이 비디오 기사는 암세포 침입을 유도하는 호르몬, 사이토카인 및/또는 성장 인자의 역할을 조사하기 위해 수정된 체외 방법에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
혈청 암세포 미세 혈관에 자신 intravasation 용이 마이그레이션 침입하는쪽으로 화학 유인로서 기능한다. 그러나, 세포가 이동하는 방향으로 실제 분자는 애매 남아있다. 이 변형 침윤 분석은 세포 이동 및 침입을 구동 대상을 식별하기 위해 개발되었다. 이 기술은 특정 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 암세포의 잠재적 침입을 매개하는 역할을한다 여부를 확인하는 세 조건 하에서 내습 인덱스를 비교한다. 이러한 조건은 ⅰ) 정상 소 태아 혈청 (FBS)이, ⅱ) 숯 막았 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 ⅲ) CS-FBS + 분자를 제거 FBS (CS-FBS가), ( "X")를 표시 포함한다. FBS 비교하여 CS-FBS와 세포 침윤에 큰 변화는 변화를 매개 호르몬, 사이토 카인 또는 성장 인자의 관여를 나타낸다. 개별 분자는 다시 자신의 능력을 분석하기 위해 CS-FBS에 다시 추가 될 수있다부르면 또는 침략 표현형을 구출. 또한, 두 개 이상의 요소가 구동 또는 첨가제 또는 침입을 억제하는 다수의 분자의 상승 효과를 평가하기 위해 결합 될 수있다. 전반적으로,이 방법은 호르몬, 사이토 카인, 및 / 또는 성장 인자가 암세포의 특정 형식 또는 특정 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 침입의 억제제로서 작용하여 세포의 침윤에서 역할을 수행할지 여부를 결정하는 조사원을 가능하게한다. 특정 화학 유인 물질 및 억제제를 확인함으로써,이 수정 침공 분석은 암 세포 침공을 지시 신호 전달 경로 규명하는 데 도움이 될 수 있습니다.
서론
신규 침윤 분석은 특정한 호르몬, 암세포의 침윤 등의 화학 유인 물질 사이토킨 및 / 또는 성장 인자의 참여를 식별하기위한 목적으로 개발되었다. 세포 외 기질 (ECM)를 통해 침투하는 종양 세포의 능력은 전이성 표현형 1-3의 특징이다. 침략 챔버 광범위하게 암 세포 침윤 및 이동을 연구하기 위해 체외 도구로 사용되었고, 생체 내 종양 침윤과 전이의 메커니즘에 관한 지식을 제공 할 수있다. 챔버는 세포 배양 플레이트의 웰 내에 중첩 원통형 세포 배양 용 인서트로 구성된다. 인서트 하의 정의 기공 크기의 반 - 투과성 폴리 카보네이트 나 폴리스티렌 막이다.
표준 침공 분석에서, 세포는 혈청 무료 미디어를 삽입 막에 접종하고 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질로 가득 세포 배양 우물에 배치 s의등 최대 chemoattractive 힘. 이 힘 드라이브의 세포를 검출하고 세포 수를 정량화하는 종래의 염료를 사용하여 염색 할 수있는 세포 외 기질 (침입)의 코팅을 통해 대안 반투막 (마이그레이션)을 통해 이동하거나한다. 세포 수는 다음 비 침습적 세포주의 이동과 침략의 정도에 따라 정규화된다. 이 방법은 연구자가 유전자 조작을 포함한 조건, 다양한에서 다른 세포 유형의 침략 가능성을 평가할 수 있습니다.
