전체 피부 결함 모델은 생체의 혈관 신생을 평가하기 생체

요약

혈관은 성공적인 조직 공학의 접근 방법의 핵심입니다. 따라서, 신뢰성있는 기술은 조직 구조에서의 혈관 망의 발달을 평가하기 위해 필요하다. 여기서 우리는 시각화 및 생체 내에서 혈관 생성을 정량화하기 위해 간단하고 비용 효율적인 방법을 제시한다.

초록

불충분 한 혈관이 조직 공학적 구조물의 임상 성공을 제한하는 주요 요인들 중 하나로 간주된다. 혈관 생성을 향상을 목표로 새로운 전략을 평가하기 위해, 신뢰할 수있는 방법을 보이는 바이오 인공 지지체에 새로운 혈관의 성장을 확인하고 그 결과를 정량화하기 위해 요구된다. 지난 몇 년 동안, 우리 그룹은 transillumination에 의해 혈관의 직접적인 시각화를 가능하게하고 디지털 분할을 통해 정량의 가능성을 제공하는 전체 피부 결함 모델을 출시했다. 이 모델에서, 하나는 수술 마우스의 뒷면에 전체 피부 결함을 생성하고 테스트를 재료로 대체합니다. 분자 또는 관심의 세포는 또한 잠재적 인 효과를 연구하기 위해 이러한 물질에 통합 할 수 있습니다. 자신의 선택의 관측 시간 후, 재료는 평가를 위해 외식된다. 양자 상처 번째 내부 비교하기의 가능성을 제공한다연구에 필요한 동물의 수를 감소뿐만 아니라 개인간 아티팩트를 최소화한다. 다른 방법에 비해, 우리의 방법은 간단, 신뢰성과 비용 효과 분석을 제공합니다. 우리는 다른 생체 물질과 생체 인증 방식의 혈관 테스트시 고해상도의 스크리닝을 수행하는 루틴 도구로이 모델을 구현 하였다.

서론

최근 수십 년 동안 조직 공학은 신체의 자신의 세포 ^하나와 조직 결함을 대체하는 새로운 치료 옵션을 열었다. 조직 재생의 생리 학적 과정을 지원하기 위해, 지지체는 상처 침대에서 세포가 성장하고 결함 ^2,3 복원 할 시나리오를 제공 생분해 구조로 설계된다.

불충분 한 혈관은 bioartificial 지지체 ^(4)의 임상 돌파구를 다시 보유하고있는 주요 장애물로 간주됩니다. 세포의 증식과 함께, 영양소 및 산소의 증가 및 혈관 신생의 재료에 대한 요구가 중요하게된다. 부족 또는 지연 혈관 따라서 조직 공학 제품 ^(5)의 중앙 괴사로 이어질 수 있습니다. 또한, 혈관 면역 적격 세포를 제공하고 회생 영역에서 대사 잔류 물을 제거. 높은 감염률과 낮은 재생은 아르목표로 조직 공학에서 관찰 부족한 혈액 관류의 결과의 일부는 발판 ^6,7의 혈관을 증가시켜 막을 수 있습니다.

