수정<em&gt; 시험관</em&gt; 침공 분석은 호르몬, 중재 암 세포 침략의 사이토 카인 및 / 또는 성장 인자의 잠재적 인 역할을 확인하는

요약

이 비디오 기사는 암세포 침입을 유도하는 호르몬, 사이토카인 및/또는 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 수정된 체외 방법에 대해 설명합니다.

초록

혈청 암세포 미세 혈관에 자신 intravasation 용이 마이그레이션 침입하는쪽으로 화학 유인로서 기능한다. 그러나, 세포가 이동하는 방향으로 실제 분자는 애매 남아있다. 이 변형 침윤 분석은 세포 이동 및 침입을 구동 대상을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술은 특정 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 암세포의 잠재적 침입을 매개하는 역할을한다 여부를 확인하는 세 조건 하에서 내습 인덱스를 비교한다. 이러한 조건은 ⅰ) 정상 소 태아 혈청 (FBS)이, ⅱ) 숯 막았 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 ⅲ) CS-FBS + 분자를 제거 FBS (CS-FBS가), ( "X")를 표시 포함한다. FBS 비교하여 CS-FBS와 세포 침윤에 큰 변화는 변화를 매개 호르몬, 사이토 카인 또는 성장 인자의 관여를 나타낸다. 개별 분자는 다시 자신의 능력을 분석하기 위해 CS-FBS에 다시 추가 될 수있다부르면 또는 침략 표현형을 구출. 또한, 두 개 이상의 요소가 구동 또는 첨가제 또는 침입을 억제하는 다수의 분자의 상승 효과를 평가하기 위해 결합 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 호르몬, 사이토 카인, 및 / 또는 성장 인자가 암세포의 특정 형식 또는 특정 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 침입의 억제제로서 작용하여 세포의 침윤에서 역할을 수행할지 여부를 결정하는 조사원을 가능하게한다. 특정 화학 유인 물질 및 억제제를 확인함으로써,이 수정 침공 분석은 암 세포 침공을 지시 신호 전달 경로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

서론

신규 침윤 분석은 특정한 호르몬, 암세포의 침윤 등의 화학 유인 물질 사이토킨 및 / 또는 성장 인자의 참여를 식별하기위한 목적으로 개발되었다. 세포 외 기질 (ECM)를 통해 침투하는 종양 세포의 능력은 전이성 표현형 ^1-3의 특징이다. 침략 챔버 광범위하게 암 세포 침윤 및 이동을 연구하기 위해 체외 도구로 사용되었고, 생체 내 종양 침윤과 전이의 메커니즘에 관한 지식을 제공 할 수있다. 챔버는 세포 배양 플레이트의 웰 내에 중첩 원통형 세포 배양 용 인서트로 구성된다. 인서트 하의 정의 기공 크기의 반 - 투과성 폴리 카보네이트 나 폴리스티렌 막이다.

표준 침공 분석에서, 세포는 혈청 무료 미디어를 삽입 막에 접종하고 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질로 가득 세포 배양 우물에 배치 s의등 최대 chemoattractive 힘. 이 힘 드라이브의 세포를 검출하고 세포 수를 정량화하는 종래의 염료를 사용하여 염색 할 수있는 세포 외 기질 (침입)의 코팅을 통해 대안 반투막 (마이그레이션)을 통해 이동하거나한다. 세포 수는 다음 비 침습적 세포주의 이동과 침략의 정도에 따라 정규화된다. 이 방법은 연구자가 유전자 조작을 포함한 조건, 다양한에서 다른 세포 유형의 ....

프로토콜

1. 다른 미디어와 추가 구성 요소를 준비

1. 실험에 앞서, 테스트 할 중 정상 FBS를 첨가, 숯 제거 FBS, 또는 숯을 박탈 FBS 플러스 요소와 DMEM 또는 지정된 다른 매체로 구성된 미디어를 준비합니다. 여러 구성 요소가 각각의 실험에서 테스트 할 수 있습니다.
2. 칭량 적절 생리적 농도 목탄 스트립 혈청 중에 용해되는 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 희석.

