고속 3D 구조 조명 현미경을 사용하여 라이브 박테리아의 Cytokinetic Z 반지의 슈퍼 해상도 이미징 (F3D-SIM)

요약

살아있는 세포 내부의 동적 단백질에 대한 시공간 정보는 생물학을 이해하는 데 매우 중요합니다. f3D-SIM(fast 3D-structured illumination microscopy)이라고 하는 초고해상도 현미경 검사의 한 유형은 박테리아의 사이토키네틱 Z 고리에 대한 고유한 정보, 즉 구슬 모양의 모양과 고리 내 FtsZ의 빠른 역학을 모두 보여줍니다.

초록

형광 현미경을 사용하여 생체 시료의 라이브 영상 샘플 초해 허용 광의 회절의 해상도 장벽을 극복 할 수있는 새로운 기술을 실질적으로 진보했다. 유도 방출 고갈 (STED) (예 : PALM, STORM 및 GDSIM 같은 기술 포함) 단일 분자 현지화 현미경 및 구조 조명 현미경 (SIM) - 초 해상 기술의 세 가지 주요 유형이 현재있다. STED와 단일 분자 현지화 기술이 해상도에서 가장 큰 증가를 보여 있지만, 그들은 이미지 수집의 증가 속도를 제공하는 느린왔다. 입체 SIM (3D-SIM)은 단일 분자 및 지역화 STED 둘 이상의 많은 장점을 제공 넓은 필드 형광 현미경 기법이다. 해상도를 허용, 커버 슬립에서 전형적인 횡 방향과 축 (110)의 해상도와 280 nm의 각각 최대 30 μm의 샘플링의 깊이와 개선전체 세포의 이미지. 상당히 광 독성 및 광표백을 줄이면서 것의 이미지 캡처 속도를 향상 기술의 최근의 진보 (고속 3D-SIM)은 초에서 발생 생물학적 과정의 빠른 포착을 허용한다. 여기서 우리는 이미지를 세포 분석 방법을 보여주는 형광 표지 된 cytokinetic FtsZ 단백질 및이 기술이 제공 할 수 있다는 특유의 정보 유형을 은닉 균체를 하나의 그러한 방법의 사용을 설명한다.

서론

다른 이미징 기술의 수는 다양한 전자 및 광학 현미경 기술을 포함한 세균 공부 년간 사용되어왔다. 전자 현미경은 매우 높은 해상도를 제공하는 동안, 나노 미터까지, 진공 및 조영제의 사용에 대한 필요성이 매립 고정되고 시험편에이 기술을 제한하고있다. 아티팩트 인해 긴 샘플 준비 및 당업자가 샘플을 제조하고, 생성 된 이미지를 분석하고 해석하기 위해 필요로 도입 될 수있다. 광학 현미경은 간단한 시료 준비 및 전자 현미경에 비해 비교적 쉽게 다중 라벨의 적용 이점을 제공한다. 형광 단백질 및 염료 접합체보기, 형광 현미경으로 생균을 연구 할 수있는 능력을 사용하는 것도 가능하다. 카메라 검출 TECHN에서 세포 독성뿐만 아니라 진보 감소로 이어지는 형광 안정성과 형광 단백질 크기 / 구조 개선 포함ology, 넓은 필드와 공 촛점 이미징 시스템을 사용하여 형광 현미경은 크게 세포의 공간 역학에 대한 우리의 이해를 확대하고있다. 이러한 기술을 사용하여, 지난 20 년 동안 박테리아 세포에 대한 우리의 지식은 박테리아 세포 ^하나 내 구조와 단백질 조직의 높은 수준을 보여 훨씬 더 상세보기에 크게 진행하고있다.

그러나, 광학 현미경의 종래의 방법은 고유의 해상도는 사용하는 여기 광의 파장의 약 절반 인 것을 의미하는 회절 제한적이다. 결과적으로, 심지어 가장 최적 종래 광학 현미경 시스템으로, 가장 외측의 해상도는 약 220-250 나노 미터이고, 축 방향의 해상도는 약 500 ㎚이다 (검토 Schermelleh 외. ² 참조). 특히 박테리아 세포 생물 학자,이 여전히 심각​​하게이 작은 세포의 공간 조직에 대한 우리의 이해를 제한한다; DIAM 만 ~ 2 μm의 인eter, 길이 1-10 μM. 단백질의 동적 공간 문제가 시험 관내에서 보완 데이터 분석 될 수 생균 수행 가능 높은 해상도의 기술에 대한 필요성이있다.

지난 10 년간 여러 수퍼 - 해상도 형광 이미징 기술이 개발되어왔다. 슈퍼 해상도 현미경은 기존의 광학 현미경으로 얻을 적어도 두 측면 해상도함으로써 회절 장벽을 극복 이미징 기술에 대해 설명합니다. 이러한 기술은 명백 실제 해상도 증가를 만들 발광 조명 및 / 또는 분석을 조작. 초 해상 기술의 세 가지 주요 유형이 현재있다 - 내가) 방출 고갈 현미경 ^세 (STED)를 자극; 같은 photoactivation 현지화 현미경 ^4,5 (PALM), 확률 적 광학 재건 현미경과 같은 기술을 포함 ⅱ) 단일 분자 현지화 현미경, 8 (GDSIM) 최대> 6 (STORM), 직접 STORM ⁷ (dSTORM), 및 접지 상태 고갈; 및 ⅲ) 구조 조명 현미경 ^9-12 (SIM). 단일 분자 현지화 기술은 생물학적 시료에서 아래로 10 ~ 40 nm의 사이에, 수평 해상도에서 가장 큰 증가를 제공합니다. 단일 분자 지역화 현미경의 많은 구현에서, 샘플링 깊이가 소멸 파에 한정되고 STED의 초기 구현은 또한 샘플링 깊이가 제한되었다. 축 모두 그러나, 이러한 적응 광학의 사용과 같은 최근의 진보는, 서로 다른 초점 포인트에 점 분포 함수에서의 비 점수차의 착취, 다중 평면 검출 및 발광의 축 방향 위치를 추론하기 위해이 목표를 사용 보았 개선 STED와 단일 분자 현지화 ^13,14 모두 해상도와 샘플링 깊이. STED에 대한 데이터 수집 속도와 단일 분자 현지화 기술인해 (위치 ​​파악 기술을위한 50,000) 최대 해상도를 취득 할 필요가 화상의 다수 비교적 느리다. 이 느린 데이터 수집은 종종 매우 비싼 사용자 정의 수정없이 라이브 샘플의 이미지에 적합하지 않습니다. 이 두 기술은 최적의 (검토를 위해 ^{2,15 참조)} 고정 샘플에 적합하지만, 많은 작업이 제한을 해결하기 위해 수행되고있다.

