퍼45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 μ l DNase, 필터 살균
35 μ m 세포 스트레이너 캡 튜브BD Biosciences352235
도

참고문헌

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  1. Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
  2. Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generi....

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재인쇄 및 허가

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qRT PCROCT4 EGFP

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