생체 재료 자체와 지지체의 미세 혈관 형성에 중요한 역할 초점 향상을 목표로 여러 전략. ^8,9을 복원하기 때문에 (재), 재생하여 수리에서 치유 과정 시프트 하나에 가까운 특성을 갖는 생리 조직을 생성하는 새로운 방법을 개발하기 위해 집중적 인 연구 노력들이있다. 자신의 회생 가능성에 관해서 공부하고 평가 하였다 생체 적합 물질은 콜라겐, 섬유소, 키토산, 알긴산 ^{(10, 11)를} 포함했다. 이러한 생체 재료를 사용하고 티슈 탈세 포화, 자기 조립, 조형 등 다양한 전략을 사용하는 새로운 발판을 구축하고 ¹² 전기 방사를위한 백본으로서 결합 될 수있다. ENH 위해서는신체의 자신의 재생 능력 ANCE, 비계는 bioactivated 할 수 있습니다. 재조합 혈관 성장의 혼입 등의 요소 ⁽¹⁴⁾ 또는 ^(13)에 대해 코딩하는 유전자 벡터는 지지체의 혈관을 개선 요인을 보여 주었다. 줄기 세포의 사용은 널리 간엽 기질 세포 및 내피 전구 세포가 가장 ^관심을 얻고있다 ^15,16 혈관을 개선하기 위해 유망한 전략으로 밝혀졌다. 다른 방법은 이식 ^{17 일} 이전 조립식 용기를 포함하는 네트워크 구조를 구축하기 위해 시도한다. 집중 지지체 디자인 노력과 그들의 생체 활성에도 불구하고, 어떤 전략이 대규모 화상 상처의 피부 대체를 제외하고, 임상 적으로 상당한 수준에서 혈관 생성을 향상하지 않고 있으며, 임상 루틴으로 생체 공학 재료의 번역은 주저 ^{18 일어나는} .

그 이유 중 하나는 혈관 이유인공 조직 구성체, 여전히 미해결 문제이며 생체 내 접근법에서 새로운 기술의 성공 여부를 평가하기 곤란하다. 시험 관내 실험은 비계의 혈관 전위의 중요한 식견을 제공 할 수도 있지만, 적절한 동물 모델은 이러한 재료의 생체 적합성, 특히 중요한 안전성 및 효능을 치료하고, 조직의 혈관 형성과 같은 주요 파라미터를 연구해야 구성. 따라서 신뢰할 수있는 도구를 시각화하고 혈관 네트워크를 생체 내에서 필수적인을 정량화한다.

본 연구에서 우리는 외식 지지체 내부의 혈관 네트워크 시각화 및 정량화를 허용 간단하고 신뢰할 수있는 방법을 제시한다. 이 방법은 조직 transillumination 디지털 분할에 기초한다. 이 방법은 비 침습적이기 때문에, 타겟 재료의 상기 분자 및 조직 학적 분석을 허용한다.

프로토콜

비계의 1 준비

1. 12mm 생검 펀치를 사용하여 지지체의 샘플을 생성한다.
2. , 비계에 생리 활성 분자 또는 세포를 소개 부드럽게 멸균 거즈로 압박하여 발판을 배출합니다. 이어서 생체 활성 분자 또는 관심 세포를 포함하는 용액 160 μl를 첨가하여 지지체를 재수. 두 번 확인 등 MTT 분석 실험 등의 대사 분석을 통해 세포 생리 활성의 성공을.
3. 필요한 경우 단계 120에서 설명한 바와 같이, 재수 통해 다시 피브린 트롬빈 용액 또는 하이드로 겔, 예를 들면, 그들에 의해 전달 된 화합물 또는 세포가 지지체 내부 테스트 할 고정한다.
   참고 : 화합물 또는 세포가 기계적으로 재료에 부착하지 않는 경우이 단계가 도움이 될 수 있습니다. 하나는 화합물의 방출 동역학을 제어 할 수있다 ..
4. cuttin에 의해, 모든 실험 및 제어 그룹에서 각 발판 아래에 배치됩니다 titanized 메쉬를 준비g 밖으로 둥근 모양의 조각, 직경 약 14mm.
   참고 : titanized 메쉬 상처 침대에서 재생 조직을 구분하는 데 필요한 물리적 테두리로 작동합니다.

2 동물

1. 제시된 모델의 구현에 앞서, 해당 동물 보호법을 협의하고 지방 자치 단체의 허가를 얻을 수 있습니다. 이 작품에서 모든 실험은 현재 독일어 동물 복지 행위에 따라, 마우스로 수행하고 어퍼 바바리아의 지방 정부 (Regierung 폰 Oberbayern)에 의해 승인했다.
2. 조심스럽게 동물과 변형을 선택합니다. 생쥐 모델이 확립되었다 아니지만, 예컨대 래트, 토끼, 돼지 또는 다른 동물에 공통으로 번역 될 수있다.
3. 당신이 모피 동물로 작업하는 경우, 비계의 주입하기 전에 동물의 뒷면을 면도.
   참고 :이 작품은 20g과 25g, 그러나 다른 연령대와 b 사이의 체중과 나이 6~8주의 마우스를 사용로디 가중치가 또한 사용될 수있다.