호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자는 혈청의 중요한 구성 요소이다 점점 침습적 표현형 4 구동과 연관되는 것으로 도시되고있다. 그러나, 여전히 침략을 매개 이러한 chemoattractive 혈청 분자의 성격, 역할, 특이도는 애매 남아있다. 문제는 운전에 대한 책임이 있습니다 혈청 또는 혈청과 같은 화학 유인 물질의 특정 요인이 무엇인지 결정하기 위해 남아분자가 침입 과정을 억제 할 수 어떤 암세포 침윤뿐만 아니라. 이 보고서에서, 우리는 암세포의 침윤 및 chemoattraction 구동 분자로서, 호르몬, 사이토 카인 및 / 또는 혈청에 존재하는 성장 인자의 잠재적 개입을 평가하는 방법을 설명한다.
제안 된 프로토콜의 변형 된 목탄 스트립 핑은 2 % 목탄 스트립 FBS (CS-FBS)을 생성하기 위해 2 % 소 태아 혈청 (FBS)에서 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자를 제거하는 데 사용된다. 2 % FBS와 2 % CS-FBS 모두 암 세포 침공을 구동 chemoattractive 힘을 설정하는 에이전트로 사용됩니다. 통상 2 % FBS와 비교 chemoattractive 제로서 2 % CS-FBS를 사용하여 제 등 여러 가지 이점을 수득하고, 가장 두드러지게, 호르몬, 사이토 카인 및 성장 인자의 감소 / 상대 부재 하에서 암 침윤 표현형을 연구 할 수있는 능력. 또한, 호르몬, 성장 인자 집단 제거 여부를 평가하기 조사자 가능하며, CYtokines은 침략 지수의 증가 또는 감소가 발생합니다. 분석 후, (도 2 및 3 참조) "X"로 표시된 각각의 성분의 첨가는, 감소, 증가를 억제하거나, 원래 값으로 침습적 인덱스를 복원 할 수 있는지 여부를 결정하도록 설계된다. 이 방법론은 목탄 스트립 핑 동안 혈청으로부터 제거 성분의 생리 학적 수준을 달성하기위한 구체적인이지만, 또한 목탄 스트립 핑은 또한 신호 전달 경로에 영향을 미칠 수 있음을 유의해야한다. 예를 들면, 목탄 스트리핑 osteoprogenitor 세포의 알칼리성 포스파타제 활성을 감소 및 MAPK의 활성화 제 (5)의 환원을 통해 지방 형성을 유도 할 수 있다고보고되었다. 숯 박탈 미디어 시판하고 그 프로토콜에 따른 덱스 트란이 숯불을 겸비한 소 태아 혈청 O / N 항온 6 나와있다.
이 분석은 RESPO 개발되었다NSE는 주커 등. (7)에 의해보고 된 결과에 저자는 보통 2 % FBS와 미디어를 향해 마이그레이션 할 때 간극 결합 통신에 영향을 미치는 돌연변이 표현형 침공 지수의 증가를 보여 것을 보여 주었다. 이 증가는 숯불 제거 혈청의 교체와 함께 탈락했다. 이 결과에서, 저자들은 결론 지었다 친 유성 분자 향해 돌연변이의 영향이 이주 (구체적으로, 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는) 7. 이곳은 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 및 종양 촉진 및 내습 4에 관련된 신호 전달 경로 매개하는 것으로 알려져있다. 따라서, 과학 연구자가 어떤 요인 (들)이 연구에서 자신의 특정 암 세포 또는 돌연변이 종양 침략을 주도하고 결정하는 것이 중요하다. 성분의 농도 차이에 따라 결정되는 바와 같이 분석은 생리 학적 농도에서의 개별 성분의 역할을 충족하도록 설계 및# 8220; X "정상 FBS와 CS-FBS에서. 이 분석의 개발을 통해, 연구자들은 자신의 시스템에 적용되는 특정 침입 경로에 더 많은 통찰력을 얻을 수 있습니다.