2. 얼음에 콜라겐 매트릭스를 준비합니다

1. 200 μL의 10 배 PBS (PH 7.4), 5.4 ㎕의 1 N NaOH를 두 번 증류 H ₂ O의 600 μL, 1.2 ml의 콜라겐 I : I는 얼음에 다음 멸균 여과 구성 요소를 추가하여 2.2 ㎎ / ㎖에서 매트릭스 2 ml의 콜라겐을 준비 AT (3.63 ㎎ / ㎖).
2. 판 할 준비가 될 때까지 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 유지합니다.

3. <분석에 대한 마이그레이션 / 침략 플레이트를 준비/ P>

1. 각 세포주가 시험 될 들어 12- 웰 인서트를 포함하는 24 개 웰 플레이트 챔버를 사용한다. 화학 유인 물질 미디어를 추가하고 실험 세트까지의 삽입을....

결과

내습 인덱스는 비 침습적 세포주 정규화에 따라 각 조건에 대해 계산된다. 실험을 위해, 우리는 1205Lu 흑색 종 세포주 설립 변이체 안정한 세포주 우리 침습 선으로뿐만 아니라 1205Lu 셀들은 논리적 제어 역할 ¹⁰ 유도되었던 암성 비침 변이체 WM793를 사용한다. 즉 진피의 주성분이기 때문에 또한 내습 행렬로서 콜라겐 I를 이용한다. 최적 내습 행렬 세포주에 기초하여 생체와의 일치의 정도가 달라 결과 ^11있다 이는 이전의 연구와 일치한다. 이 침공 분석은 연구자가 얻을 수있는 가능한 결과에 따라 개략적으로 설명되어 있습니다. 처음에는 2 % FBS의 침공 지수는이 분석 (그림 1, 2)을 추구하기 위해 CS-FBS에 대한 침략 지수보다 훨씬 더 높거나 낮을 수 있어야합니다. 중요한 증분 경우완화 또는 침공 지수의 감소가 숯불 제거 FBS와 명백하다,이 분석은 연구자 (그림 2 및 3) ​​유용하지 않습니.......

토론

종양의 전이는 다단계 과정이다. 세포 기저막을 뚫고 그들이 원위부로 이송되는 림프계 또는 혈액 중 미세 혈관 내로 intravasate한다. 종양 세포를 extravasate 및 ^12에 정착하는 macrometastasis. 중간 엽 전이 (EMT), 종양의 침윤과 전이에 상피를 통해 진행이 스테로이드 호르몬 ^{13, 14로} 향상되었습니다, 성장은 ^{15 ~ 18,} 사이토 카인 ^{19-21 요인.} 이들 분자는 분석의 발전은 종양 침윤성 전위의 역할을 해결한다는 복잡한 신호 전달 경로를 해독하기위한 중요한 단계이며, 종양 진행의 신호 전달 경로를 해결하는 매우 중요하다.

이 종양 세포가 이주되는 구동력을 식별하는 것을 목적으로하기 때문에 숯 막았 혈청을 사용하여 상기 분석은 기존의 방법에 비해 장점을 갖는다. 이전의 분석은있다침략 실에서 일반 차 유방 섬유 아세포를 사용하여 게시되었습니다. 본 연구에서 저.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
8.0 µ를 사용한 BioCoat Control Inserts; m PET 멤브레인	Corning	은	2개의 24웰 플레이트에 각각 12개씩 354578. PET = 폴리에틸렌 테라프탈레이트
콜라겐 I, 쥐 꼬리	코닝	354236	소스 = 쥐 꼬리 힘줄, 순도 = 90%
고착제; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	메탄올 기반 고정제, 헤마톡실린/에오신
소 태아 혈청	Life Technologies	16000	FBS로 지정
숯 박탈 소 태아 혈청	Life Technologies	12676	CS-FBS로 지정
소 태아 혈청	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	FBS
로 지정숯이 벗겨진 소 태아 혈청	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	CS-FBS로 지정