3 마취

1. 멸균 조건 하에서 작업을 수행. 동물의 정상 체온을 유지하기 위해, 온난화 매트를 사용한다.
2. 마취를 inhalative에 앞서 동물 / kg 체중 0.05-0.1 ㎎, 피하마다 8 시간의 용량으로 Buprenorphin을받을 수 있습니다.
3. inhalative 마취 (아이소 플루 란)에서 동물을 배치 또는 이에 상응하는 표준 절차를 적용 할 수 있습니다. 부드럽게 동물의 발가락을 압박하거나 피부 핀치를 통해 하나 마취를 확인합니다.
4. , exsiccosis 방지 동작의 시작 부분에 0.5 ㎖의 생리 식염수를 피하 주사한다.

피부의 절제 (4)

1. 발생하기 쉬운 위치에 동물을 배치하고 앞쪽 끝이가는 영구 펜 (그림 1A)와 마우스의 뒷면의 중간 선을 표시합니다.
2. 절제 영역을 정의합니다. Figu에 표시된 영역에서 결함을 배치1C를 다시. 결함이 너무 하방 배치하는 경우, 동물 드레싱 및 비계를 제거하는 것이 더 경향이 있습니다.
3. 10mm 생검 펀치 (그림 1B)를 사용하여 양자의 결함 라운드 만듭니다. 펀치는 신중하게 피부에 대해 강제해야하며, 피부를 통해 완전히 잘라하지만 절제 영역 (그림 1C 및 1E)를 묘사하는 데 사용할 수 없습니다.
4. 부드럽게 집게로 표시된 피부를 들어 올려 미세 수술 가위 (그림 1 층)를 사용하여 표시된 원을 따라 절개. 출혈의 경우, 신중하게 멸균 거즈로 압축합니다. 절제의 단계별 설명은 그림 1에 나타나있다.
   NOTE : 결함 인해 피부 탄력에 결함의 확대를 보상하기 위해, 발판을 생성 한 것보다 더 작은 펀치로 생성된다.

5 비계 주입

1. TITA위한 공간을 만들기 위해을 인정했다가, 메쉬 2-4밀리미터 (그림 2A)에 대한 상처 국경에서 피부와 하부 조직의 분리를 확장 할 수 있습니다.
2. 직접 상처 침대에 상처 가장자리 (그림 2A & B)에서 결함에 메쉬 titanized를 놓습니다.
3. 장소는 직접 메쉬를 통해 비계.
4. 약간 비계 (그림 2C)를 통해 가장자리를 떠나, 4-6 단일 노트와 인접한 상처 가장자리에 발판을 봉합.
   참고 : 생분해 성 봉합사의 사용을 피하십시오.
5. 상처 면적 (도 2d)의 모니터링을 허용하는 동시에 발판을 보호하기 위해 상기 결함 드레싱 투명 상처 봉합.

(6) 수술 후 케어

1. 드레싱과 비계의 상호 조작을 막아 케이지 당 하나의 마우스를 보관하십시오.
2. 관찰 모터 활동, 체중, 고통의 징후, 공차에 의해 매일 동물의 상태를 평가하기 일반드레싱 및 자동 절단한다. 또한 출혈, 로컬 및 감염의 전신 징후와 드레싱 위치 대 상처 영역을 감시한다.
3. 동물의 통증을 최소화하기 위해, 0.05-0.1 ㎎ / ㎏ (체중) 또는 동등한 진통제 약물의 투여 량은 매일 Buprenorphin 주입.
4. 마우스가 상처 드레싱을 제거하거나 손상되면 교체하거나 마취를 다시 연결합니다.