호르몬, 성장 인자, 사이토 카인은 종종 종양 촉진제 (8)으로 분류되어왔다. 이러한 EGF 이러한 요인 중 일부는 침략 챔버 9 화학 유인 물질에 대한 직접 소스로 사용된다. 따라서, 이러한 직접 종양 침윤이 혈청의 주요 구성 요소를 나타내는 것으로 보인다. 이 프로토콜은 조사자가 암세포의 잠재적 침입을 매개 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인의 참여를 평가할 수 종래 내습 시험 관내 분석에 간단하면서도 중요한, 변경을 제안한다. 그러나, 분석은 귀중한 시간 및 R을 사용하지 않도록, 절차는 초기 분석 단계에서 그들의 연구에 효과적인 것인지에 대답 사관을 제공하도록 설계esources 불필요한 것으로 간주합니다. 이 방법은 CS-FBS를 사용하고 잠재적으로 암 세포 침공을 중재 리드 후보로 추구하는 분자있는 상태로 연구자의 판단에 의존한다. 이들 분석의 결과는 혈청 성분이 특정 세포주 또는 돌연변이에 대한 화학 유인 물질 또는 억제제가 연구되고있는 역할을 식별하는 데 유용하다는 것을 증명한다. 또한,이 방법은 조사 홍보 또는 암 세포 침윤을 억제하거나 키 신호 전달 경로를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다; 따라서 미래의 약물 디자인을 연출.
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프로토콜
1. 다른 미디어와 추가 구성 요소를 준비
- 실험에 앞서, 테스트 할 중 정상 FBS를 첨가, 숯 제거 FBS, 또는 숯을 박탈 FBS 플러스 요소와 DMEM 또는 지정된 다른 매체로 구성된 미디어를 준비합니다. 여러 구성 요소가 각각의 실험에서 테스트 할 수 있습니다.
- 칭량 적절 생리적 농도 목탄 스트립 혈청 중에 용해되는 호르몬, 성장 인자, 사이토 카인 또는 희석.
2. 얼음에 콜라겐 매트릭스를 준비합니다
- 200 μL의 10 배 PBS (PH 7.4), 5.4 ㎕의 1 N NaOH를 두 번 증류 H 2 O의 600 μL, 1.2 ml의 콜라겐 I : I는 얼음에 다음 멸균 여과 구성 요소를 추가하여 2.2 ㎎ / ㎖에서 매트릭스 2 ml의 콜라겐을 준비 AT (3.63 ㎎ / ㎖).
- 판 할 준비가 될 때까지 얼음에 콜라겐 I 솔루션을 유지합니다.
3. <분석에 대한 마이그레이션 / 침략 플레이트를 준비/ P>
- 각 세포주가 시험 될 들어 12- 웰 인서트를 포함하는 24 개 웰 플레이트 챔버를 사용한다. 화학 유인 물질 미디어를 추가하고 실험 세트까지의 삽입을 전송하기 위해 삽입을 포함하지 않는 추가 12 우물을 사용합니다.
주 : 세포주 여기 용도 폴리에틸렌 텔레 프탈레이트 (PET) 멤브레인 및 8 ㎛의 공경 플레이트 콜라겐 매트릭스가 최적이다. 단, 프리 코트 번호판 마트 리겔 매트릭스는 세포주가 조사되고 감소에 따른 기공 크기로 치환 할 수있다. - 분명히 (제어, 비 침습적 세포주에 대한 FBS 마이그레이션, CS-FBS 마이그레이션, FBS 침공하고, CS-FBS의 침략뿐만 아니라 FBS 이주) 분석되는 조건 당 3 우물을 사용하여 판 레이블을 지정합니다. 콜라겐이나 마트 리겔 매트릭스를 통해 다음 막에 구멍을 통해 이동하여 PET 막에 구멍을 통해 이동하고, 분석의 침략에 의해 분석 마이그레이션. 각 셀 조건에 대해 다른 색 마커를 사용하여도금 프로세스 ID.
4. 침략 매트릭스를 분배
- 조심스럽게 인서트로 콜라겐 기질 용액 75 μL 침윤 분석에 사용되는 피펫. 거품을 피하기 위해주의해야합니다. 표면에 반전 된 피펫 팁을 적용함으로써 기포를 분산.
