제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해 시험관 HIV-1 서브 타입 C 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력

요약

HIV-1 발병기전은 바이러스 특성과 숙주 유전적 요인에 의해 정의됩니다. 여기에서는 gag 유전자 염기서열 변이가 바이러스의 체외 복제 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 재현 가능한 측정을 할 수 있는 강력한 방법을 설명합니다.

초록

HIV-1 발병 및 질병 진행에 대한 많은 HLA class I 대립유전자의 보호 효과는 부분적으로 HIV-1 게놈의 보존된 부분을 표적으로 삼는 능력에 기인합니다. 세포 면역 압력에 기인하는 염기서열 변화는 감염 중 게놈 전반에 걸쳐 발생하며, Gag와 같은 게놈의 보존된 영역 내에서 발견되는 경우 바이러스의 체외 복제 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. Gag에서 HLA 불일치 수용자에게 HLA 결합 다형성이 전달되는 것은 설정점 바이러스 부하 감소와 관련이 있습니다. 우리는 이것이 바이러스의 복제 능력이 감소했기 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 여기에서는 HIV-1의 시험관 내 복제를 평가하기 위한 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법은 제한 효소 기반 복제를 사용하여 gag 유전자를 일반적인 아형 C HIV-1 proviral backbone인 MJ4에 삽입합니다. 이는 만성적으로 파생된 개그-프로 염기서열의 체외 복제를 평가한 이전의 재조합 기반 방법보다 아형 C 염기서열 연구에 더 적합합니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 다른 아형의 바이러스 연구를 위해 쉽게 수정될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 CEM 기반 T 세포주에서 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 방법은 149개의 C형 아형이 급성으로 감염된 잠비아인에서 유래한 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 연구에 활용되었으며, 복제에 영향을 미치는 Gag의 잔류물을 식별할 수 있었습니다. 더 중요한 것은 이 기술의 구현으로 바이러스 복제가 설정점 바이러스 부하 및 종적 CD4+ T 세포 감소와 같은 초기 HIV-1 발병의 매개변수를 어떻게 정의하는지에 대한 더 깊은 이해가 촉진되었다는 것입니다.

서론

호스트와 HIV-1 병인과 병의 진행이 합리적인 백신 설계를위한 가장 중요하다 영향을 바이러스의 특성을 모두 결정. 세포 성 면역 반응은 HIV-1 감염에 대한 인간의 면역 반응의 핵심 구성 요소입니다. 세포 독성 T 림프구 (CTL)는 급성 바이러스 혈증의 초기 제어에 필요한, 및 호스트가 정상 상태 (설정치) ^1,2 바이러스 ^부하를 확립 할 수있다. 이 이펙터 세포의 실험 고갈 바이러스 제어 ^3,4의 손실이 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 돌연변이가 바이러스처럼 감염된 세포 ^5-9의 CTL 인식을 파괴하는 바이러스 게놈 내에서 발생 탈출.

특정 HLA 대립 유전자는 낮은 바이러스 부하와 B * 57, B * 27와 B * 81 ^{~ 15를} 포함하여 느린 질병의 진행과 관련이있다. HLA 클래스 I 대립 유전자의 보호 효과의 부분들은 같은 개그 같은 게놈의 기능적 제한 지역을 대상으로한다는 사실에 기인 할 수있다체외 ^16-21에 복제하는 바이러스의 능력을 감소 탈출 돌연변이 선택합니다. 세포 면역 시스템으로부터의 탈출 내가 대립 선택 HLA 클래스의 맥락에서 바이러스에 유익하지만, 이러한 돌연변이의 효과는 HLA-일치하지 않는 ^{22, 23} 개인에게 전송시 호스트에 대한 차등 결과를 초래할 수 있습니다. 따라서, 바이러스 복제 능력에 전송 HLA 관련 탈출 돌연변이의 영향을 이해하는 것은 초기 HIV-1 병인에 대한 우리의 이해를 증진하는 것이 중요 할 것입니다.

많은 진전이 나는 ^24-29을 대립 유전자 특정 HLA 클래스와 연관된 개별 탈출 돌연변이의 피트니스 결함을 식별하고 특성화하기 위해 만든 하였지만, 자연적으로 HIV-1 균주는 HLA-관련 유전자 다형성의 독특하고 복잡한 발자국 가능성이 HLA에서 발생, 한 발생 다른 immunogenetic 배경 ³⁰ - 매개 면역 압력. AP에서revious 분석, Goepfert 등. 88 심하게 감염된 잠비아 유래의 개그 송신 시퀀스에서 HLA-관련 돌연변이의 축적이 설정치 바이러스 부하 ^(31)의 감소와 연관된 것으로 나타났다. 이 HLA-일치하지 않는받는 사람에게 특히 개그에 해로운 탈출 돌연변이의 전송, 임상 적 혜택을 제공하고, 바이러스 복제를 감쇠로 인해 수 있다는 것을 제안했다. 나아가, 이러한 복제 용량, 초기 복제가 차례로 HIV-1 임상 매개 변수와 마지막 단계에 영향을 미칠 수있는 방법으로 전송 된 바이러스의 특성을 정의하는 콘서트에서 작동하는 방법을 복잡 개그 다형성의 조합 자연적으로 발생하는 균주 내에서 공부하는 것이 필수적입니다 병인.