세 가지 차원 구조 조명 현미경 (3D-SIM)은 약 110 및 280 nm의 각각의 해상도의 결과로 양측과 축 해상도를 향상 넓은 필드 기술이다. 샘플링의 깊이는 전체 세포의 이미징을 허용 coverslip에 30 μm의에 달려있다. 광학 현미경 실험 (OMX) 플랫폼에서 Sedat, Agard 및 Gustaffsson가 개발 한 3D-SIM의 변화는 다른 15로 이동 알려진 그리드 패턴과 샘플을 조명 포함각 Z 평면 ^9-11에 위치. 관찰 지역 외부 주파수 공간에서 생성 된 결과 모아레 패턴의 무늬가 측정된다. 주파수 공간에서 정보 표시 수퍼 - 해상도 ^이미지를 생성 할 ^10,11 계산적으로 재구성된다. 원시 이미지는이 기술을 사용하여 획득 될 수있는 상대 속도는 생균의 촬상을 가능하게한다. 그러나, 초의 시간 규모에서 발생하는 생물학적 과정에 대한 원시 이미지의 수집 속도는 여전히 역동적 인 변화를 포착하기에 너무 속도가 느리다는 점에주의하는 것이 중요하다. 초 캡처 속도와 시간 시리즈의 경우, 충분한 회복 시간없이 반복 인수는 특히 작은 박테리아 세포의 라이브 영상 중, 광독성 및 광표백으로 이어질 수 있습니다.

이러한 문제를 극복하기 위해, 고속 3D-SIM (F3D-SIM)에 대한 최근의 진보가 개발되었다. 여기에서 우리는 내가했다 OMX 블레이즈 ^(16)로 알려진 하나를 설명이 기술은 이전 시스템에 사용 된 같은 물리적 그리드를 사용하지 않고 패터닝 조명 늦은 2011 년 생성 ntroduced. 광속 및 새로운 셔터 기술을 간섭의 사용은 매우 빠른 방식으로 샘플에 패터닝 된 빛의 생성을 허용한다. 기존 EMCCD 카메라에 비해 화상의 취득 속도는 더욱 특히, 과학 상보성 금속 산화물 반도체 (sCMOS) 카메라의 도입으로 강화되었다. 이러한 변화는 초 ⁽¹⁶⁾ 내에서 발생하는 세포 내에서 역동적 인 변화의 모니터링을 허용, 1 μm의 (512 X 512 픽셀, 9 Z-조각)의 샘플링 깊이 초당 프레임의 가능한 이미지 획득 속도되었습니다. 명백한 노출 (여기) 시간의 감소는 장시간 시리즈는 캡처 할 수 있는데,이 법 또는 캡처 속도의 증가를 사용하여 세포를 살고 있습니다.

여기에서 우리는 대해 조사 할 F3D-SIM 현미경의 응용 프로그램을 설명전자 구조 및 두 종의 박테리아 세포에서 cytokinetic Z 링의 동적 운동 : 막대 형상 모델 유기체 고초균과 coccoid 인간 병원체 포도상 구균. FtsZ 박테리아 ^17,18에서 세포 분열의 중요한 역할을 튜 불린 같은 세포 골격 단백질이다. 이것은 분할 장치 ^{(17, 18)을} 형성 적어도 20 다른 분할 단백질 모집 분할 사이트에 편재하고 세포 수축 ^19-23위한 힘을 제공하는 것으로 여겨진다. 이 방법은 FtsZ가 이질적으로 구슬처럼 배열에서 모두 생물의 Z 링 주위에 분포되어 있음을 알 수; 전자 크라이 단층 촬영 (ECT) ^(24)에 의해 제안 된 바와 같이 종래의 와이드 필드 형광 현미경, 또는 불연속적인 구조에 의해 시각으로 Z 링, 셀 주변에 연속 균일 벨트인지 오랫동안 유지 문제를 해결. 우리는 3D-SIM의 능력이 훨씬 작은 공간의 검사 (1을 향상시킬 수있는 방법을 보여줍니다μm의 직경) S.처럼 라운드 셀 세 개의 연속 수직 인 평면 (x, y, z)로 분할 구균. 이러한 기술을 이용하여 시간 경과 연구 Z 고리의 구조와 고정 지지체 ^(24)의 밖으로 이동 더러워 링 내의 조직 변화보다는 FtsZ 분자와 동적 인 것으로 나타났다.

프로토콜

1 샘플 준비

1. B. 준비 이미징 서브 틸리 세포
   1. B. 단일 콜로니로 (도 3 중 항생제라고도 PAB) Penassay 브로 쓰 10 ㎖를 접종 서브 틸리 스 균주 SU570 (168 trpC2 ftsZ :: ftsZ-GFP - 스펙) ^16. 30 ° C에서 저속 (100 RPM) 통에 밤새 성장.
   2. 흔들어 고속 (215 RPM)와 30 ° C에서 0.05에 신선한 PAB에서 ₆₀₀ (600 nm에서 측정 한 흡광도를) 하룻밤 문화를 희석 중순 지수 위상 때까지 ₍₆₀₀ ~ 0.4)을 성장.
   3. 스크류 캡 유리 병 100 ㎖의 1 배 성장 매체 (PAB)의 전기 등급 아가로 오스의 2g을 추가합니다. 고압 증기 멸균하여 아가로 오스 녹인다. 이 작업은 몇 달 동안 4 ° C에 저장하고, 필요시 아가로 오스를 용융 전자 렌지로 할 수 있습니다. 실온에서 설정할 수 있습니다.
   4. 표준 GLA에, 접착제 프레임 (재료의 표를 참조하십시오 65 μL 용량)를 부착SS 현미경 슬라이드. 이를 위해, 얇은 폴리 에스테르 시트를 제거 (각 접착 프레임은이 폴리 에스테르 시트, 얇은 한 두꺼운 하나 사이에 위치 및 정사각형 제거 중심을 갖는다)과 현미경 슬라이드의 표면에 프레임의 노출 된 접착면을 적용한다. 이 효과적으로 슬라이드의 상단에 사각형을 잘 만듭니다. 이 다음 단계에서 그것을 고집 커버 슬립을 방지하므로 프레임에 부착 된 두꺼운 폴리 에스테르 시트를 둡니다.
   5. 접착제 프레임에 67 μl를 비등 피펫까지 마이크로파에 아가로 오스 용액을 용융. 즉시 평평한 표면을 생성하고 5 ~ 10 분 동안 실온에서 떠나 상단에 커버 슬립을 배치합니다. 시료를 채취하는 동안 1 ~ 2 분 동안 커버 슬립을 제거합니다.
   6. 30 초 동안 5,900 XG에서 샘플을 원심 분리기의 1 mL를 수확. 뜨는을 가만히 따르다 200 μL에 펠렛 신선한 PAB를 재현 탁.
   7. 사전 처리장에 농축 된 시료와 피펫의 2.5 μl를 타고빨간색 아가로 오스 패드. 아가로 오스 패드의 평면 표면을 따라 고르게 확산 샘플. 아가로 오스 패드를 터치하지 않으면 서 핀셋을 사용하여 현미경 슬라이드에서 접착제 프레임을 제거합니다.
   8. 유리 커버 슬립의 바닥 직경 35mm 페트리 접시에 현미경 슬라이드에서 아가로 오스 패드를 전송합니다. 페트리 접시의 세포 현탁액 및 커버 슬립은 서로 직접 접촉하도록 패드를 아가 전환. 페트리 접시의 바닥은 고해상 이미징 1.525의 굴절률을 갖는다.
2. 라이브 S.의 준비 이미징 구균 세포
   1. S.의 단일 식민지와 L-국물 10 ㎖를 접종 구균 균주 SA94 (쟁기-FtsZ-GFP 및 pGL485를 포함 SH1000, ^R 음, 형상 ^{R) 25.} 37 ° C에서 저속 (100 rpm으로) 회전 통에 밤새 성장.
   2. (이소 0.05 mM의 IPTG와 0.05에 신선한 L-국물에 ₆₀₀ (600 nm에서 측정 한 흡광도를) 야간 문화를 희석프로필 β-D-1-티오 갈 락토 피 라노 시드)의 융합 단백질의 생산을 유도한다.
   3. 흔들어 고속 (215 RPM)와 37 ° C에서 품어 중순 지수 위상 때까지 ₍₆₀₀ ~ 0.4)을 성장.
   4. B.에 설명 된대로 1.1.8 - 1.1.3 단계를 따르 서브 틸리 스 라이브 셀 준비.
      주 : 유도 제어하에 형광 융합 단백질을 발현 균주 단계 1.1.3에서 아가로 오스 용액에 유도제의 적절한 농도를 추가한다.

