등온 적정 열량 측정 열 흐름이 방출 또는 화학 반응에 흡수. 이 방법은 효소 - 촉매 반응을 정량화하는데 사용될 수있다. 본 논문에서는 악기 설정을위한 프로토콜, 실험 실행 및 데이터 분석은 일반적으로 기술되고, 잭 콩 요소 분해 효소에 의해 가수 분해 효소 요소의 특성에 적용.
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이 논문에서
요약
초록
등온 적정 열량 측정 (ITC)는 열이 거의 모든 화학적 프로세스를 특성화하기 위해 극한 프로브로서 사용하여, 화학 반응 동안 방출 또는 흡수 측정 잘 설명 된 기술이다. 현재에는,이 기술은 광범위 생체 분자 결합 평형의 열역학적 파라미터를 결정하기 위해 적용된다. 또한, ITC가 직접 응용 프로그램이 여전히 underexploited에도 불구하고, 효소 반응의 역학 및 열역학 매개 변수 (K 고양이, K M, ΔH)을 측정 할 수 있도록 입증되었습니다. 열 변화가 자발적 효소 촉매 반응 중에 발생하는 바와 같이, ITC는 분석중인 시스템의 변경이나 표시를 필요로하지 않고, 용액에서 수행 될 수있다. 또한,이 방법은 재료의 작은 금액을 필요로한다. 이러한 속성은 ITC로 다음과 같은 다양한 응용 프로그램, 예를 들어, 약물 발견에 효소 반응 속도를 연구하는, 귀중한 강력하고 독특한 도구합니다.
K 고양이를 결정하기 위해 적용되는 Canavalia의 ensiformis (잭 콩) 요소 분해 효소에 의한 요소의 효소 가수 분해의 K M. 반응의 고유 몰 엔탈피 (ΔH의 INT)의 계산이 수행된다. 얻어진 값은 방법론의 신뢰성을 보여주는, 문헌에보고 이전의 데이터와 일치한다.
서론
생화학 반응의 정량은 삶의 기초에서 생물학적 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 열량은 양적 솔루션의 거의 모든 화학 반응의 특성에 레이블이없는 방법을 제공합니다. 이러한 기술은 열을 방출 또는 시간에 걸쳐 흡수 계측하고, 따라서 보편적 검출 시스템과 반응 분자 (즉, 결합 열역학)뿐만 아니라, 반응 속도 (즉, 반응 속도)을 측정하기위한 양을 정량화하는 매우 편리한 방법이다. 특히, 등온 적정 열량계 (ITC)는 단백질 - 리간드, 단백질 - 단백질, 단백질 - 금속 이온과 단백질-DNA 상호 작용 1-6을 포함, 생명 평형의 열역학 특성에 선택의 방법으로 채택하고있다. 본 출원의 전위가있을지라도 또, 운동 정보를 제공하기 위해 ITC의 능력은 그것의 효소 촉매 작용을 측정하는 매우 강력한 시스템 만든다7-9을 과소 평가.
미카엘리스 상수 (K M) 및 촉매 속도 상수 (k 고양이)는이 운동 매개 변수에 따라, 반응 속도와 기질의 농도 간의 관계를 제공하는 등 미카엘 - 멘텐 방정식 (10)은 효소 반응의 정량적 인 설명이다 . K 고양이는 /....
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프로토콜
1. 준비 샘플
- 효소 용액 2 ㎖ 및 각 실험 실행에 대한 기질 용액 0.5 ㎖를 준비합니다. 기판 첨가하는 동안 희석 및 혼합의 열을 최소화하기 위해 동일한 조성물을 갖는 완충 용액에 효소와 기질의 농축 원액을 희석.
- 실험 기간 동안 pH 변화를 방지하기 위해 적절 버퍼 조건을 선택합니다. 예를 들어, 20 mM의 HEPES 산도 7은 중성 pH의 측정에 적합합니다.