브록 등은. 첫번째 서브 타입 C와 B 모두에서 감염의 만성 감염 단계 및 바이러스 부하 중에 고립 개그 프로 서열의 복제 능력 사이의 링크를 입증32 ~ 35. 이 연구에서 제시하는 실험적인 접근 방식, 만성적으로 감염된 사람에서 파생 된 시퀀스의 체외 복제 능력을 조사하기위한 있지만 적절한은 심하게 감염된 개인 어려운 서브 타입 C에서 HIV-1 증식 및 용량을 공부 할 수있는 여러 가지 기술주의 사항 및 제한 사항이 있습니다. 이 방법은 LAV에서 일부 파생 된 서브 타입 B NL4-3의 프로 바이러스로 인구 기반의 PCR 증폭 시퀀스의 재결합에 의존 연구소는 바이러스 스톡 ^(36)을 적용. 바이러스의 생성은 PCR 증폭 산물과 CEM 기반 T 세포 라인 ^(37)의 공동 형질 감염에 의해 달성 및 델타 개그 프로 NL4-3 DNA를 소화시켰다. 이 방법은 잠재적으로 생체 내에서 바이러스 quasispecies 관련 회수 바이러스 스톡의 성격을 기울이기 때문에 생체 외에서 복제 능력의 측정을 변경, 주 개월의 기간에 걸쳐 바이러스의 파생물을 필요로한다. 이 방법의 난만성적으로 감염된 개인의 다수로부터 다수의 상이한 바이러스 변이체를 복제 효과적으로 증식 및 높은 용량 바이러스를 선택하는 경우, 만성적으로 감염된 개인을 연구하고, 여기서 더 적합한 s의 것은 가능하므로 상당히 노동 집약적이고 아니다. 그러나, 심하게 감염된 개인에서, 일반적으로 1-2 변형이 존재하며, 따라서, 생체 외 선택 압력을 통해 회수 된 바이러스 스톡의 성격을 기울일의 위험을 제거하는, 시험 관내 복제 능력의 더 정확한 평가를 허용한다. 둘째,이 방법은 하위 B 파생 백본으로 서브 타입 C 개그 프로 시퀀스를 재결합이 필요하며, 분석에 백본 호환성 편견을 소개 할 수있다. 이러한 한계로 인해, 다수 서열이 도입 잠재적 인 편견을 극복하기 위해 분석되어야한다.

여기에서 우리는 또 다른 실험 아프로을 설명서브 타입 C 심하게 감염된 개체로부터 유래 된 서열을 연구 적절한 ACH. 우리는 서브 타입 C의 프로 바이러스 백본, MJ4에 HIV-1 아형 C 감염된 개인의 급성 감염 시점에서 파생 된 개그 유전자를 도입하는 제한 효소 기반의 복제 전략을 사용합니다. 개그 유전자를 복제하는의 일반적인 백본 MJ4의 사용은 서브 타입 C 파생 시퀀스의 분석을 위해 매우 중요합니다. MJ4 인해 백본 및 개그 유전자 사이의 하위 호환성에 바이어스를 소개하는 거의 없을 것입니다 따라서 기본 분리 ^38에서 유래하고있다. 프로 바이러스를 293T 세포에 직접 형질 감염 될 구축하고, 클로닝 개그 서열 동일한 클론 바이러스 스톡의 복구를위한 또, 제한 효소 기반 복제를 사용하는 방법은 허용한다.

아래에 제시된 방법은 유도 개그-MJ4 서브 타입 C의 복제 능력을 평가하기위한 높은 처리 방법키메라 바이러스. 293T 세포로 형질 간단하고 바이러스의 회수는 단지 세 일이 걸린다. 관내 복제 용량. 브록 등에 의해 작성된 동일 CEM-CCR5 기반 T 세포 라인 ^(37)을 정량하지만, 성공적인 복제를 위해 필요한 중요한 프로토콜의 수정을 사용 서브 타입 C MJ4 키메라 바이러스. 오히려 PBMC를보다 적절한 T-세포주의 사용은 높은 분석 재현성 테스트되는 서브 타입 C-MJ4의 키메라 바이러스의 다수 허용한다. 마지막으로, 상청액에서 바이러스의 정량화를위한​​ 방사성 표지 된 역전사 효소 분석을 사용하여 시판 P24 ELISA 키트를 사용하는 것보다 더 비용 효율적이다. 또한 동일한 분석 내에서 모두 좋지 높은 복제 바이러스를 검출하고 분리 복제 사이에 미묘한 차이를 검출하기위한 중요한 높은 동적 범위를 제공한다.

결론적으로, 여기에 제시된 방법은 허용하고있다HIV-1 아형 C에서 파생 된 개그 시퀀스의 복제 능력에 대한 심층적 인 연구는 급성 잠비아에서 개인을 감염, 및 서면으로, 또한 C는 인구를 감염 다른 하위 유형을 연구하기 위해 확장 될 수있다. 다른 개그 균주 간의 복제 용량의 변화의 높은 수준이 관찰되었다. 또한, 우리는 3 년 동안 ³⁹ 이상 CD4 + 하락 전송 개그의 복제 용량 및 설정치 바이러스 부하 사이뿐만 아니라와 통계적 연관성을 보여줄 수 있었다. 이러한 결과는 복제, 용량 등의 방법에 전송 된 바이러스의 특성을 공부의 중요성을 강조 초기 감염시 발병에 영향을 미칠 수있는 호스트의 면역 시스템과 상호 작용하고 효과적인 백신 개입뿐만 아니라 치료를 개발하기위한 통합 될 것입니다.