현미경의 2 준비

이 방법은 블레이즈 모듈 장착 DeltaVision OMX (광학 현미경 실험) 3D-SIM 이미징 시스템을 사용한다. 실험 설명에서는 오직 하나의 레이저 및 하나의 카메라가 사용되고있다. 조명 및 광로는도 1에 기재되어있다.이 방법은 적절한 교정 현미경, 광학 전달 함수를 가지고 있다고 가정 (OTF)파일 및 광 시준 유지 보수 수행.

1. 생균 이미징 실험의 경우, 가열 단계가 대물 (60X 1.42 NA 대물 오일)에 부착되어 세라믹 스테이지 및 대물 가열 칼라에 부착되어 있는지 확인.
2. 영상에 적어도 4 시간 전에 객관적이고 무대 히터를 켜고 천천히 5 ° C / hr의 최대 속도로 원하는 설정으로 온도를 램프. 이 영상에 앞서 저녁이 과정을 시작하고 3 ° C / 4 시간에 진입로하는 것이 좋습니다. B.와 생균 실험 서브 틸리는 대부분의 실험은 30 ° C에서 수행됩니다. S. 들어 구균, 모든 실험은 37 ° C에서 수행됩니다.
3. 실험 날에, 시스템 및 레이저 충분히 안정 될 수 있도록 종래 촬상 적어도 1 시간에 시스템을 켜. 예열 온수 무대에 작은 접시 무대 삽입을로드합니다.
   1. 마스터 컨트롤러 워크 스테이션의 전원을 켭니다.
   2. 이미지 처리 workstat를 켭니다이온.
   3. 현미경 설치하여 외부의 바닥에있는 카메라 쿨러의 전원을 켭니다.
   4. (그들은 모두 사용하지 않을 경우에도) sCMOS의 모든 카메라를 켭니다.
   5. 레이저 및 전자 인클로저 내부 전원을 켜십시오 :
      1. 악기 컨트롤러 섀시.
      2. Nanomotion 섀시.
      3. Z 압전에 대한 예나 컨트롤러.
      4. 모든 4 갈보 모터 컨트롤러.
      5. 주 레이저 제어 모듈.
      6. 보조 레이저 제어 모듈.
      7. 모든 카메라 워크 스테이션.
      8. OMXIC 워크 스테이션.
   6. 마스터 컨트롤러 워크 스테이션에서 아이콘을 클릭하여 OMX 소프트웨어를 엽니 다. 적절한 데이터 폴더에 데이터를 저장하는 파일 경로를 설정합니다.
   7. 하드웨어를 초기화하려면, 하드웨어 메뉴로 이동 하드웨어를 선택하고 다시 시작 하드웨어 버튼을 클릭합니다. 창 닫기.
   8. (실험에 필요한 레이저의 4 softWoRx software.Turn 시작88 나​​노).
   9. 레이저 안전 잠금 장치의 키 스위치를 켭니다.
   10. 올바른 다이크로 익 필터 서랍 목적 아래에 삽입되어 있는지 확인합니다. GFP를 들어, 표준 (또는 고정) 서랍이다.
   11. OMX SF에서 파일 메뉴로 이동하여 설정을 선택하고 서랍 드롭 다운 메뉴에서 고정 서랍을 선택합니다. 창 닫기.
   12. 빛 매개 변수 섹션에서 소프트웨어의 메인 화면에서 다음을 수행하십시오 :
       1. 채널 선택에서 여기 레이저 및 배출 필터 (FITC) 카메라에 적합한 카메라를 활성화합니다.
       2. 모드가 순차로 설정되어 이미지를 확인합니다.
       3. 빛의 경로가 SI로 설정하십시오.
       4. 확인 모드 (Mode)가 95 MHz로 설정되어 있습니다.
       5. 488 레이저의 여기에서 선택하십시오.
       6. 설정 1 × 1 창 크기 및 비닝 512 X 512 크기.
   13. 실험 탭에서 유형 드롭 다운 메뉴에서 SI로 설정되어 있는지 확인합니다.
   14. 단면이 활성화되어 있는지 확인 및 광학 부 간격은 0.125로 설정되어 있는지.
   15. 스캔이 시작 중간 때 포커스 포인트를 확인합니다.

3 이미지 인식

1. 목표의 상단에 오일 한 방울을 적용합니다. 37 ° C의 경우, 권장 출발 오일이 가장 37 ° C에서 균체를 탑재하기 위해 사용 겔 패드의 굴절률과 일치하도록 1.518의 굴절률을 갖는 (1.1.3 단계를 참조).
2. 무대 삽입으로 제조 된 세포를 포함하는 샘플 페트리 접시를 놓고 원형 가열 뚜껑을 포함한다. 오일의 바닥에 닿을 때까지 단계를 낮추샘플 페트리 접시.
3. 접시 무대에서 15 분 동안 열 평형을 허용합니다. (파라미터 라이트 부에 위치한) 5 ms 이하의 낮은 노출 설정을 사용하여, 나노 포지셔닝 스테이지 컨트롤 (나노 위치 결정 부에 위치 DZ 등)를 사용하여 샘플에 초점. 최대 초점과 빛이 샘플 초점면의 상하에 고르게 경우 아래 예제를 통해 확인합니다. 점 분포 함수는 심지어 (구면 수차) 인 경우, 샘플 접시의 바닥 클로로포름으로 대물 청소. 기름을 변경하고 적절한 일치하는 구면 수차를 최소화하기 위해 오일 샘플의 굴절률 사이에서 발견 될 때까지이 단계를 반복합니다.
4. 0.5 μM DZ 스텝 크기를 사용하여, 화상 스택의 상단과 하단을 표시한다. 샘플의 중앙으로 돌아갑니다. 샘플 수집 두께를 설정 실험 탭에서 가져 오기 두께 버튼을 클릭합니다. 키,P Z-링의 상단과 하단을 차단하지 않도록주의되는 동안 최소한으로 적재 높이. B. 일반적인 두께 서브 틸리 샘플은 2-3 μm의 수 있습니다.
5. 현재 노출와 % T 설정 샘플 이미지의 최대 강도 값 (max)를 결정한다. 이 값은 이미지 창 아래에서 발견된다. 시간 경과 영상의 경우, 이미지 1,100-1,400 위 배경의 최대 강도를 얻기 위해 노출 및 % T를 조정합니다. 위의 배경 1000 최소 강도는 화상 재구성을 얻기 위해 필요하다. 일회성 이미지의 경우, 4,000-5,000에 최대 강도를 증가시킨다.
6. 실험 탭의 시간 경과 섹션을 활성화합니다. 필요한 프레임 속도 및 총 시간을 설정합니다. 데이터 파일에서 적절한 파일 이름을 입력합니다. 이미지 수집을 시작하기 위해 실행 버튼을 클릭합니다.
   주 : 화상 취득이 완료되면 g리엔 진행 바는 종료하고 로그 파일은 해당 데이터 폴더에 설정된 데이터에 대해 표시된다.

