방법 논문

발작과 같은 활동을 분석하고 운동을위한 저가의 방법 초파리

DOI:

10.3791/51460

⸱

2014년 2월 19일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, Franciscan University of Steubenville, 2Department of Computer Science, Franciscan University of Steubenville

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

무료로 제공하고 저렴 소프트웨어 프로그램의 웹캠과 조합하여, 초파리 melanogaster의 기관차 패턴은 속도, 거리, 다양한 모터 활동의 시간의 차이를 검출하기 위해 분석 될 수있다.

초록

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비디오 추적 시스템은 초파리의 움직임을 분석하고 기관차 행동에 여러가지 이상을 검출하기 위해 널리 사용되어왔다. 이러한 시스템은 행동 풍부한 정보를 제공 할 수 있지만,이 시스템의 비용과 복잡성은 많은 실험실에 금지 될 수 있습니다. 우리는 D. melanogaster의 기관차 행동과 발작의 움직임을 측정하기위한 저가의 분석을 개발했습니다. 시스템이 거리를 이동 추적하는 저렴하고 자유 소프트웨어의 조합을 사용하여 처리 할 수​​있는 이미지를 캡처하는 웹 캠을 사용하여, 지정된 시간 기간 동안 움직임과 움직임의 지속 기간의 평균 속도. 이 시스템의 유용성을 입증하기 위해, 우리는 D.의 그룹이 3 ~ 10 배 더 민감 발작과 같은 활동 (SLA) 야생형 파리보다 돌연변이, 방에 민감한 (BS) 중풍 병자를 melanogaster의 조사. 이 새로운 시스템을 사용하여, 우리는 감지 할 수 있었다 BS mutanT 강타 무감각 (BSS)은 야생형 파리보다 새로운 환경에서 탐구 운동의 낮은 수준을 나타낸다. 또한, 시스템은 일반적으로 타입 II 당뇨병을 치료하는 데 사용되는 약물은 메트포민, BS 돌연변이의 SLA의 강도를 감소 시킨다는 것을 확인 하였다.

서론

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짧은 수명 및 사용할 수있는 강력한 유전자 도구를 감안할 때, 초파리는 각종 질병의 원인 및 다양한 생물학적 과정의 기본 생리를 조사를위한 훌륭한 모델 시스템입니다. 많은 경우에, 그것은, 행동 또는 약리 유전 조작이 모델 생물 1,2 운동력에 미치는 효과를 측정하는 것이 유리하다.

일반적으로 이차원 3-7 플라이 움직임을 측정하기 위해 사용되는 다양한 방법이있다. 이 시스템은 동시에 여러 파리의 추적을 지원할 수와 속도, 레코드 경로의 길이를 측정하고 비행 이동 소요 시간의 백분율을 기록 할 수 있습니다. 그들은 운동 및 비행 이동 6-9의 성적으로 동종 이형의 성격에 약물의 효과를 포함하여 다양한 상황에서의 움직임을 연구하는 데 사용되었습니다. 이러한 시스템의 주요 단점은 추적 SYS의 비용이다TEM 또는 해당 소프트웨어와 카메라. 경우에 따라이 달러의 수천에서 실행할 수 있습니다. 비용은 새롭게 절연 돌연변이의 이동성 패턴을 정량화, 예를 들면, 이러한 시스템의 제한된 사용을 필요 랩위한 특정 관심사이다.

간단하지만 덜 강력한 방법은 레코드 운동 플라이가 폐쇄 관 10,11의 중간에 배치되어 외광의 빔 경로를 횡단하는 횟수에 기초하여 시스템을 사용하는 것이다. 이러한 시스템은 운동과 수면 각성주기에 대한 가치있는 정보를 제공 할 수 있지만, 그들은 그들이 비행의 실제 경로를 캡처로 장애 조치 또는 추정의 움직임에 따라 수 있기 때문이다. 추가 고해상도의 방법이 이러한 제한 12를 시도하고 회피하는 데 사용되었습니다 있지만, 예를 들어, 관의 끝에서 상당한 움직임을 전시 파리가 낮은 운동을 등록합니다 항공사.

간단하고 저렴 여전히 geotaxi를 측정하는 장치를 등반하는의, 하나의 튜브 또는 튜브를 2,13의 시리즈를 통해 파리의 상향 이동. 이러한 시스템은 저렴하고 쉽게 geotaxis 결함을 식별 할 수 있지만, 그들은 조사자가 관심을 가질 것 운동의 많은 다른 양상을 캡처하지 못한다.