프로토콜

감염에서 HIV-1 개그 유전자의 1 증폭, 냉동 혈장

1. 추출 키트를 사용하여 HIV-1 감염 플라즈마를 해동 140 μL에서 바이러스 성 RNA를 추출합니다.
   1. 가능하면 즉시 RNA 추출이 같은 고정되지 않은 바이러스 성 RNA 최고의 증폭 결과를 얻을 후 cDNA 합성을 진행합니다. 가능하면 이전에 바이러스 성 RNA 추출에 4 ° C에서 1 라운드 DNA 증폭 및 저장소에 대한 PCR 마스터 믹스를 설정합니다.
2. RNA로부터의 cDNA를 역 전사 및 역전사 및 한 단계 RT-PCR의 내열성 DNA 중합 효소를 사용하여 1 라운드 DNA 제품을 증폭.
   1. 실온에서 -80 ° C 냉동고 (동결이 필요한 경우) 간단히 녹여 밖으로 RNA를 가지고하는 것은 다음 차가운 블록에 배치합니다. 마스터 믹스를 45 ㎕의 PCR를 포함하는 각 튜브에 5 ㎕의 RNA 전사는 50 μL의 최종 부피를 얻었다. 즉시 C 냉동고 °에 -80 RNA 샘플을 나머지 놓습니다.
   2. 효소가되면원하는 반응의 수에 대한 각각의 얇은 PCR 증폭 관에 1 차 PCR 마스터 믹스 (표 1A), 분취 액 45 μL에 dded. 샘플 사이의 최소한의 교차 오염을 보장하기 위해 제거 캡을 개별 캡 PCR 튜브를 사용하지해야합니다. 온도에 민감한 RT 효소와 RNA 템플릿을 보호하기 위해 추운 블록에 PCR 튜브를 놓습니다. 참고 : 시료는 적절히 바이러스 quasispecies을 샘플링하기 위해 세중에서 실행되어야합니다. 또한 PCR-misincorporation 도입을 최소화하기 위해 높은 충실도 DNA 중합 효소 생성물을 활용하는 것도 중요하다. 권장 제품에 대한 시약의 목록을 참조하십시오.
   3. RNA 템플릿은 모든 반응 튜브에 첨가 한 후, 표 1B에 기재된 순환기 프로그램을 이용하여 증폭을 위해 열 순환기 PCR 튜브에 옮긴다. 주 :이 증폭 생성물은 PCR 중첩 2 라운드에서 사용될 것이다.
3. 수행 중첩 된 자체DNA의 템플릿으로 첫 라운드 PCR 증폭 (1.2)의 1 μl를 사용하여 응축 라운드 PCR 증폭.
   1. 분취 원하는 반응의 수에 대한 각각의 얇은 PCR 튜브에 2 라운드 PCR 마스터 믹스 (표 2A)의 49 μL. 전사 각 반응 관에 1 라운드 PCR 증폭의 1 ㎕의 50 μL의 최종 부피를 얻었다. 참고 :이 두 번째 라운드 증폭 등의 템플릿 DNA를 제공합니다. 또한 PCR-misincorporation 도입을 최소화하기 위해 매우 높은 충실도 및 교정 기능을 DNA 중합 효소를 이용하는 것이 중요하다. 권장 제품에 대한 시약의 목록을 참조하십시오.
   2. 열 순환기하는 2 라운드 PCR 반응 믹스와 표 2b에 설명 된 실행 프로그램을 전송합니다. 주 : 프로그램의 종료 후, 본 반응의 제품은 제품의 생산을 확인하는 아가로 오스 겔상에서 실행된다.
4. 5 &​​ #에 5 배 로딩 염료의 3 μl를 추가181, 50 ㎕의 2 라운드 반응 볼륨의 리터와 밴드가 해결 될 때까지 UV 형광 DNA 염색을 포함하는 1 % 아가로 오스 - TAE 젤에 120 V에서 실행합니다. 푸른 빛 조명에 1.6 킬로바이트 밴드를 시각화 (그림 1A 참조).
5. DNA 얼룩을 함유하는 1 % 아가 로스-TAE 겔에서 잔여 45 ㎕의 반응 부피를 실행하고 깨끗한 면도날 적절한 밴드를 절제.
   1. , 클레아없는 물에 용출, 겔 정제 키트를 사용하여 겔 슬라이스로부터 DNA를 추출 개별 당 세 개의 긍정적 인 반응을 결합하여, 후속 사용을 위해 -20 ° C에 냉동 제품.

필요한 제한 사이트의 소개에 의한 복제에 대한 2 준비 개그 증폭 산물

1. 긴 터미널 반복 (LTR) MJ4 플라스미드 / 5 'UTR의 일부분을 증폭하기 (표 3 참조).
2. 정화 1.3 킬로바이트 PCR 조명에 대한 제품, 소비세 긍정적 증폭 산물 젤을 시각화하고 이전에 동결기술 (1.4,1.5, 그림 1B 참조).
3. "스플 라이스 - 중첩 확장"을 통해 MJ4 LTR- 개그 증폭 산물을 융합 만들기 PCR (표 4 참조).
4. , 소비세, 시각화 정화하고, 1.4,1.5에서와 같이 3.2 킬로바이트 증폭 산물 (그림 1C 참조) 동결.