4는 데이터 품질 확인

1. 화상 획득의 시작시, 시계열의 첫 번째 프레임에 대한 화상 획득의 시작에서 화상의 최대 강도 값을 참고. 제 1 프레임의 취득의 끝에서 첫 번째 프레임에 대한 Z-스택을 통해 신호 강도의 10 % 이상의 감소가되어 있지 않은 것을 확인한다. 제 시점에서 photobleaching에 이러한 수준 이상이 된 경우, 시계열을 통해 데이터 분석을 위해 불충분 한 품질의 제품과 배 시리즈 획득이 중단 될 수있다.
2. 시계열의 취득의 끝에, .DV 접미사 얻어진 것의 화상 파일을 열고 최종 이미지에 시계열의 선두로부터 최대 신호 강도의 감소를 확인. 꿀벌이 보유하고있는 모든 시점 폐기n은 30 % 이상 광표백.

5 재구성 3D-SIM 이미지

1. 프로세스 메뉴에서, SI 재건 창을 활성화합니다. 모든 매개 변수에 대한 기존의 설정을 사용합니다.
2. 사용 채널 특정 OTF 버튼을 활성화하고, 표준 필터 세트로 설정합니다. KO 버튼을 각도와 표준 필터 세트로 설정하여 사용 채널 별을 활성화합니다.
3. 드래그 앤 입력 파일 공간으로 원시 (.DV) 파일을 삭제합니다. 그것을 수행을 클릭합니다. _SI 함께 입력 파일 끝에 추가로 출력 파일이 동일한 이름을 가질 것이다.
   주 :이 재구성 처리는 여러 파일을 처리 할 경우 프로세스 메뉴에서 작업 작성기 기능을 이용하여 작업으로 실행할 수있다.

(6) 데이터 내보내기 및 분석

1. 모드와 전을 능가에서 3D 이미지를 시각화하는 Imaris를 사용하여티파니 (300 DPI) 또는 AVI 파일 (압축 없음) 등의 포트 이미지 데이터. Imaris의 크기 측정 모드를 능가에 측정 도구를 사용하여 수행 될 수있다.
2. 3D-SIM 화상 데이터로부터 Z 링의 강도 차원 플롯을 생성 :
   1. Z 링 주위에 FtsZ의 분포를 조사하여 3D 강도 플롯을 만들 수
      1. 각각의 Z-조각을 볼 3D 이미지 파일을 엽니 다. 관심 영역을 자르려면보기 메뉴 탭 아래에있는 볼륨 뷰어 도구를 사용합니다.
      2. 입력 창에이 3D 이미지에 대한 창 번호를 입력하고 출력 창에 새로운 사용되지 않는 윈도우 번호를 입력합니다. 선택 영역 버튼 뷰의 원래 40 × 40 μm의 분야에서 관심의 개별 Z 링을자를 사용할 수있게됩니다.
      3. 회전 탭에서 원하는 축과 회전의 정도를 조정합니다. 마이 버튼을 클릭합니다. Z 링의 원하는 관점을 얻기 위해 볼륨을 스크롤합니다.
      4. 데이터 관리자 도구를 사용하여 t을 조정그는 열 / 행의 크기는 개별 Z 링 주위에 관심의 새로운 영역을 만들 수 있습니다. 관심의 새로운 영역의 위치를​​ 이미지의 중심을 클릭합니다. 문자 화상 데이터는 관심 영역 내의 각 화소의 형광 강도를 표시 자동 생성 된 테이블이다.
      5. 처음에 강도 음모를 보려면 3D 그래프 버튼을 클릭합니다.
      6. 또한 텍스트 이미지 데이터는 파일 메뉴에서 저장 테이블 데이터 버튼을 클릭하여 내보낼 수 있습니다.
      7. 새로운 스프레드 시트에 저장된 텍스트 파일의 화상 데이터를 복사한다. 스프레드 시트에있는 모든 셀을 선택하고 새로운 차원 표면 그래프를 만들 수 있습니다. 게시에 대한 3D 강도 플롯 그래프를 포맷합니다.
   2. 3D 이미지 파일에서 서로 다른 시간 포인트에 각각 6.2.1.7 - 시간 경과 데이터의 반복은 6.2.1.1 단계를 반복합니다.
3. 시간이 지남에 따라 평균 형광 강도를 추적
   1. fluorescen를 추적하는 텍스트 화상 데이터를 사용관심 영역의 경시 CE 강도.
   2. 관심 영역에 해당하는 셀을 선택한다.
   3. 관심 영역이 각 시점에서의 평균 형광 강도를 계산한다.
   4. 별도의 선 그래프를 생성하는 평균 형광 강도 값을 사용합니다.

결과

이 연구에서 우리는 박테리아 세포 분열 단백질 FtsZ를 시각화 세균 단백질 현지화 및 역학을 공부 기존의 형광 현미경을 통해 F3D-SIM의 강력한 장점을 설명하기 위해 FtsZ-GFP 융합과 같은 살아있는 세포에서 발현. FtsZ는 셀의 원주 둘레 동적 고리 구조로 튜 불린 중합 형 세포 골격 단백질이다. 이 사이트에 모든 세포 분열 단백질을 모집, 그 어셈블리가 분할의 미래 위치를 표시하고, Z 링 수축 세포질 분열 ¹⁷ 중에 셀 봉투의 이동 내측 있도록 힘을 ​​제공하는 것으로 보인다 : Z 링은 세포 분열의 중요한 기능을 갖고 ^18.

종래의 와이드 필드 형광 현미경에 의해 시각 때, Z의 고리는 B.로서 가장 잘 연구 유기체를 포함 봉상 박테리아 형광 단일 횡 밴드로 나타나는 서브 틸리 스 (그림 2A), E. 콜라이, 및 C. crescentus. 중요한 것은,이 주파수 대역에 걸쳐 형광 강도는 다소 균일 한 것으로 나타나고 지역화 패턴은 Z의 고리 구조 내에 조직 FtsZ 중합체의 분포에 거의 통찰력을 제공한다. 동일한 세포가 여기에 설명 F3D-SIM 방법 (도 2b)을 사용하여 조사하는 경우, 그러나,이 기술의 장점은 즉시 명백하다. 먼저, z 축 주위의 3D-SIM 이미지의 회전은 삼차원 공간 (도 2C 및 3A)에서의 진정한 고리 구조로서 Z 링의 시각화를 가능하게한다. 함께 해상도 증가에 따라,이 Z 반지 FtsZ의 분포가 사실상 매우 이질적 (도 3) 인 것으로 나타났다. 해상도의 개선은 또한 우리의 세포막 함입로 나타낸 분할 격벽 (형성하도록 수축 과정을 시작했다 고리 Z를 볼 수 <강한> 그림 2C 및 2D).