비계의 7 안락사 및 적출

1. 원하는 시점에서, 펜토 바르 비탈 (150 ㎎ / ㎏)에 의해 과량의 동물을 희생.
2. 비계 가능 (그림 3A)로 다시 마우스 피부의 정도를 포함해야 영구 마커, 피부 절제의 사이트를 표시합니다.
3. 가위 또는 메스 쌍 표시된 선을 따라 피부를 절개. (무딘 준비를 통해 하부 조직에서 인터넷을 발판과 titanized 메시를 포함하여 전체 피부를 분리gure 3B).
4. 페트리 접시에 펼쳐 외식 조직을 배치 (그림 3C와 D)

혈관 네트워크의 8 시각화 및 정량화

1. Transillumination :
   1. 흰색 빛 (100 와트 전구 표준)의 강한 소스 위의 페트리 접시를 장착하여, transillumination 장치를 설정합니다.
   2. 디지털 사진을 얻기 위해 트랜스 일루미네이터 위의 디지털 카메라를 고정합니다.
   3. 거꾸로 transillumination 장치를 통해 페트리 접시에 샘플을 놓습니다.
   4. 정상적인 피부의 동일한 크기의 영역뿐만 아니라 매크로 모드에서 완전한 비계의 사진을 촬영합니다. 또한 디지털 분석을 위해 TIFF 형식으로 이미지를 저장합니다.
   5. 또한 생화학 적 또는 조직 학적 분석을위한 조직을 저장합니다.
2. 디지털 분할 및 정량화 :
   1. FR을 얻을 수있다 VesSeg - 도구 소프트웨어를 다운로드하여 설치:에서 충전 EE http://www.isip.uni-luebeck.de/index.php?id=150&L=2%255 .
   2. VesSeg - 도구 소프트웨어를 사용하여 사진을 엽니 다.
   3. 디지털 분석 (선택 → 이미지)를위한 발판이 적용 이미지의 영역을 선택합니다.
   4. 옵션 "히스테리시스 임계 값"(계산 용기 향상 → 탑 햇 변환 → 이미지 → 선박 향상 필터 → 히스테리시스 임계 값)를 사용하여 선박의 명암을 증가합니다.
   5. 용기지도 (이미지 → 선박 향상 필터 → 히스테리시스 임계 값의 → 임계 테두리)의 분할을 진행합니다. 제 1 임계 값 ( "선박 보험"), 그래서 심지어 원격으로 혈관처럼 모든 픽셀이, 용기가 부착되어 있습니다를 선택합니다. 특히 용기와 같은 용기가 부착되어 있습니다들만 픽셀을 초 임계 ( "배경의 범위를")를 선택합니다.
   6. 비 캡처 한 선박을 추가하고 일반적으로 머리카락이나 봉합 길고 얇은 혈관과 같은 구조 인 일반적인 위양성 구조를 제거하기 위해 수동으로 자동 분할 제안을 확인합니다.
   7. 선박의 길이와 (이진 이미지 통계 → 이미지 → 이미지 통계) 선박에 의해 커버되는 전체 영역을 계산합니다.
      NOTE : 혈관 길이의 계산을 위해, 생성 된 혈관의 혈관 맵 1 화소 ^(20)의 폭과 라인 박형화된다.
3. 기본 조직에 100 %의 값을 할당하는 발판과 같은 파라미터에 따라 고유의 피부 영역을 분석하여 그 값을 지지체에 관한 것이다. 흰색 픽셀의 비율이 정상 조직에서 60 %와 30 % 지지체의 경우 예를 들어, 상기 지지체의 50 %의 혈관 신생을 나타낼 것이다. 참고 : 흰색 용기 적용 범위가 발판 주위에 사각형의 영역에 할당됩니다. 흰색 픽셀 커버리지 consi의 수를 조정원의 면적은 평방 (4 ×의 R ^2)보다 훨씬 작은 (π의 X의 R ^2)입니다 디링.