MJ4, 서브 타입 C, 감염성 분자 클론에 3 복제 증폭 개그 유전자

1. 1.5 MJ4 플라스미드 ㎍의 50 ° C (표 5A 참조)에서 1.5 시간 동안 BclI (메틸화 구분) 제한 효소와 정제 LTR- 개그 PCR 제품의 1.5 μg 다이제스트.
2. 소화 반응에 NgoMIV의 1 μl를 추가하고 1 시간 동안 37 ° C에서 배양한다.
3. 이전에 내림차순으로 복제를 위해 표시 밴드 반응을 소화 제한에 5 배 로딩 염료를 추가하고 천천히 100 V. 시각화, 소비세에서 1-2 시간 동안 DNA 젤 얼룩을 포함하는 1 % 아가로 오스 - TAE 겔의 총 볼륨을 electrophorese 및 정화ribed (그림 2 참조).
4. 벡터 비율 1 삽입 : 3에서 정제 LTR- 개그 삽입 및 MJ4 벡터 DNA를 이용하여 결찰 반응을 준비합니다. 4 ° C에서 하룻밤 결찰 반응을 품어 (표 (b) 참조).
5. 결찰 제품 JM109 화학적으로 유능한 박테리아를 변환 및 100 μg / ml의 암피실린와 LB 아가 플레이트 상에 확산 22 + 시간 동안 30 ° C에서 성장한다.
   1. 15 분 동안 JM109에게 얼음에 유능한 세포를 해동. 얼음에 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브 및 진정 레이블.
   2. JM109 세포의 나누어지는 50 ~ 100 ㎕를 미리 냉장 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브. 가볍게 섞어 튜브를 가볍게 치면 즉시 얼음에 반환 JM109 세포에 연결 반응의 2.5-5 μl를 추가합니다. 30 분 동안 얼음에 결찰 생성물과 적격 세포를 배양한다.
   3. 열충격 JM109 적격 세포를 45 초 동안 42 ° C의 열 블록의 연결 반응을 포함하고, 적어도 3 분 동안 얼음으로 되돌아 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브.
   4. 각 microcentrifuge 관에 SOC 미디어의 50 μl를 추가 암피실린의 100 μg / ㎖를 첨가하여 실온 LB-한천 플레이트에 전체 변환 반응을 접시.
   5. 30 ° C에서 인큐베이터로 전송 접시와 식민지 명확하게 형성되어 20 시간 동안, 또는 때까지 둡니다.
6. 고립 된 식민지를 선택하고 22 + 시간 동안 30 ° C에서 100 μg / ml의 암피실린와 LB의 4 ㎖에 성장합니다.
7. 15 분 동안 3,200 XG에 문화를 스핀 다운 국물을 부어, 플라스미드 DNA를 추출합니다.
8. 충실도를 복제 확인하기 위해 2 시간 동안 37 ° C에서 소화 이중에 NgoMIV 및 HpaI 제한 효소 미니 프렙 DNA를 잘라. 1 % TAE-아가 로스 겔상에서 분석 (표 5C 참조).
9. 순서는 다음 프라이머를 사용하여 각 플라스미드의 LTR-개그 삽입 지역 : GagInnerF1, GagF2, REV1, Rev3 및 GagR6 (표 6) 시퀀스의 신원을 확인합니다.
10. 인구 시퀀스 데르 얻은 복제 시퀀스를 비교1.5.1에​​서 초기 정제 된 앰플 리콘에서 ived. 주 : 모든 궁극적 관내 복제 표현형은 클로닝 과정 중에 도입 된 백본 에러에 기인하지 못하도록하기 위해서 두 개의 독립적 인 클론의 복제 능력을 평가하는 것이 중요하다.