B.의 추가 예 이 기술에 의해 시각 서브 틸리 Z 반지 그림 3Bi에 표시됩니다 - 3Biv 및 Z 링 주변의 형광 강도가 동일한 결코 방법을 보여줍니다. 또한, 매우 낮은 형광 강도의 영역은 종종 관찰된다. 우리는 갭 (흰색 화살촉)로이 지역을 참조하십시오. 900 나노 미터 (93 %) - 우리는 모든 검사 Z 링 (N = 84)의 15 %로하고 주로 (800)의 직경을 갖는 Z 고리에서 이러한 차이를 관찰한다. 이러한 관찰을 정량화하기 위해, 3D 강도 플롯 Z 링으로 만든 및 통계 3Biii 및 3Biv에 표시된 Z 링을 사용하여 그림 3Ci 및 3Cii에 표시됩니다. B.의 상이한 영역에 4 배 - 세기의 플롯은 일반적으로 Z 링에 형광 량이 최대 3 다를 수 있음을 보여 서브 틸리 스 Z 반지. 더욱이 강도 3D 플롯은 GA가 보여Z 반지 안쪽에 형광 PS 거의 배경 형광 (그림 3Ci에서 검은 색 화살표)의 기준 레벨을 참조하십시오. 이 위의 예는 Z 링의 좋은 복원을 묘사하고 충분한 빛이 중요한 광표백없이 시료로부터 방출되는에 따라 달라집니다. 이것은 FtsZ 이러한 조건 하에서 세포에서의 풍부한 (잡음비 높은 신호)에 융합 된 GFP의 형광 물질의 휘도를 통해 달성된다. 다른 셀들에서 신호 대 잡음비는 이미지의 재구성이 불량 로우이다. FtsZ-GFP, B.로부터 수집 된 발광 신호의 양이 발생을 시뮬레이트하도록 서브 틸리 세포는 여기 에너지를 낮춤으로써 감소되었다. 도 3d에서 중요한 이슈가 Z-링의 이미지에서 여기 에너지 결과의 100 배 감소를 나타내는 바와 같이. 이 FtsZ-GFP 신호와 똥으로 이어지는 배경의 부족 지역 대비의 결과로 발생화상의 R 재구성.

흥미롭게도, B. 서브 틸리 Z 링은 링의 상부 및 하부 영역에 있지만 링 (도 3b)의 측면에서 더욱 현저 갭 및 얼룩이 보였다. 이는 축면에 비해 횡 방향 평면에서 3D-SIM의이 변화에 의해 달성 해상도의 차이로 인해 발생. 이는 Z 링 (횡 평면)의 상부 및 하부 영역에서 최적의 결과를 해상도로 촬상된다. Z-링 갭 횡 평면의 절반 해상도 축면에서 시각으로 Z 링의 측면에서 검출하기에는 너무 작다. 이러한 S.로 coccoid 형태를 가지고 박테리아, 구균, 모든면에 위치하는 Z 반지가있다. 그것 (또는 주변) 측 방향 평면에 놓여 최적의 해상도로 이미지를 링의 모든 영역을 기능을 제공 그래서 Z 링 촬상. 이 활용, 우리의 구조를 검토라이브 S.에서 Z 링 구균 세포, 플라스미드 - 함유 ftsZ-GFP 융합을 포함하는 균주를 이용. 이 융합 생산 P의 _SPAC의 유도 프로모터의 제어하에 (단계 1.2.1 참조). 축면, S.에 몇 군데 때 구균 Z 반지 B. 동일 등장 동일 평면 (그림 4AI)에 존재하는 서브 틸리 Z 반지입니다. 그러나, 측면 평면에서 영상 Z 반지는 전체 Z 링 비드와 같은 이기종 모두 등장 함을 확인 하였다. 이 반지의 약 26 %는 (그림 4Aii, 4B) 형광 적어도 하나의 표시 "차이"를 보여 주었다. B. 유사 S.의 다른 영역에서 6 배 - 서브 틸리 FtsZ는, 형광 강도의 그래프는 Z 링에서의 형광 강도가 4만큼 변화 등을 보여 구균 Z 링 (그림 4C).

비드의 길이 및 폭을 측정 할 수있다 () 그림 4D에 회로도를 참조하십시오. 이것은 조사 하였다 Z 링 (N = 43)의 80 %가 400 nm의 최대 길이에 도달 200nm의 비드 길이를 한 것으로 나타났다. 비드의 폭은, 다른 한편으로는, 200 nm의 최대 측정. Z 고리 당 평균 12 ± 2 (SEM) FtsZ 구슬에 있었다. 네이티브 FtsZ은 (네이티브 FtsZ 이외에 ftsZ-GFP 발현에 의해 발생이 불균일 및 비드 형상 지역화 패턴이 진짜임을 나타내는 면역 형광 현미경을 사용하여 이러한 방법 (IFM)과하지 아티펙트 데이터를하지 가시화 될 때 비슷한 위치 파악 데이터는 관찰 참조). 3D-SIM이 발전은 Z 링 이종 구조로 나타나며 자연 가능성이 불연속임을 표시 할 수있다.

이 이기종 Z-링 구조가 수축을 겪는 및 세포 분열을 촉진하는 방법의 문제를 해결하기 위해, Z 링 역학의 시간 경과 분석을 수행 할 수 있습니다. 메인 과제 중 하나형광 현미경 시간 경과 연구는 이미징 동안 샘플 광표백 및 광독성의 최소화에있다. 3D-SIM은 원시 이미지의 다수의 시간 경과 시료 photobleaching에 해당하는 영상 복원을 허용하도록 충분한 신호 선도 열악한 신호대 잡음비를 초래할 것이라는 의미 수득하는 것이 필요. 새로운 기술의 적용은 각각의 노광 때문에 생균을 입력 에너지의 감소에 사용되는 여기 에너지의 양을 최소화한다. 이 샘플에 따라 구조화 패턴 및 감도 및 양자 효율을 증가 과학적 CMOS 카메라의 사용을 만드는 광 빔 간섭계의 조합에 의해이 작업을 수행. 우리의 이전 반복 얻어 5-8 초 (512 X 512 픽셀 × 8 Z-조각) 당 1 μm의에 비해 초당 1 μm의 (512 × 512 픽셀 × 8 Z-조각)의 Z-스택 인수의 조합 결과 (Riglar 외. ^26에 기재되어 있음) 3D-SIM.영상 획득 시간과 노출 설정을 낮추면 시간 경과 연구에서 특히 관련이 살아있는 세포의 광독성을 최소화 할 수 있습니다. 여기에 제시된 새로운 기술은 우리가이 상황에서 이미지 수집 중에 변화하는 단백질의 현지화를 의미 '모션 블러'로 참조 라이브 세포 이미징의 또 다른 문제를 해결합니다. 영상 획득 시간을 감소시킴으로써 "모션 블러"의 양은 따라서보다 정확한 화상 재구성을 생성이 최소화된다.