- 고화 겔 있도록 30 분 동안 37 ° C, 5 % CO 2 인큐베이터에 콜라겐 코팅 된 플레이트 인서트를 전송합니다.
5. 접시 막 또는 침략 매트릭스 위에 셀
- 한편,를 Trypsinize 세포와 10 % FBS와 미디어를 추가 할 수 있습니다. 스핀 세포 테이블 상단 원심 분리기에 5 분 200 XG에 혈청이없는 배지에서 배를 씻어.
- 무 혈청 배지에서 재현 탁. 혈구 또는 자동 슬라이드 카운터 세포를 계산합니다. 5 × 104 세포 / ml의 최종 농도를 혈청이없는 배지를 추가한다.
- 콜라겐 매트릭스가 (30 분 후) 고체화되면, 매체로의 700 μl를 추가하거나2 % 정의 된 FBS 또는 각 웰에 FBS를 숯 - 제거. 접시 당 12 인서트 :
- 3 인서트는 미디어와 콜라겐과 우물이 + 2 % FBS
- 3 인서트는 미디어와 콜라겐과 우물이 + 2 % CS-FBS
- 3 삽입 미디어 + 2 % FBS와의 콜라겐과 우물이 없습니다
- 3 인서트는 미디어와의 콜라겐과 우물이 없습니다 + 2 % CS-FBS
- 테스트되는 요소의 수와 각 조건에 대응 없음 콜라겐 따라 추가 제어 플레이트를 사용한다.
- 모든 마이그레이션 및 침략 삽입에 삽입 당 500 ㎕의 세포를 도금, 5 × 10 4 세포 / ml의 삽입에 세포 현탁액을 추가합니다.
- 37 ° C에서 22 시간 동안 세포를 품어.
6. 마이그레이션 및 침입하는 세포의 수를 정량화
- 별도의 우물에서 메탄올 정착, 에오신 및 hemotoxylin를 사용하여 우물의 설정 염색.
- 각 우물에서 세포와 매트릭스를 제거하기 위해 면봉을 사용합니다.각 웰에 대한 두 번째 면봉 응용 프로그램과 함께 Rrepeat.
- 집게로, 연속 3 각 솔루션에 각 삽입 1 초 동안 5 번 찍어.
- 인서트 / N을 O를 건조하도록 허용합니다.
- 어느 I) 가장자리 주위에 조심스럽게 절단, 메스 필터를 제거하고 커버 슬립과 침수 오일 슬라이드에 장착, 또는 ⅱ) 인서트 O / N 반전 건조 현미경 직접 삽입을 사용할 수 있습니다.
- 다음 날, 20 배의 목적으로 현미경 슬라이드 또는 삽입을 확인하고 필터의 다른 지역에서 5 이미지를 가져 가라. 일관성을 개선하기 위해 4 외부 필드와 하나의 중심을.
- ImageJ에 소프트웨어를 사용하여 모든 조건에 대한 세포를 계산하고 아래 공식에 적용됩니다.
- 다음과 같이 %의 침공을 결정 :
나는 = 삽입 콜라겐을 통해 침입 세포의 # 평균
제어 삽입을 통해 마이그레이션 세포의 # = B 평균
%의 침략 = (A / B) * 100 - 다음과 같이 2 % FBS의 침략 지수를 결정
세포의 %의 침공 (2 % FBS에서) 분석되고 = C
% (2 % FBS)의 제어 비 침습적 세포의 침윤 = D
내습 지수 (FBS) = (c / d) - 다음과 같이 2 % CS-FBS의 침략 지수를 결정
세포의 %의 침공 = E (2 % CS-FBS에서) 분석되고
%의 (2 % CS-FBS)에서 제어 비 침습적 세포의 침윤 = F
내습 지수 (CS-FBS) = (E / F)
7. 실험 프로토콜 +는 X N 여러 요인이 결합하여 숯불 제거 FBS에 FBS를 숯불 제거 비교
- "X"또는 구성 요소의 조합에 대해 서로 다른 구성 요소를 사용하여 필요에 따라 절차를 여러 번 반복합니다.