복제 관할 개그 - MJ4 키메라 바이러스의 4 세대 및 Titering

1. 프린스 등 ^39에 의해 설명 된대로 트랜 스펙 션을 위하여 Fugene HD : 1 비율 4를 사용 293T 세포에 키메라 MJ4 플라스미드 미니 프렙 DNA의 1.5 μg을 형질 전환에 의해 복제 가능 바이러스를 생성합니다.
2. 알 ³⁹ 이하와 프린스 등의 설명에 따라 TZM-BL 세포에 대한 역가 수확 바이러스 주식입니다.
   1. 플레이트 TZM-BL 세포 다음 날에 30-40% 합류 세포 단층을하기 위해 바이러스에 감염 전에 24 시간. 이것은 일반적으로 24 - 웰 플레이트에 웰당 800 ㎕의 총 부피에 5 × ¹⁰⁴ 세포를 첨가함으로써 달성 될 수있다.
   2. 우물에 셀을 추가 한 후, 부드럽게 효율적으로 세포를 배포하기 위해 좌우로 다음 앞으로 뒷면을 24 웰 플레이트를 이동합니다. 소용돌이하지 마십시오 -이 플레이트의 중앙에 축적 세포에서 발생합니다.
   3. 다음 일, DMEM에 1 % FBS를 준비; 이 DEAE-덱스 트란을 희석하고 바이러스 축적량을 희석하는 데 사용된다. DEAE-덱스 트란 콘텐츠는 10 ㎎ / ㎖ 또는 125x, 80 μg / ㎖ 또는 1X이 요구되는 최종 농도이다.
   4. 바이러스 주식을 꺼내 것은 실온에서 해동 통에 -80 ° C 냉동고 및 장소에서 테스트 할 수 있습니다.
   5. 멀티 채널 피펫을 사용하여 연속적으로 둥근 바닥 조직 배양에 바이러스 주식을 희석는 뚜껑을 96 웰 플레이트를 처리 하였다. 이 세 배 희석 프로토콜입니다. 희석 방식은 표 7을 참조하십시오.
   6. 확인 세포 단층을 방해하지 만드는 진공 흡입기를 사용하여 시드 TZM-BL 24 웰 플레이트에서 용지를 제거합니다. 한 번에 하나의 24 웰 플레이트에서 매체를 제거 세포 않도록건조하지.
   7. 각 웰 1,000 μL 피펫을 사용하여 DMEM 혼합물에 1 배 DEAE-덱스 트란 + 1 % FBS 150 μl를 추가합니다. 이 단층을 방해으로 반복 피펫을 사용하지 마십시오.
   8. 적절한 아니라 각 바이러스 희석 150 μl를 추가합니다. 웰의 중심에 바이러스를 첨가하고 균일하게 세포 단층에 걸쳐 바이러스를 분산 부드럽게 소용돌이 친다. 37 ° C에서 조직 문화 인큐베이터에서 2 시간 5 % CO _2에 감염된 세포를 품어.
   9. 2 시간 배양 한 후, 각 웰에 DMEM에 0.5 ㎖의 10 % FBS를 추가하고 추가로 48 시간 동안 인큐베이터에 번호판을 반환합니다.
   10. 48 시간 후, 세포를 100 % 융합 성이어야한다. MJ4는 복제 가능 바이러스이기 때문에, 거기에 어떤 세포 사멸 수 있지만이 예상 될 것이다.
   11. 각에서 미디어를 잘 제거하고 400 μL / 웰 솔루션 (레시피 표 8A 참조) 고정으로 추가합니다. 한 번에 하나의 플레이트를 고정합니다. 1000 μL 피펫을 사용하여 솔루션을 고정 추가하고 5 분에서 방치실내 온도.
   12. 정착액을 제거하고 ^칼슘 / 마그네슘 ^{2 +와} PBS로 3 회 씻는다. 부드럽게 단층을 방해하지 않도록 잘의 측면에 PBS를 추가 물총 병을 사용합니다. 셋째 세척 한 후, 흡수 종이에 접시를 건조시킨다.
   13. 400 μL / 웰의 24 웰 플레이트의 각 웰에 염색 용액 (레시피 표 8B 참조), 그리고 최소 2 시간 동안 37 ° C에서 배양 추가합니다. 긴 배양 시간은 허용하지만, 배양 시간은 titering 실험 사이의 일관성 유지되어야한다.
   14. 워시 ^{2 +} / 마그네슘 칼슘 ^2와 PBS로 2 배 및 감염, 점수 이상 득점 4 ° C에서 PBS와 저장소를 추가합니다. 플레이트 한 단층 수화 유지되는 한, 최대 사일 4 ° C로 유지 될 수있다.
   15. 감염의 점수로 사분면으로 24 웰 플레이트의 우물을 나눌 영구 마커를 사용합니다. 한 번에, 200X의 배율을 사용하여 전체, 시야 내의 모든 청색 셀 카운트잘의 네 사분면의 각.
   16. 다음과 같이 μL 당 전염성 단위를 계산 : / (바이러스가 추가 μL) = IU가 / μL [(# 파란색 셀 / 4) 67 X]를 선택합니다. 각 웰에 첨가 바이러스 ㎕의 부피 표 8C를 참조하십시오. 평균 몇 우물 함께; 숫자는 정확한 적정 상대적으로 유사해야합니다.

체외 복제 분석을위한 문화 미디어 및 GXR25 세포의 전파의 5 준비

1. GXR25 세포의 전파에 대한 완전한 RPMI (cRPMI)를 준비합니다. 참고 : 최소 4 개월 전에 계획 복제 실험에 문화 GXR25 세포에 매우 중요하다 (표 9 참조).
2. 스플릿 셀 1시 10분 회 주당 유지하고 세포 밀도 ⁶ 10 × ^10월 5일부터 2일까지 × 1 사이 세포 / ml.