FtsZ가 Z 링 내에서의 구성에 대해 언급 한 이전의 연구 Z 링 구조가 시간이 지남에 따라 어떻게 변화하는지 보여줄 수 없었다. 이러한 측면을 조사하기 위해 우리는 F3D-SIM을 사용하여 시간 경과를 시행 하였다. B.에서 Z 링의 3D-SIM 화상의 취득이 가능 이 시간 스케일에 이전에는 불가능이었다 50 초에 걸쳐 서브 틸리 모든 50-10 초. 도 5a에 도시 exampl이다시간이 지남에 따라 Z 링 내의 FtsZ 분포에 급격한 변화의 예를 (890 nm의 직경). 수축 과정에서 가시적이었다 다른 Z 고리 또한 Z 링 주위 FtsZ의 분포에 영향을 유사한 동역학을 가지고 도시되었다 (도시 생략). 3D 강도 플롯도 정량화 초의 타임 스케일 (도 5b)에 대한 연속적인 형광 강도의 변화 및 Z 링의 상이한 영역에서 FtsZ의 이와 상대적인 풍부 감상 시간 지점들 각각에 대해 생성 될 수있다. 관심 영역은 형광 강도 (도 5c)의 변동을 추적하기 위해 이들 강도 그래프에서 확인할 수있다. 이러한 조건에서 Z 링 구조의 변경 사항을 추적하는 것은 고급 F3D-SIM 기술없이 사실상 불가능하다. 또한,이 작품은 S.에 해당 밝혀 구균 FtsZ의 동적 움직임 B.에서 관찰 된 것과 유사하다 서브 틸리 스. S. 구균 RN4220 세포 홍보oducing FtsZ-GFP는 10 초 시간 간격으로 50 초 동안 몇 군데 있었다. S.에서 Z 링의 이질성에 대한 변경 F3D-SIM과 구균 B로도 비슷했다 서브 틸리 스 (그림 6에서 화살촉과 화살 참조). 이 시간 경과 연구는 고정 된 C. 검사를 통해 예측 된 Z 링 수축 (반복 끼 모델)의 모델을 지원 crescentus 세포이지만 의한 생균 ^27의 Z-링 동역학을 검사 할 필요성을 입증 할 수 없었다.

레이저 테이블이 연구. 레이저 광에 사용 F3D-SIM의 광학 구성도 도식은 특정 파장을 모두 작성 위상 제어 모듈로, 콜리 메이팅 렌즈에 SIM 섬유를 통해 지시 및 격자 고정된다 최적의 간격 오0 차 빔 중앙에서 ± ^{1 차} 차 빔 및 SIM 모음의 위상 단계 F. 빔은 광선이 조명의 3 각도를 만드는 3 개의 클러스터에 반영되어 각 제어 모듈을 입력한다. 빔은 현미경 그림과 같이 빛의 경로 (폴 굿윈 허가를 수정, API)를 입력합니다.

B. 종래의 와이드 필드 형광 및 3D-SIM 촬상도 2의 비교 ftsZ-GFP를 발현하는 세포의 subtilis. (A) B. 종래의 와이드 필드 형광 이미징 ftsZ-GFP 발현 서브 틸리 세포; 단일 사본으로 (SU570 녹색)도 막 FM4-64 색소 (적색)로 염색 하였다. 스케일 바 = 5 μm의. 이미지는 직립 형광 현미경을 사용하여 획득 하였다.(B) 같은 B의 3D-SIM 영상 FM4-64로 염색 ftsZ-GFP를 표현하는 서브 틸리 스 균주. 이미지에서 관심 영역을 확대하는 (점선 박스)를 선택할 수있다. 화상도 축면에서 3D FtsZ 링을 볼 z 축을 중심으로 회전 할 수있다. (C, D)의 제거 밖으로 외 초점 빛과 3D-SIM에서 제공하는 향상된 이미지 해상도 (죄기 된 것을 포함하여) Z 반지의 명확한 시각화 및 (흰색 화살표로 표시) 부문 중 내부 세포막을 할 수 있습니다. 프로토콜 텍스트가 하나의 형광의 시각화를 설명합니다. 그러나, 절차 네 동시에 상이한 파장까지 획득하도록 구성 될 수있다. 이 수치는 스트라우스 등 ^16에서 재 인쇄되었습니다.

그림 3. 3D-SIM을 사용 FtsZ-GFP를 발현하는 살아있는 봉상 균체 (B. 서브 틸리 스)에서 Z 링의 대표 이미지. (AI) Z 링은 XY 평면에있는 셀의 장축에 수직 인 형광 밴드로 관찰된다. (AII) 화상 Imaris 3D 시각화 소프트웨어 (프로토콜을 참조하여 이동시킴으로써 행한다 Z를 중심으로 회전 된 6.1 단계) 때문에 FtsZ가 Z 링 내에 분포하는 방법을 명확하게 볼 하나는 링 구조를 통해 찾고있다. 이 이미지는 이제 ZX 평면에 반지가없는 지역 또는 거의 형광 (흰색 화살촉)와 FtsZ의 이종 분포를 가지고 있음을 보여줍니다. 이미지는 형광의 이러한 '차이'영역을 관찰하기 위해 회전해야합니다. 바이 BIV 이제 ZX 평면에 회전 Z 반지의 또 다른 예를 보여줍니다. (BI는-III) 0.9 μm의 ~의 직경의 Z 반지입니다. (BIV)는 ONL의 직경 Z 반지를 보여줍니다Y 0.65 μm의 진행 수축. (CI)이 일반적인 3D 강도 프로파일이 형광 강도 (즉, 농도)를 보여 0.85 μm의 직경을 갖는 Z 링 주위 FtsZ-GFP의 차이 (프로토콜 6.1-6.3 단계 참조). 이러한 갭의 형광 레벨은 낮고, 배경 형광 레벨 (흑색 화살표)에 접근한다. (CII)의 수축 과정에서 Z 링의 유사한 차원 강도 프로파일. FtsZ-GFP 농도 불균일도이고; 직경 0.65 μm의. 패널 A는, B, CI 및 CII는 스트라우스 등 ^16에서 재 인쇄되었다.

S.의 4 대표적인 3D-SIM의 이미지를 그림 이 세포는 (구균) 라운드 때문에 FtsZ-GFP를 생산 구균 세포., Z 반지는 근래합니다다양한 방향 전자. 도 1Ai 용으로 Z 축을 중심으로 회전 할 때 (AI)에 나타내는 바와 같이 통상 관찰 방향에서의 형광의 대역을 표시 셀 (즉, XY 평면이다), 막대 형상 세포와 매우 비슷. (AII)에서 Z 링은 XY 평면에 이미; 횡 방향 해상도는 이제 구슬 같은 구조 (B)를 제공합니다 전체 링을 통해 최대이다. (C) Z 반지 FtsZ-GFP의 상대적인 풍요의 3D 강도 줄거리. (D) S의 도식 표현 . 구균 Z 반지. 빨간색 화살표는 비드 길이와 폭 치수 (프로토콜 단계 6.1 참조)을 나타냅니다. 이 수치는 스트라우스 등 ^16에서 수정되었습니다.