많은 실험실 - 설치와 사용하는 것은 D. melanogaster의 균주의 행동 차이를 특성화 유익한 도구가 될 것입니다 간단한 저가의 강력한 분석 시스템하십시오. 여기에서 우리는 채 2 백 달러를위한 설정하고 파리의 이동 경로, 속도 및 시간에 대한 정보를 제공 할 수있는 할 수있는 분석을 설명합니다. 분석의 효능을 입증하기 위해, 우리는 그것을 식별하는 데 사용 될 수 있다는 것을 보여주는 데이터를 제시, 발작과 약물 메트포르민의 2) 능력에 취약 방에 민감한 (BS) 돌연변이는 1) 전위의 결함이있는 일반적 발작 같은 활성 (SLA) I의 강도를 줄이기 위해, II 형 당뇨병을 치료하는 데 사용N 개의 BS 돌연변이.

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프로토콜

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1. 개인의 준비 운동력 분석을 위해 파리

  1. 전송 부드럽게 각각의 빈 병을 활용하고면 마개를 가진 유리 병 캡에 의해 파리. 파리가 관찰되기 전에 그대로 20 ~ 30 분을 앉아 할 수 있습니다. 그것은 이전의 연구는 unanesthetized 파리 (14)에 비해 마취 노출이 동작을 변경할 수 있습니다 것처럼 이전의 행동 관찰에 시간 내에 파리를 마취하지하는 것이 중요합니다.
  2. 부드럽게 유리 병 밖으로 비행을 눌러 공기 통로를 허용하는 작은 슬릿 (5 밀리 높이) 5 cm 직경 페트리 접시 덮개 아래에 각각의 파리를 놓습니다. 아래에서 조명하고 페트리 접시 위에 장착 된 웹캠을 사용하여 파리를 관찰합니다.

2. 개인의 준비 발작 분석에 파리

  1. 이틀 이전 발작에 민감한 파리를 피드 표준 효모 / 옥수수 가루 / 한천 미디어 또는 표준 용지 중 하나는 약물과 직접 혼합. 데이터가 여기에 제시된 내용은, 파리는 1 합 하나를 공급했다표준 용지 또는 메트포르민의 25 MG와 혼합 표준 용지 1 g의 F.
  2. 파리는 각각의 빈 유리 병에 부드러운 터치하여이를 전송하고면 마개를 가진 작은 유리 병 모자, 미디어 또는 미디어 플러스 약물에 이틀 동안 공급 한 후. 파리가 관찰하기 전에 20 분 동안 그대로 앉아 할 수 있습니다. 그것은 이전의 연구는 unanesthetized 파리 (14)에 비해 마취 노출이 동작을 변경할 수 있습니다 것처럼 이전의 행동 관찰에 시간 내에 파리를 마취하지하는 것이 중요합니다.
  3. 10 초 동안 가장 높은 설정을 사용하여 실험실 vortexer를에 하나의 비행을 포함 소용돌이 개인 병. 직접 종이 위에 장착 된 웹캠 아래 종이의 빈 흰색 시트에 고정 된 비행을 놓습니다.

3. 비디오 녹화

  1. HandyAvi 소프트웨어 프로그램을 사용하여 이동 또는 SLA 기록 http://www.azcendant.com/download.htm을 . 이 프로그램에 웹캠을 사용하여사용자 설정에 기초하여 이미지를 캡처.
  2. 캡처 탭에서 시간 경과 이미지 옵션 창이 열리면 캡처 장치와 웹캠을 선택을 선택합니다. 대부분의 실험을 위해 640 × 480의 비디오 프레임 크기가 적합합니다.
  3. 압축 인텔 IYUV 코덱을 선택하고 발작 분석 0.1 초 / 프레임을 선택하거나 이동 분석에 대한 0.1 ~ 0.5 초 / 프레임을 선택합니다. 고급 탭에서 각 캡처. BMP 이미지 파일 작성을 선택하고 (이미지 스택)가 소요 이미지를 저장하는 프로그램의 폴더를 선택합니다.
  4. 종이 시트에 죽은 파리를 놓습니다. 비디오 설정 상자를 클릭하고 밝은 흰색 배경 및 어두운 비행과 명확한 대조가되도록 장치 설정 탭에서 설정을 조정합니다.
  5. 녹음을 시작하려면 시작 버튼을 클릭합니다. 기록 기간이 끝나면 정지 버튼을 클릭합니다. 이미지 스택은 현재 선택한 폴더에 있어야합니다. 참고 : 녹화를 시작하기 전에 확인하는 FOL이미지 스택을 선택 데르가 비어 있습니다.