GXR25 (CEM-CCR5-GFP)의 개그 - MJ4 키메라의 체외 복제에 6 셀

1. 내가 전에 일그들이 감염 날 대수 증식에 있도록 nfection, 농도 ^{5 ~} 10 × 2-3 간 세포 / ml의 세포를 분할.
2. 감염의 날, C의 냉동고 해동 -80 °에서 바이러스 주식을 제거합니다. 수식을 이용하여 0.05의 감염 다중도에서 5 × ⁵ GXR25 세포를 감염시키기 위해 TZM BL-세포 분석에서 IU / μL 역가에 기초하여 각각의 콘텐츠에서 필요한 바이러스의 양을 계산한다 :
   감염 (μL)에 대한 바이러스의 볼륨 = 1 μL / X IU X 0.05 X 500000
   참고 :이 우리가 테스트 한 바이러스의 모든 대수 성장 단계 결과로 우리는 0.05의 MOI를 선택했습니다. 이는 바이러스가 시험되어야하는 대수 증식을 캡처하는 최적의 MOI를 측정하기 위해 초기 실험을 수행하는 것이 중요하다.
3. 및 V-바닥 조직 배양의 우물에 추가 (0.05 MOI를 달성하기 위하여) 100 μL의 부피 cRPMI에서 바이러스를 희석하여 96 - 웰 플레이트를 처리 하였다. 참고 : positi을 모두 포함복제 실험의 각 세트 (MJ4 WT 감염)과 음 (모의 감염된 세포) 컨트롤을했습니다. 다른 모든 열 우물 사이에 교차 오염을 제한 비어 있도록 판을 설정합니다. 이 실험의 복제물 복제 속도 측정 한 복제 슬로프, 정규화 이후 표준으로 사용되는 바와 같이, 포지티브 제어가 필수적이다.
4. 자동 세포 계수기를 사용하여 세포 GXR25 횟수. 모든 감염 (5 × ^{5 ×} # 1 감염)을 위해 필요한 총 세포 수를 계산한다. 50 ML 원뿔 튜브 및 펠릿 세포 원심 분리기에 필요한 볼륨을 나누어지는. 필요한 것보다 항상 25 % 이상 감염 계산합니다.
5. 5 × ¹⁰⁵ 세포 / 100 ㎕의 농도의 cRPMI 기음에 신중 미디어에 resuspend.
6. 살균 통에 피펫 세포와 철저하게 섞는다. 멀티 채널 피펫을 사용하여, 희석 된 바이러스를 함유하는 96 - 웰 플레이트의 각 웰에 세포를 100 ㎕를 추가한다. 미X 철저.
7. 각 폴리 브렌의 5 ㎎ / ㎖ (100 배) 솔루션 2 μl를 잘 첨가하고 잘 세포를 섞는다.
8. 3 시간 동안 5 % CO ₂ 조직 문화 인큐베이터에서 37 ° C에서 품어.
9. 감염된 세포를 세척하기 위해 원심 분리기 96 웰 V-바닥 판은 세포 펠렛. 그런 다음 조심스럽게 매체의 150 μl를 제거하고 세포 펠렛을 방해하지 않고 cRPMI의 신선한 150 μL로 교체합니다. 충분히 세포를 씻어 원심 분리 (포함) 2 번 더 반복합니다.
10. 마지막 원심 150 μL cRPMI 첨가 한 후, 다 채널 피펫 세포 펠렛을 재현 탁하고 24 - 웰 조직이 잘 cRPMI의 각 웰 독립적 800 μL에서 전체 셀 / 바이러스 혼합물 (약 200 μL)을 추가 배양 접시입니다.
11. 37 ° C에서 5 % CO ₂ 조직 문화 인큐베이터에 넣어 판.
12. 모든 이일은 문화의 표면으로부터 상층 액 100 ㎕를 잘 제거하고 96 웰 U로 전송-bottom 판과 상점은 바이러스 정량 분석​​을 실행 할 때까지 -80 ° C에서 동결. 참고 : 96 - 웰 플레이트에서 상층 액을주의 깊게 배치는 방사성 동위 원소 표지 역전사 효소 (RT) 분석을 통해 비리 정량 동안 배양 상층 액의 멀티 채널 피펫 전송을 허용합니다. 모든 판은 RT 분석 판독에 간 판의 변화를 정상화하기 위해 감염 표준의 샘플을 포함해야합니다.
13. 철저하게 재현 탁 세포에 의해이 나머지 볼륨 (450 μL)의 절반을 제거 : 분할 세포 1을 각각 100 ㎕의 샘플을 제거한 후. 각 웰에 신선한 cRPMI의 550 μl를 추가하여 원래의 볼륨 (1 ml)에 복원합니다.

세포 배양 상층 액의 역전사의 7 분석 (RT)

프로토콜 Ostrowski 등 ^40에서 적응.