<강한> 그림 5 F3D-SIM은 3D-SIM에서 시간이 지남에 FtsZ 현지화의 빠른 분석을 할 수 있습니다. (A) 봉상 B.에서 Z 링 내의 FtsZ-GFP 분포 변화 서브 틸리 균체 링의 역 동성을 나타 내기 위해 가시화 될 수있다. 시간 (초)을 각 화상의 왼쪽 상단 모서리에 표시된다. (B) 3 차원 형광 강도 플롯이 불균일 및 Z 반지 FtsZ의 동적 분배를 보여준다.의 (C) FtsZ 역학 (FtsZ-GFP 형광 변화 링)도 관심이 영역에서 시간 경과에 형광 강도를 정량화하여보다 상세히 검토 할 수있다. 이 수치는 스트라우스 등 ^16에서 재 인쇄되었습니다.

그림 6 F3D-SIM 시간 경과 이미지 S.에서 시간이 지남에 링 내에서 FtsZ 현지화의 변화를 보여이 초기 Z 링에서 검출 될 때 ureus. 백색 화살촉 갭을 나타낸다. 시간이 지남에 같은 위치에서 격차의 모양과 실종 (흰색 화살촉에 의해 표시로) FtsZ가 Z-링 주위를 재분배하는 방법을 보여줍니다. 흰색 화살표는 나중 시점에서 Z 링의 갭의 형성을 나타낸다. 시간 (초)은 화상의 상부 좌측에 도시된다. 이 수치는 스트라우스 등 ^16에서 수정되었습니다.

토론

형광 라이브 세포 이미징은 시간이 지남에 따라 세포 내에서 역동적 인 변화의 관찰을 가능하게하는 강력한 도구입니다. 박테리아 세포 생물학의 라이브 영상 때문에 작은 셀 크기의 큰 도전과 여기 광에 반복 노출을 견딜 박테리아 세포의 능력을 감소시켰다. F3D-SIM은 모든 세포 생물학을 심문하는 데 사용할 수있는 도구를 확장했다하지만 제대로 구현하면 유물이 도입 될 수있다주의 깊게이 기술을 수행 할 필요가있다. 이 기술의 성공적인 사용에 대한 중요한 고려 사항들이있다. 그것은 정확한 화상 재구성을 가능하게 피해야한다 발광 굴절률 부정합과 출사 광의 구면 수차의 점 확산 함수의 사용에 의존하여 넓은 필드 형광 촬상 방법이면. 고품질의 0.17 mm 두께의 커버 슬립의 사용으로 인해 커버 유리 두께 변동에 신호 강도의 변동을 피하기 위해입술은 매우 좋습니다. 주의 깊게 모든 실험의 초기 단계 동안 발광의 구면 수차를 평가하고 필요한 침지 오일 굴절률을 조정 중요하다. 이 온도와 샘플의 장착 미디어 / 기판 모두에 의존 이것은 매일마다 다를 수있다. 잘못된 오일의 사용은 이러한 에코 신호 후광과 같은 이미지 아티팩트의 열등한 재구성 될 것이다.

화상 재구성 프로세스의 끝에서, 각각의 위상에 대한 재구성의 품질의 측정치는 조명의 각 단계 / 각도 "코 각도위한 최적"에 의해 얻을 수있다. 이 값은 각각의 각도에 대해 1 이하이면, 재구성의 품질은 아마도 높을 것이다. 이 값이 6 초과 인 경우, 재구성 된 이미지 아티팩트를 포함 할 가능성이 있다는 것이다. 일반 유물 내가보기) 해당 이미지의 줄무늬의 모양을 포함그리드의 각도 중 하나. 이것은 그 그리드 각도에서 낮은 신호로부터 발생할 수 있습니다; ⅱ) 구조의 주위에 haloing. 이 주변 구조에 비해 밝은 구조에서 신호의 매우 고르지 못한 수준으로 인해 발생할 수있는 오일의 굴절률의 불일치 및 샘플이나 이미지가있을 정도로 "구조"를 포함하는 너무 비정질 인하지의 구조에 기인 할 수있다 알고리즘에 의해 인식; 일반적으로 인한 높은 배경 신호, 이미지 신호 대 잡음 비율이 낮은 결과로 III) 'honeycombing'; ⅳ) XY에서 연장 뻗어 아르 구조 / 유가 및 시료의 굴절률이 일치 될 수있다. 이 유물은 경험이 부족한 사용자에 대한 식별하기가 어렵습니다. 그것은이 기술을 사용하기 시작하면 새 사용자가 이미지의 해석과 분석에 대한 조언을 경험 SIM 연구원에 문의하는 것이 좋습니다.

모든 살아있는 세포의 형광 이미징 실험과 마찬가지로 수입은개미 신중 photobleaching에 최소한의 이슈 이미지를 재구성하는 데 필요한 충분한 발광 신호와 셀의 광독성의 정도를 최소화하기 위해 여기 에너지 입력을 균형. 과도한 광표백 (Z 단일 스택 인수에 걸쳐 30 %를 초과)는 재구성 된 이미지의 스트라이프 패턴으로 이어질 것이다. sCMOS 카메라를 이용하여, 초 - 해상도 이미지가 성공적으로 상기 배경 1000 카운트만큼 낮은 발광 신호 원시 이미지로부터 재구성 될 수있다. 이것은 매우 짧은 노출 시간은 이에 광표백을 감소시키고 각각의 프레임에 대한 신속한 포착을 가능하게 허용 할 수있다. 또한, 세포가 여기 에너지의 입력으로부터 회복하기위한 프레임 간의 시간의 양을 증가시킨다. 각각의 개별 프레임에 대한 포착 시간이 매우 짧을 수 또한, 개별 캡처하는 동안 "모션 블러"에 의해 도입 된 아티팩트의 정도는이 방법을 사용하여 감소된다.