NOTE : 양성자 교환이 관여되는 경우 그들이 반응 ΔH 측정에 영향을 줄 수 있기 때문에, 사용 된 버퍼의 양성자 화 엔탈피가 고려되어야한다. 분석중인 시스템의 버퍼 또는 첨가제 분자의 가능한 특정 효과가 고려되어야한다. 유기 용매 (예 : DMSO)가 효소 용액에 포함되는 경우, 기질 용액에 정확히 동일한 농도에 추가. - M1의 실험 시작nm의 범위에서 효소 농도 (예를 들면 1 NM)와 함께 효소 농도보다와 K M 이상 크기의 적어도 세 순서 높은 기질 농도.
- M2 실험의 경우, PM-nm의 범위에서 효소 농도 (예 : 15시)로 시작합니다. 주사기에서 기질 농도는 mM의 범위 (예를 들면 400 ㎜)이다.....
- 실험 기간 동안 pH 변화를 방지하기 위해 적절 버퍼 조건을 선택합니다. 예를 들어, 20 mM의 HEPES 산도 7은 중성 pH의 측정에 적합합니다.
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결과
요소 분해 효소 (EC 3.5.1.5, 요소 amidohydrolase는) archea, 박테리아, 단세포 진핵 생물과 식물에서 발견 multisubunit 니켈 함유 효소이다. 자발적으로 암모니아 및 수소 나트륨 (식 6) (12)의 두 번째 분자를 제공하기 위해 분해 암모니아, 카르 바 메이트에 요소의 가수 분해를 촉매 유기 질소 광물의 마지막 단계에있는이 단백질의 역할,,.
(6)
이 반응은 인간의 건강과 농업 13 부정적인 영향의 책임이있는 환경의 pH의 전반적인 증가의 원인이됩니다. 식물, 요소 분해 효소의 주요 역할은 아르 기나 파생 요소 (14)로부터 영양소 질소를 재활용하는.......
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토론
기존의 방법과 관련하여 효소 활성을 연구하는 ITC의 의의
결합 평형을 연구의 고전 어플리케이션 이외에, 등온 적정 열량 측정 시스템 수정 또는 라벨링을 요구하지 않고, 프로브로서, 반응의 열을 사용하여 용액의 효소 반응의 특성을 안정적이고 빠른 방법을 제공한다. 운동 파라미터는 고양이 K와 K M은 보통 제품의 형성 (또는 기판 소비) 연속 또는 불연속 분석법에서 모니터링되는 시간 경과 실험의 집합을 통해 얻어진다. 통상적으로, 기판 또는 제품 농도 특성 파장에서 흡광도 또는 형광에 의해 측정된다. 그러나, 대부분의 기판들 및 / 또는 제품은 광학적으로 활성이 아니므로 발색단 또는 형광 반응을 수행하기 위해 포함되어야한다. 다른 방법으로, 분석을 결합측정 된 제품 또 다른 반응을위한 기질 인 촉매의 상품은, 사용될 수있다. 이러한 방법은, 그러나, K M과 K <.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
특수 비료 제품 회사 (SFP)는이 연구에 필요한 자금을 제공하기 위해 인정 받고 있습니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| HEPES | Sigma | H3375 | 물에 용해 및 NaOH |
| TRIZMA-Base | Sigma | T1503 | 물에 용해 및 HCl로 pH 조정 |
| 인산이수소 | Riedel-de-Haen | 4270 | 물에 용해 |
| 인산나트륨 이염기성 | Riedel-de-Haen | 30427 | 물에 |
| 용해 요소Sigma | U4128 | 40°C에서 물에 용해됩니다. C | |
| Canavalia ensiformis urease (type C-3) | Sigma | U0251 | 20 mM HEPES pH 7에 용해하고 -80°C에서 보관; |
| Origin 7.0 | MicroCal(GE Healthcare) | SYS13901 | &NBSP; |
| 기기와 함께 제공되는 | MicroCal (GE Healthcare) | VPViewer2000 1.30.00 |
참고문헌
- Leavitt, S., Freire, E. Direct measurement of protein binding energetics by isothermal titration calorimetry. Curr. Opin. Struct. Biol. 11, 560-566 (2001).
- Ladbury, J. E. Application of isothermal titration calorimetr....
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재인쇄 및 허가
