기본 마우스 조골 세포에서 골 세포 배양을 구하는 레티노 산의 적용

요약

레티노 산으로 기본 마우스 조골 세포의 치료는 골 세포의 형태 학적 및 분자 기능 베어링 분지 세포의 균일 한 인구를 생산하고 있습니다. 방법은 획득 및 배양 주 골 세포를 유지의 어려움을 극복하고, 형질 전환 모델 유래 세포를 연구하는 것이 유리할 수있다.

초록

골 세포 배양의 필요성은 잘 뼈 연구원의 지역 사회에 알려져있다; 기본 골 세포의 분리가 어렵고, 낮은 세포 수를 생산하고 있습니다. 따라서, 가장 광범위하게 사용되는 셀룰러 시스템은 골 세포 조의 MLO-Y4 세포주이다.

여기에서 설명하는 방법은 형태 학적 및 분자 골 세포의 기능과 분지 세포의 균일 한 인구를 생성하는 레티노 산의 사용을 말합니다.

쥐의 두개골로부터 골아 세포의 분리 후, 모든 - 트랜스 레티노 산 (ATRA)이 세포 배지에 첨가하고, 셀 모니터링 도립 현미경으로 매일 수행된다. 첫 번째 형태 학적 치료와 차별화 2 일 후에 탐지 가능하면 수상 돌기 세포 외 기질을 생산하는 능력의 손실, 조골 세포 마커의 다운 규제의 점진적 발전과 함께 5 일에서 일반적으로 완료까지 규제 골 세포 특정 분자의. 콘텐츠는 "> 일일 셀 모니터링 때문에 일차 세포의 고유 변동의 필요, 및 프로토콜은 상이한 마우스 균주로부터 얻어진 형질 전환 모델에 적용된 셀에 최소 변화에 적응 될 수있다.

방법은 수행하기 쉽고, 특수 장비를 필요로하지 않으며, 이는 높은 재현성으로, 급속 무제한 생물학적 응용을위한 이들 세포의 사용을 허용하는, 세포 외 기질의 완전한 부재 하에서 성숙한 골 세포 집단을 생성한다.

서론

골 세포, 가장 풍부한 뼈 세포 유형은 깊게 골격 내에있는 고도로 분지의 말단 분화 세포이다. 성숙한 골 세포의 세포체는 뼈 lacunae에 포함되는 다양한 형태를 가지고있다; 둥근 골 세포가 뼈 소주 ^1에서 더 자주 반면 신장 세포 기관과 골 세포는 대뇌 피질의 뼈에서 발견된다. 분지 수상 돌기는 다른 골 세포와, 또한 다른 뼈 세포 유형, 골수, 혈관과 관련된 혈관 주위 세포와뿐만 아니라 여러 연락처를 만드는 복잡한 웹을 형성, 눈물 소관이라는 작은 채널에서 세포체에서 연장 상주합니다. lacunae 및 소관에 함유 간질 유체를 통해, 골 세포는 그러므로 지역뿐만 아니라 전신적인 이벤트 및 그 반대의 동작은 로컬 및 전신의 변화 ^(2)에 의해 조절 될 수뿐만 아니라 영향을 미칠 수있다, 또한 궁극적으로 순환 시스템에 연결된다.

골 세포의 연구는 최근, 이러한 조직과 세포 고유의 형질 전환 동물의 발생, 강력한 현미경 기술과 높은 처리량 분자 스크리닝 ^3,4의 사용과 같은 몇 가지 기술적 진보, 덕분에 힘을 얻고있다. 그러나, 이들 세포의 기술은 주로 시험 관내 모델에서의 적절한 상대적 부족에 여전히 불완전하다. 사실, 골 세포로 인해 깊은 위치의 획득과 문화에 유....

프로토콜

모든 동물 실험은 국립 과학적인 목적을 위해 사용하고 검토와 밀라노 대학의 윤리위원회에 의해 승인 된 동물의 보호에 관한 유럽의 현재의 규정에 따라 수행되었다.

차 조골 세포의 1. 격리

상기 방법은, 사소한 수정으로, Dodig 등 ^(14)에 의해 기술 된 절차를 따른다.