- 마이그레이션 및 침략 효과에 대한 각 요인 "X"의 기여를 결정하기 위해 계산을 적용합니다.
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결과
내습 인덱스는 비 침습적 세포주 정규화에 따라 각 조건에 대해 계산된다. 실험을 위해, 우리는 1205Lu 흑색 종 세포주 설립 변이체 안정한 세포주 우리 침습 선으로뿐만 아니라 1205Lu 셀들은 논리적 제어 역할 10 유도되었던 암성 비침 변이체 WM793를 사용한다. 즉 진피의 주성분이기 때문에 또한 내습 행렬로서 콜라겐 I를 이용한다. 최적 내습 행렬 세포주에 기초하여 생체와의 일치의 정도가 달라 결과 11있다 이는 이전의 연구와 일치한다. 이 침공 분석은 연구자가 얻을 수있는 가능한 결과에 따라 개략적으로 설명되어 있습니다. 처음에는 2 % FBS의 침공 지수는이 분석 (그림 1, 2)을 추구하기 위해 CS-FBS에 대한 침략 지수보다 훨씬 더 높거나 낮을 수 있어야합니다. 중요한 증분 경우완화 또는 침공 지수의 감소가 숯불 제거 FBS와 명백하다,이 분석은 연구자 (그림 2 및 3) 유용하지 않습니...
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토론
종양의 전이는 다단계 과정이다. 세포 기저막을 뚫고 그들이 원위부로 이송되는 림프계 또는 혈액 중 미세 혈관 내로 intravasate한다. 종양 세포를 extravasate 및 12에 정착하는 macrometastasis. 중간 엽 전이 (EMT), 종양의 침윤과 전이에 상피를 통해 진행이 스테로이드 호르몬 13, 14로 향상되었습니다, 성장은 15 ~ 18, 사이토 카인 19-21 요인. 이들 분자는 분석의 발전은 종양 침윤성 전위의 역할을 해결한다는 복잡한 신호 전달 경로를 해독하기위한 중요한 단계이며, 종양 진행의 신호 전달 경로를 해결하는 매우 중요하다.
이 종양 세포가 이주되는 구동력을 식별하는 것을 목적으로하기 때문에 숯 막았 혈청을 사용하여 상기 분석은 기존의 방법에 비해 장점을 갖는다. 이전의 분석은있다침략 실에서 일반 차 유방 섬유 아세포를 사용하여 게시되었습니다. 본 연구에서 저...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 뉴욕 버팔로에 있는 D'Youville College School of Pharmacy의 자금 출처를 인정합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 8.0 µ를 사용한 BioCoat Control Inserts; m PET 멤브레인 | Corning | 은 | 2개의 24웰 플레이트에 각각 12개씩 354578. PET = 폴리에틸렌 테라프탈레이트 |
| 콜라겐 I, 쥐 꼬리 | 코닝 | 354236 | 소스 = 쥐 꼬리 힘줄, 순도 = 90% |
| 고착제; Diff-Quick | Thermo Fisher Scientific | NC9844047 | 메탄올 기반 고정제, 헤마톡실린/에오신 |
| 소 태아 혈청 | Life Technologies | 16000 | FBS로 지정 |
| 숯 박탈 소 태아 혈청 | Life Technologies | 12676 | CS-FBS로 지정 |
| 소 태아 혈청 | Thermo Scientific Hyclone | SH30070 | FBS |
| 로 지정숯이 벗겨진 소 태아 혈청 | Thermo Scientific Hyclone | SH30068 | CS-FBS로 지정 |
참고문헌
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