결과

신뢰할 수있는 양자 간 전체 피부 결함은 피부 연구 (그림 2)에서 생체 재료로 대체 될 수있다 마우스 (그림 1)에서 생성 할 수 있습니다. 여기에서, 더 큰 합병증은 감염이나 이물 반응,도 거시적 징후 중 또는 수술 시술 후 관찰되지 않습니다. 마우스를 제거 할 때 드문 경우에, 비계가 손실됩니다. 상처 수축 (그림 3) 관찰되지 않았다. 조직 transillumination는 모두 기본 조직과 이식 비계 (그림 4)를 포함 전체 조직 샘플에서, 폭 최대 30 μm의 혈관 구조의 명확한 시각화를 허용했다. 원하는 시간 주입을 게시에 디지털 분할 한 후, 혈관을 쉽게 정량화 할 수있다. 예를 들어, 이주 주입 한 후, 62.28 ± 8.6 %의 혈관 수준이 관찰되었다 (평균의 표준 오차 ± 의미, N = 8) ^21. 전체적으로 약 25 분 &# 160; 동물 당 (2 비계)가 이...

토론

생체 물질 내에 혈관 과정을 연구하기위한 새로운 방법의 안정적인 발전을 요구 조직 공학적 구조에 혈류를 개선하는 방법을 성공적으로 확립 할 필요가있다. 생체 가시 골격 혈관을 만들기위한 일반적인 방법은 고해상도 도구를 제공 현미경의 사용을 포함한다. 대부분의 경우에, 그러나,이 방법은 작은 조직 영역의 분석에 제한되고 비용과 시간이 걸리는 경향이있다. 또한, 종종 혈액 관류 혈관 비 기능들 ^{(22)로부터} 구별 될 수없는 정교한 라벨 및 염색 방법을 포함한다. 사용 방법은 혈관의 기능을 컴퓨터 단층 촬영, 자기 공명 영상 및 양전자 단층 촬영되어 전자 평가한다. 이러한 방법은 매우 고가의 장비 및 저해상도 전원 ^(23)의 단점을 가지고있다. 혈관을 시각화하기 위해 일반적으로 사용되는 또 다른 전략은혈관의 사용은 조직 ^(24)의 화학적 부식 다음 캐스트. 이 방법은 혈관 네트워크의 대표적인 3D 구조를 획득하는 것을 가능하게하지만, 결과는 강하게 인공 관류...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0	Ethicon, Norderstedt, Germany	698G	Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting 봉합사
생검 펀치 (10 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1050
생검 펀치 (12 mm)	Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA	P1250
디지털 카메라	Ricoh, 하노버, 독일	Cx1
Gazin Mullkompresse	Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany	13622	멸균 거즈 (10 cm x 10 cm)
이중 레이어 콜라겐 기반 스캐폴드 (8' x 10')	Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA	88101
Isoflurane, 흡입 마취용 액체 가스	Baxter, Unterschleissheim, 독일	100196040
Pentobarbital, 16 g / 100 ml	Fa. Merial, Hallbergmoos
Nuri Nu/Nu Nude 마우스, CrLNU-Foxn1nu	Charles River, Sulzfeld, Germany	스트레인 코드 088	Athymic 누드 마우스, 생후 6주에서 8주령이며 체중이 20에서 25 g 사이입니다.
부프레노르핀 (0.3 mg/ml)	Essex Pharma GmbH, 뮌헨, 독일
티탄화 메쉬 (15 cm x 15 cm), 초경량	PFM Medical AG, Kö ln, 독일	6000029
Tissucol Duo S Immuno 2 ml	Baxter Germany GmbH, Unterschleiß 독일 하임	B1332020110614	피브린-트롬빈 솔루션
투명 접착 드레이프(30.5cm x 26cm)	KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK	M6275009/10