4. ImageJ에 사용 데이터 분석

  1. 에서 다운로드 할 수 있습니다 오픈 NIH의 무료 이미지 처리 소프트웨어 ImageJ에, http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html . 참고 : 프로그램을 다운로드 외에도 Multitracker 플러그인이 다운로드 및에 나타낸 바와 같이 설치되어야 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html .
  2. 파일 탭을 클릭 한 다음 가져 오기 → 이미지 시퀀스를 선택하여 ImageJ에로 이미지 스택을 가져옵니다.
    1. 이미지 스택이 포함 된 폴더를 선택하고 이미지 중 하나를 선택하고 열기를 선택합니다. 순서 옵션 대화 상자가 열립니다. 숫자 정렬 이름을 클릭 한 다음 확인을 선택하여 이미지 스택은 ImageJ에에로드됩니다.
  3. 임계 모든 이미지 각 플라이가되는 흰색 배경으로 구성되도록검은 점으로 변환. 이 프로세스를 시작하기 전에 이미지 탭에서 유형 → 8 비트를 선택하여 8 비트 형식으로 이미지를 변환 할 수 있습니다.
    1. 다시 이미지 탭을 클릭 → 임계 값을 조정을 선택합니다. 이 임계 값 포인트 조정할 수 있습니다 차단하는 임계 값 대화 상자가 열립니다.
    2. 슬라이스 검은 점이 부족한 경우이 여분의 검은 점 또는 있는지 확인하기 위해 이미지를 스캔합니다. 이 경우, 문제를 완화하기 위해 임계 값을 조정한다. 일반적으로 임계 값은 적절한 값으로 프로그램 기본값으로 조정할 필요가 없습니다.
      참고 : 스택의 모든 슬라이드가 비행의 위치를​​ 나타내는 하나의 검은 점이 있어야합니다.
    3. 임계 값 대화 상자에서 적용을 선택하고 대화 상자에 마스크를 변환 열립니다. 옵션을 클릭하기 만하면 임계 값에 OK 이미지 스택을 클릭하지 마십시오.
  4. 이미지 스택을 임계 화 한 후, 선택 Multitracker 플러그인 플러그인 탭 아래에 순서대로픽셀 파리의 움직임을 측정합니다. 개체 추적기 대화 상자가 나타납니다.
    1. 대화 상자에 나와있는 네 가지 옵션을 모두 클릭 한 다음 확인을 선택합니다. Multitracker 플러그인은 다음 각 조각의 검은 점에 좌표를 연결하고 결과 창뿐만 아니라 픽셀의 전체 경로 길이의이 나열됩니다. 경로 창은 비행했다 경로의 그래픽 디스플레이를 제공합니다.
    2. 결과 창에서 x 및 y 좌표 목록을 복사 Excel 스프레드 시트에 데이터를 붙여 넣습니다. 스택의 모든 슬라이드가있는 검은 점이이없는 경우, Multitracker 프로그램은 해당 슬라이드에서 중지됩니다. 이 경우, 그것은 보장하기 위해 8.4과 재 임계 스택 단계로 돌아갈 필요하다는 문제 슬라이드 흑점 등 플라이 레지스터.
  5. 공백의 흰색 종이에 일cm 이격 된 두 점의 별도의 이미지를 촬영, 경로는 cm로 픽셀에서 길이로 변환하기 위해.
    1. 위의 사항을 따르십시오단계 (3.1-4.4.2)를 결정하는 X, Y, 픽셀은 두 개의 점 좌표와 cm에 대응하는 화소의 수를 결정하기 위해이 정보를 사용한다. 이 변환율은 cm의 움직임 데이터를 생성하는 5 단계에서 사용된다. 참고 :이 작업이 완료되면, 그것은 이후의 모든 기록 고정 카메라를 유지하는 것이 중요합니다. 카메라가 이동되거나 조정될 때마다, 하나는 cm로 픽셀을 변환하는이 단계를 반복 할 필요가있다.
    2. 상체 위치 및 광 강도 / 반사에 약간의 변동이 이미지를 임계 화 때 생성되는 블랙 도트의 크기와 중심에 영향을 미칠 것이기 때문에 Multitracker 플러그에 의해 생성 된 경로 길이는 움직임을 과대. 이 잡음은 플라이 운동의 정확한 추정을 얻기 위해서 제거되어야한다.