1. 방사성 물질과 함께 사용할 수있는 BSL-3 시설에서 생물학적 안전 후드를 설정합니다.
   1. 출동에서 흡수 용지를 배치흡입기에 대한 개발과 대체 흡입기 방사성 용으로 지정된. 참고 : 모든 방사성 폐기물이 제대로 안전 규정에 따라 함께 처리해야합니다.
2. RT 마스터 믹스의 각 1 ㎖의 분취에 ^[33 P α-] dTTP의 10 mCi의 / ㎖와 1 M 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 4 μL의 1-2 μl를 추가합니다 (표 10 및 Ostrowski 등. ^{40 참조).}
3. 조심스럽게 살균 통에 1,000 μL 피펫 및 전송과 RT 마스터 믹스, DTT, 그리고 ^[33 P α-] dTTP 각 1.5 ml의 microcentrifuge 관을 섞는다.
4. 레이블 RT의 25 μl를 96 웰 얇은 벽으로 둘러싸인 PCR 플레이트의 각 웰에 혼합 분배. 참고 : 양성 대조군 (MJ4 WT 감염) 및 음성 대조군 (모의 감염)를위한 공간을 포함합니다.
5. RT 마스터 믹스를 포함하는 PCR 플레이트에 각 상층 액 5 μl를 추가합니다.
6. 접착 호일 커버 PCR 플레이트를 밀봉하고 열 순환기에 37 ° C에서 2 시간 동안 배양한다. 안전을 위해, 린자체 피펫 Amphyl와 팁 이후 방사성 폐기물 처분됩니다 Amphyl 폐기물을 포함하는 작은 용기에 팁, 폐기하십시오.
7. 배양 후, 200 ㎕의 멀티 채널 피펫을 사용하여 호일 커버의 작은 구멍을합니다. 참고 : 피펫 팁 잘 액체를 터치하면 다음 열 또는 행으로 이동하기 전에 팁을 교체합니다.
8. 믹스 샘플 5 배와 DE-81 종이 각 샘플의 양도 5 μL. 공기는 10 분을 건조.
9. 워시 말은 1X SSC (염화나트륨, 시트르산 나트륨)로 5 배, 및 세척 당 5 분간 90 % 에탄올로 한 다음 2X. 공기 건조 할 수 있습니다.
   1. 오점을 포함하고, 5 분 동안 흔들어 충분히 세척 버퍼 (1X SSC 또는 90 %의 EtOH)을 추가, 같은 샌드위치 저장 상자와 같은 별도의 세척 용기의 각 오점을 놓습니다.
   2. 별도의 용기와 반복으로 세척 버퍼를 붓고. 참고 : 처음 3 세척 방사성 고려하고 적절하게 처리해야합니다. 마지막 세척이 정기적으로 폐기 될 수있다.
10. 일단 건조, 자동차efully 사란의 오점 싸서 실온에서 밤새 단단히 밀봉 카세트에 phosphoscreen에 노출 포장.
11. phosphorimager와 phosphoscreens를 분석하고 방사성 성적 증명서를 정량화.
12. OptiQuant 소프트웨어를 사용하여 각 방사성 신호 주위에 원을 그립니다. 복제 곡선을 생성하는 디지털 라이트 단위 (DLU) 값을 그래프.
13. 복제 능력 점수를 생성하기 위해, DLU 값은 로그 ₁₀ -transformed이었고 경사 2, 4 및 6 시간 일 지점을 이용하여 계산 하였다. 복제 슬로프는 다음 순서로 생성 복제 능력 점수에 WT MJ4의 기울기에 의해 분할된다. 그것은 내부 분석 변동을 줄이기 위해 동일한 RT 플레이트로부터 수득 MJ4 WT 값에 기초하여 정규화하는 것이 중요하다.

결과

제대로 완전한 기능, 전염성 개그 - MJ4의 키메라를 조립 할 수있는 프로 바이러스 플라스미드를 생성이 프로토콜을 실행하기 위해 큰 관심은 적절한 PCR 증폭 산물을 생성하기 위해주의해야합니다. PCR은 적절한 크기의 개그 앰플 리콘을 생성 여부를 결정하는 것은 매우 중요합니다. 제품도 1a에 도시 된 약 1,700 bp의 증폭 물 100 염기쌍 (bp의) 내에 있어야합니다. 이 조각의 정확한 길이는 연구중인 개그 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. 다음에, MJ4 분자 클론의 5 '긴 말단 반복 (LTR)는 증폭 부와 후속 클로닝에 적합하게하기 위해 개그 앰플 리콘에 접합되어야한다. MJ4 LTR의 amplicon의 길이는 1,474 bp의이어야한다. 그림 1B는 올바른 밴드 크기가 표시되어있는 대표적인 젤 이미지를 보여줍니다. 스플 라이스 - 중첩 연장 PCR ⁽⁴¹⁾ 후, 결합 LTR-

토론

인해 길이 및이 프로토콜의 기술적 특성상 키메라 개그-MJ4 플라스미드의 성공적인 구조 모두에 중요뿐만 아니라 바이러스 복제 용량의 정량 용으로 여러 가지 방법이 있습니다. 이 프로토콜에 설명 MJ4에 외국 개그 유전자의 도입에 대한 제한 효소 기반의 복제 전략은 이전에 사용 된 재조합 기반 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있지만 중요한 단계가 정확하게 준수하지 않을 경우, 프로토콜은 기술적으로 문제가 될 수 있습니다.