1. 0.1 % 콜라게나 제 P와 0.05 %를 추가하여, 매체를 소화 준비 HBSS 매체 (행크스 균형 소금 솔루션, 아니 칼슘, 마그네슘, 또는 페놀 레드)에 (2.5 % 트립신 10 배, 아니 페놀 레드에서 시작) 트립신.
2. 3~4일 이전 마우스를 사용하여 (절차 1 마우스 적은에 적용될 수있다.)
3. 잘린 희생. 70 % 에탄올로 머리를 살포하고 얼음에 보관. 핀셋과 해부 / 외과 가위로 피부와 근육 층을 제거합니다.
4. 부드럽게 정수리 뼈를 제거하고두 반쪽의 시상 봉합에 따라 구분합니다. 반드시 뼈를 봉합하고 자기편 조직 무료입니다 확인하고 절차가 완료 될 때까지 HBSS 매체를 포함하는 잘 접시에 개별 뼈 조각을 배치합니다.
5. HBSS를 취소하고 각 웰에 추가 37 ℃....

결과

결과는 5 개의 독립적 인 실험 10을 얻었다.

세포 형태

AA / GP는 일차 전지는 대부분 조약돌 같은 기능, 성숙한 조골 세포의 특성을 가지고 처리. 산재 분지 세포 (그림 1A에서 빨간색 화살표로 표시된)을 가능성이 골 세포를 대표하는 찾을 수 있습니다.

ATRA 치료로, 세포는 빠르게 일반적으로 이일 후 관찰되는 파급 효과를 표시하기 시작합니다. 도 1b에 도시 된 바와 같이, 분지 세포들은 수상 돌기를 확장하는 공간을 필요로한다. ATRA의 진행과 치료로, 파급 효과가 점진적으로 수와 복잡성의 증가, 1C 및 1D 피규어. 로다 민 - 라벨 phalloidin도에 의해 사상 굴지의 염색은 phalloidin도, 그림 2에 표.......

토론

지난 몇 년 동안 골 세포가 뼈에서 가장 중앙 세포로 떠오르고있다. 연구의 발전은 점진적으로 뼈 질환의 다양한 소설과 더 나은 치료를 디자인하는 엄청난 가치가 이전에 의심받지 검증되지 않은 골 세포의 속성의 수를 공개하고 있습니다. 그러나, 골 세포 생물학의 연구는 골 세포와 같은 세포 라인 MLO-Y4가 제공되기 전에 조골 세포가 오랜 기간 동안 대리 세포로 사용되어왔다있을 정도로 체외 모델의 제한된 가용성을 앓고있다. 최근 조건부 불후의 세포 라인은 sclerostin 및 FGF23 표현 후반 골 세포를 분지하는 차별화 할 수있는 같은 그룹에 ^{16 일} 소개했다. 이들 세포주의 극한값이 질문하에 있지인데, 그것은 매우 잘 일차 전지보다 생체 내 상황을 닮고 차 골 세포의 FR을 얻을 가능성을 제공하는 것으로 알려져있다톰 형질 전환 동물의 특정 분자 경로에 대한 연구 기능을 수행 할 수 있습니다.

격리 먼저 ^{5,6이.......}

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
콜라겐 분해 효소 P	Roche 응용 과학	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	37 °에서 사전 예열; C 사용 전
알파 - MEM	Invitrogen, 생명 기술	22571038	37 °C에서 사전 예열; C 사용 전
FBS	시그마-알드리치	F4135
스트렙토마이신/페니실린	시그마-알드리치	P4333
아스코르브산	시그마-알드리치	A4403
글리세롤 2-인산이나트륨 염 수화물	시그마-알드리치	G9422
ATRA	시그마-알드리치	R2625	빛으로부터
ATRA 보호파라포름알데히드	시그마-알드리치	P6148	사용 전에 PBS에 용해시키고 여과하십시오. 항상 화학 물질 후드 아래에서 작업하십시오.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	2차 항체에 추가 가능
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	주의해서 사용하십시오(피부와 눈 보호 권장)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	주의해서 사용하십시오 (피부와 눈 보호 권장)
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy 핀셋 #7, 0.40 x 0.5 mm 팁	World Precision Instruments	501981
Economy 핀셋 #4, 0.40 x 0.45 mm 팁	World Precision Instruments	501978
해부 가위, 스트레이트, 10cm 곡선	World Precision Instruments	14394
수술용 가위, 14cm, 스트레이트, S/S	World Precision Instruments	501218
배양 플라스크	Corning	430168
웰 플레이트	Corning	3335
Thermanox 커버슬립	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
현미경	Zeiss Apotome
분광계	Safas Xenius