5. Excel을 사용하여 데이터 분석

  1. X의 시리즈를 수입하여 기록 된 데이터에서 노이즈를 제거, Y는 Multitracker 홍보에 의해 생성 된 좌표비행 분석, 저자에 의해 만들어진 엑셀 VBA 프로그램에 ogram. (이 프로그램은 저자에게 연락하여 무료 지원을받을 수 있습니다.)
  2. 클릭 저에게 버튼을 클릭하고 임계 값 차단을 선택합니다. SLA 분석 0.5 cm / sec의 임계 값을 선택하거나 이동 분석 0.1-0.3 cm / 초 사이의 값을 선택한다. 확인을 클릭하고 프로그램은 속도, 시간 및 이동 거리를 계산합니다. 주 :이 프로그램은 순차적 0.5-1.0 초 빈들의 데이터를 평가하는 슬라이딩 윈도우를 사용하여 분석하고 그 윈도우 중에 속도를 계산한다. 사용자 정의 차단 아무 이상이 비행 이동으로 처리됩니다.

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결과

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여기에 설명 된 기술은 초파리 BS 돌연변이 1 SLA의 차이를 분석하기 이전에 사용되었다. 여기에 제시된 결과는 쉽게 충격을 BS 균주 (EAS), 강타 무감각 (BSS) 및 기술 녹아웃 (망가)를 포함한다. EAS 궤적은 포스파티딜 에탄올 아민의 합성 (15)에 관여 에탄올 키나제를 인코딩하고 망가 궤적은 미토콘드리아 riboprotein (16)를 인코딩합니다. BSS 돌연변이는 마비 (파라) 전압 문 나트륨 채널 (17)의 대립이다. 본 연구에서 사용 된 대립 유전자는 EAS 한, BSS 1 및 망가 25t되었습니다.

SLA를 측정하는 방법의 효능 션 하나에 비해 발작 EAS 민감한 제어 비...

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토론

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초파리 전위 또는 움직임 패턴을 검사 할 때, 이동 한 거리에 관한 정보, 움직임의 속도 및 이동 패턴을 추출 할 수있는 유용하다. 이러한 정보를 추출하기 위해, 고가의 장비는 전통적 종종 드물게 4,8,9 같은 분석법을 사용하고자 작은 실험실 또는 실험실에 대한 금지입니다 사용되어왔다.

여기에 설명 된 분석은 거리 (그림 2와 그림 6) 운동, 속도 여행을 결정하는 데 사용 (그림 4, 7) 수 채 2 백 달러를 비용 운동 (그림 1, 5)를 사용하여 장비 및 패턴 . 우리가 개발 한 엑셀 VBA 프로그램을 사용하여, X의 시리즈는, Y는 ImageJ에 프로그램이 모든 정보를 추출하기 위해 분석 할 수 있습니다에 의해 생성 된 좌표. 이 시스템은이발작에 민감한 초파리 BS 돌연변이 1 SLA의 두 유전자 및 약물 ...

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공개 사항

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저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

감사의 글

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저자는 또한 미세 조정에 자신의 작품이 분석을 위해 크리스 버너, 스티븐 맥키 니, 로라 토빈, 제니 Gilbreath, 애슐리 Olley, 메간 호퍼, 그리고 메간 하이드에 대한 감사의 표현을하고 싶습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
웹캠LogitechPro900모든 품질의 웹캠으로 충분합니다.
HandiAVI 타임랩스 소프트웨어Azcendant 소프트웨어최신 버전은 http://www.azcendant.com/
ImageJNIH최신 버전은 http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Multiracker Plug-InNIH
에서 찾을 수 있습니다.Vortex Genie 2와 같은 대부분의 표준 크기 와류로 충분합니다.
5cm 페트리 접시 커버LabM LimitedD011더 작거나 더 큰 페트리 접시 커버는 운동 분석의 경기장에 사용할 수 있습니다.
라이트 박스맞춤형스크랩 재료로 제작되었습니다. 조명은 운동 분석에 사용됩니다. 실내 조명에 따라 라이트 박스 없이 분석을 수행할 수 있습니다. 
에서 찾을 수 있습니다. 에서 찾을 수 있습니다. 최신 버전은 http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/index.html Vortexer VWR Vortex Genie 2

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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