첫째, DCM 및 댐 DNA의 methylases 결여 유능한 균주 생성 된 MJ4 플라스미드 DNA를 사용하는 것이 절대적으로 필수적이다. 이것은 MJ4 백본에 개그 유전자를 복제하는 데 사용되는 BclI의 제한 효소의 효소 활성 등 필요 댐 / DCM 메틸화를 구분합니다. JM110와 SCS110 (ENDA 부정적인 JM110 유도체) E. 대장균 균주MJ4 메틸화 플라스미드 DNA를 생성하기에 적합한 재. ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
PCR 시약
GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3'	IDT DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCCA 3'IDT	DNA	맞춤형 올리고	25 nmol, 표준 탈염
CoolRack PCR 96 XT	살생물	BCS-529
CoolRack M15	살생물	BCS-125
뉴클레아제 자유 물	피셔	SH30538FS	Hyclone
QIA에서 제조한 바이러스 RNA 미니 키트	Qiagen	52906
Simport PCR 8 스트립 튜브, 파란색(플랫 캡)	Daigger	EF3647BX
SuperScript III 원스텝 RT-PCR 시스템	Life Technologies/Invitrogen	12574035
Phusion Hot-start II DNA 중합효소	Fisher	F-549L
PCR 뉴클레오티드	Roche	4638956001
Agarose, 높은 젤 강도	Fisher	50-213-128
TAE 10X	Life Technologies/Invitrogen	AM9869
Promega 1kb DNA ladder	Fisher	PRG5711	Promega
Sybr Safe DNA Gel Stain, 10,000x	Life Technologies/Invitrogen	S33102
Wizard SV Gel 및 PCR 클린업 시스템	Promega	A9282
면도날, Surgical	에서 제조한	Fisher	12-640
PTC-200	MJ Research
Microbiology & 클로닝 시약
LB 한천, Miller	Fisher	BP1425-2
LB 육수, Lennox	Fisher	BP1427-2
멸균 100 x 15 mm 폴리스티렌 페트리 접시	Fisher	08-757-12
암피실린 나트륨 염	Sigma-Aldrich	A9518-5G
Falcon 14 ml 폴리프로필렌 둥근 바닥 튜브	BD Biosciences
MIV 제한 엔도뉴클레아제	New England BioLabs	R0564L
BclI 제한 엔도뉴클레아제	New England BioLabs	R0160L
HpaI 제한 엔도뉴클레아제	New England BioLabs	R0105L
T4 DNA 리가제, 5 U/μ l	Roche	10799009001
JM109 유능 셀, >108 cfu/μ g	Promega	L2001
PureYield 플라스미드 미니프렙 시스템	Promega	A1222
Safe Imager 2.0 Blue Light Transilluminator	Invitrogen	G6600
Microfuge 18 centrifuge	Beckman Coulter	367160
Cell Culture Reagents
Amphyl cleaner/disinfectant	Fisher	22-030-394
Fugene HD, 1 ml	VWR	PAE2311	Promega
Hexadimethrine bromide (Polybrene)	Sigma-Aldrich	H9268-5G
Costar 플레이트, 6-well, flat	Fisher	07-200-83	Corning Life Costar
Plates, 24-well, flat	Fisher	07-200-84	Corning Life 제조
Costar 플레이트, 96-well, 라운드	Fisher	07-200-95	Corning Life
Flasks 제조, Corning 필터 상단/경사 넥, 75 cm2	Fisher	10-126-37
플라스크, Corning 필터 상단/경사 넥, 150 cm2	Fisher	10-126-34	Corning Life
Conical Tubes에서 제조, 50 ml, 파란색 캡	Fisher	14-432-22	BD Biosciences
Conical Tubes에서 제조, 15 ml, 파란색 캡	Fisher	14-959-70C	BD Biosciences
제조 Trypsin-EDTA	Fisher	MT25052CI	Mediatech
RPMI에서 제조, 500 ml	Life Technologies/Invitrogen	11875-119
DMEM, 500 ml	Life Technologies/Invitrogen	11965-118
Penicillin/ 스트렙토마이신/글루타민, 마그네슘 및 칼슘이 포함된 100x	Life Technologies/Invitrogen	10378-016
PBS, 마그네슘 및 칼슘이 없는 500ml	Life Technologies/Invitrogen	14040-133
PBS Life	Technologies/Invitrogen	20012-050
Sarstedt 튜브, 다양한 색상	Sarstedt	72.694.996
저장소 트레이 멀티 채널, 55 ml	Fisher	13-681-501
DEAE-Dextran	Fisher	NC9691007
Corning 96 웰 클리어 V 바닥 조직 배양 처리 마이크로 플레이트	Fisher	07-200-96	Corning Life
HEPES에서 제조, 1 M 버퍼 솔루션	Life Technologies / Invitrogen	15630-080
FBS, 정의, 500 ml	Fisher	SH30070 03
X-gal	VWR	PAV3941	Promega
Glutaraldehyde, Grade II, H2O 25%	Sigma-Aldrich	G6257-100ML
1 M 염화마그네슘 용액	Sigma-Aldrich	M1028-100ML
포름알데히드 용액, 분자 생물학용, 36.5%	Sigma-Aldrich	F8775-500ML
칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물	시그마-알드리치	P9387-100G
칼륨 헥사시아노페레이트(III)	시그마-알드리치	P8131-100G
알레그라 X15-R 원심분리기	벡크만 쿨터	392932
TC10 자동 세포 계수기	Bio-Rad	1450001
VistaVision 도립 현미경	VWR
Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents
dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi	Perkin-Elmer	NEG605H001MC
1 M Tris-Cl, pH 8.0	Life Technologies/Invitrogen	15568025	을 사용하여 pH 7.8로 조정해야 합니다
	AM9640G	.	1 M 용액
0.5 M EDTA	Life Technologies/Invitrogen	15575-020
Nonidet P40	Roche	11333941103
Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt	미들랜드 시약 (주)	P-3001
Oligo d(T) 프라이머	Life Technologies/Invitrogen	18418-012
디티오트레이톨(DTT)	시그마-알드리치	43815-1G
SR, 초고해상도 인광체 스크린, 소형	Perkin-Elmer	7001485
Corning Costar Thermowell 96웰 플레이트 모델(M) 폴리카보네이	Fisher	07-200-245	Corning Life에서 제조
Corning 96-well Microplate 알루미늄 밀봉 테이프, 비멸균	Fisher	07-200-684	Corning Life
제조 DE-81 음이온 교환지	Whatman	3658-915
Trisodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	S1804-1KG
Sodium Chloride	Fisher	S671-3
Autoradiography cassette	Fisher	FB-CA-810
사이클론 스토리지 형광체 스크린	Packard