이 VARI3D-SIM의 토 오크 박테리아 세포 생물학 의해 실시간 이미징을위한 다른 사용 가능한 슈퍼 고해상도 영상화 기술에 비해 다른 이점들을 제공한다. 3 차원 해상도의 2 배 증가 및 샘플에 30 μm의 이미지에 대한 능력은 실험 기간 동안 전체 세균 (포유 동물) 세포의 이미징을 할 수 있습니다. 일반적으로 사라져가는 파도에 수행하는 등 단일 분자 현지화 같은 기술은 샘플로 침투의 깊이를 달성 할 수 및 전체 세포에 대한 정보를 제공하지 않습니다. 이 기술에 대한 높은 샘플링 깊이를 허용하는 최근의 발전은 전체 세포의 더 나은 축 해상도가 발생할 수 있습니다. 또한, 또한 공간 해상도로 캡처 할 수 있고, 포착 프레임 율 및 궁극적 달성 공간 해상도 간의 절충해야하는 프레임 레이트에 제한이 획득 될 것의 수천 개의 이미지를 필요로 단일 분자 지역화 기법에 의존 이브의 수정의 된 공간 내에서 기록 국세청. 캡쳐 된 프레임의 수를 줄이면 하부 공간 해상도 초래되지만 관심 생물학적 과정에 필요한 시간 해상도를 달성하기에 충분할 수있다. 프레임 간의 회복 시간은 또한 시계열함으로써 얻을 수있는 재생 시간과 주파수를 제한 생균의 광독성을 최소화하기 위해 증가 될 필요가있다. 이러한 전자 현미경 (EM) 또는 전자 cryotomography (ECT)로서 제공 고해상도 기술은 3D-SIM (그리고 다른 수퍼 - 해상도 광 현미경 기법) 위에 해상도를 증가하지만, 고정 된 샘플들에 대해 수행되어야한다. 고정 처리가 유물을 소개 할 수 있으며 라벨의 부족으로 해석하지 않을 수 있습니다. 라벨없는 ECT 불량 콘트라스트를 가지며 약 500-200 나노 미터 ^(24)의 샘플의 투과 두께를 달성 할 수 있기 때문에 관심의 단백질이 식별 될 수있는 경우에도, 전체의 박테리아 세포에서의 단백질의 구조는 관찰 할 수 없다.라벨링과 같은 그러한 immunogold EM에 사용될 수있다하더라도, 2 차원 이미징은 수행된다. 3D 얇은 절편 및 섹션의 계산 재건 만 달성 할 수있다. 얇은 절편은 숙련 된 기술자가 필요하지만 문제가 될 및 유물로 이어질 수 있습니다. 라이브 또는 고정 세포로, 3D-SIM은 특정 방식에 포함되는 세포가 빠르게 근처의 기본 상태에서 촬영을 준비 할 수 필요가 없습니다.

이 방법은 형광 현미경에서 최소한의 경험이있는 연구자들에 의해 비교적 쉽게 구현할 수있다. 실험로는, 형광 또는 과도한 배경 신호를 생성하지 않는 건강한 세포의 기능을 지원하는 배지에서 행할 수있다. 박테리아 세포의 경우, 이것은 복잡하고 최소한의 미디어 또는 박테리아 세포 운동성을 제어하는​​ 고체 또는 반고체 매체 사용의 많은 유형의 사용을 허용 할 수있다. 이미 형광 단백질 (FP)를 융합 설계 및 기능을 테스트 한 대부분의 생물 학자이러한 융합은 더 엔지니어링 및 새로운 광활성 FP 융합과 유효성 검사없이 신속하게이 기술을 걸릴 수 있습니다. 우리는 일반적인 관찰로, 발견 S. 구균 B.보다 FP의 융합과 영상 중에 광표백에 더 민감했다 서브 틸리 스. 그리드 패턴은 물리적 격자에 의해 생성 된 오리지널 3D-SIM 방법을 사용하여, 우리는 S.들과 라이브 세포 이미징을 수행 할 수 없습니다 구균 FP 융합. 그러나이 고급 F3D-SIM 방법으로, 우리는 이미지에 이러한 FP 융합 할 수 있었다 이러한 태그 단백질의 역 동성을 포착하는 짧은 시간 시리즈를 수행합니다. 이것은 아마도 촬상에 필요한 세포 복구에 프레임 간의 시간 증가 감소 노출 시간 때문이다.

OMX 블레이즈 3D-SIM은 비교적 용이하게 단일 실험실 또는 코어 촬상 기능에서 구현 될 수있는 상업적으로 이용 가능한 기술이다. 케어 ARTI 않도록 기법을 수행하도록주의해야가난한 샘플 준비 또는 가난한 이미지 캡처로 인해 사실. 기술이 마스터되면 박테리아와 같은 작은 유기체에서의 단백질의 구조 연구 및 역학은 단일 또는 다색 형광 수행 될 수있다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
아가로스 I (Biotecnology grade)	AMRESCO	0710-500G	2% 아가로스 패드 제작에 사용됩니다. 마이크로파를 사용하여 성장 배지에 아가로스를 용해시킵니다.
N-(3-트리에틸암모늄프로필)-4-(6-(4-(디에틸아미노)페닐)헥사트리에닐) 피리디늄 디브로마이드(FM 4-64)	Life Technologies	T-13320	세포막 염색에 사용되는 리포필 염료.
1.5ml 마이크로 튜브, Natural	Scientific Specialties Inc.	1210-00	호모폴리머 폴리프로필렌으로 제작되었으며, 시각화를 위해 아가로스 패드에 놓기 전에 박테리아 세포를 수확하는 데 사용됩니다.
Luria 육수 베이스, Miller	BD	241420	제조업체의 지침에 따라 준비되었습니다. 오토클레이빙 후 2% 아가로스를 첨가합니다.
BBL 항생제 분석 육수, 항생제 배지 3	BD	210932	제조업체의 지침에 따라 준비됩니다.
접착 프레임	Thermo-Fisher Scientific	ABGAB-0577	이 회사에서 Gene Frame으로 알려져 있습니다. 2% 아가로스 패드를 준비하는 데 사용됩니다(치수: 15 x 16mm).
현미경 커버 유리	Thermo-Fisher Scientific	111512-9	22 x 22 No. 1 두께
35mm 직경 유리 커버 슬립 바닥이있는 페트리 접시	세계 정밀 기기	FD35-100	이 회사에서 FluoroDish로 알려져 있습니다. 요리: Ø 35 mm, 유리: &오슬래시; 23mm, 유리 두께: 0.17mm, 비발열성
클로람페니콜	시그마-알드리치	C0378-25G	95% 에탄올로 10mg/ml 스톡을 만듭니다.
린코마이신 염산염	시그마	L6004-5MU	50% 에탄올로 25mg/ml 스톡을 만듭니다.
Erythromycin	Boehringer Mannheim GmbH	12390120-14	95% 에탄올로 10mg/ml 스톡을 만듭니다.
복합 궤도/선형 진탕 수조	Grant scientific Instruments	OLS-200	배양에 사용되는 진탕 속도: 215rpm
UV 가시광선 분광 광도계	Shimadzu	UV-1601	600nm 파장은 박테리아 배양의 광학 밀도를 측정하는 데 사용되었습니다.
Centrifuge	Eppendorf	5415R	박테리아 배양 펠릿은 8,000 rpm에서 30초 동안 기하급수적으로 성장하는 배양액을 스핀다운하여 얻었습니다.
이소프로필 &베타;-D-1-티오갈락토피라노시드 (IPTG)	Sigma	15502-10G	1M 스톡을 준비하고 필터는 사용 전에 살균합니다.
softWoRx 소프트웨어	Applied Precision Inc/A, GE Healthcare Company	버전 5.0
Imaris 데이터 분석 소프트웨어	, Bitplane Scientific 소프트웨어, Bitplane AG	버전 7.0.0	Matlab XTensions에는
Blaze 모듈이 장착된 DeltaVision OMX 3D-SIM 이미징 시스템이 포함되어 있습니다.	OMX V3