HIV-1 발병기전은 바이러스 특성과 숙주 유전적 요인에 의해 정의됩니다. 여기에서는 gag 유전자 염기서열 변이가 바이러스의 체외 복제 능력에 미치는 영향을 평가하기 위해 재현 가능한 측정을 할 수 있는 강력한 방법을 설명합니다.
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방법 논문
제한 효소 기반의 복제 방법을 평가하기 위해
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
HIV-1 발병 및 질병 진행에 대한 많은 HLA class I 대립유전자의 보호 효과는 부분적으로 HIV-1 게놈의 보존된 부분을 표적으로 삼는 능력에 기인합니다. 세포 면역 압력에 기인하는 염기서열 변화는 감염 중 게놈 전반에 걸쳐 발생하며, Gag와 같은 게놈의 보존된 영역 내에서 발견되는 경우 바이러스의 체외 복제 능력에 영향을 미칠 수 있습니다. Gag에서 HLA 불일치 수용자에게 HLA 결합 다형성이 전달되는 것은 설정점 바이러스 부하 감소와 관련이 있습니다. 우리는 이것이 바이러스의 복제 능력이 감소했기 때문일 수 있다는 가설을 세웠습니다. 여기에서는 HIV-1의 시험관 내 복제를 평가하기 위한 새로운 방법을 제시합니다. 이 방법은 제한 효소 기반 복제를 사용하여 gag 유전자를 일반적인 아형 C HIV-1 proviral backbone인 MJ4에 삽입합니다. 이는 만성적으로 파생된 개그-프로 염기서열의 체외 복제를 평가한 이전의 재조합 기반 방법보다 아형 C 염기서열 연구에 더 적합합니다. 그럼에도 불구하고, 이 프로토콜은 다른 아형의 바이러스 연구를 위해 쉽게 수정될 수 있습니다. 또한 이 프로토콜은 CEM 기반 T 세포주에서 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 복제 능력을 평가하기 위한 강력하고 재현 가능한 방법을 자세히 설명합니다. 이 방법은 149개의 C형 아형이 급성으로 감염된 잠비아인에서 유래한 Gag-MJ4 키메라 바이러스의 연구에 활용되었으며, 복제에 영향을 미치는 Gag의 잔류물을 식별할 수 있었습니다. 더 중요한 것은 이 기술의 구현으로 바이러스 복제가 설정점 바이러스 부하 및 종적 CD4+ T 세포 감소와 같은 초기 HIV-1 발병의 매개변수를 어떻게 정의하는지에 대한 더 깊은 이해가 촉진되었다는 것입니다.
서론
호스트와 HIV-1 병인과 병의 진행이 합리적인 백신 설계를위한 가장 중요하다 영향을 바이러스의 특성을 모두 결정. 세포 성 면역 반응은 HIV-1 감염에 대한 인간의 면역 반응의 핵심 구성 요소입니다. 세포 독성 T 림프구 (CTL)는 급성 바이러스 혈증의 초기 제어에 필요한, 및 호스트가 정상 상태 (설정치) 1,2 바이러스 부하를 확립 할 수있다. 이 이펙터 세포의 실험 고갈 바이러스 제어 3,4의 손실이 발생합니다. 그럼에도 불구하고, 돌연변이가 바이러스처럼 감염된 세포 5-9의 CTL 인식을 파괴하는 바이러스 게놈 내에서 발생 탈출.
특정 HLA 대립 유전자는 낮은 바이러스 부하와 B * 57, B * 27와 B * 81 ~ 15를 포함하여 느린 질병의 진행과 관련이있다. HLA 클래스 I 대립 유전자의 보호 효과의 부분들은 같은 개그 같은 게놈의 기능적 제한 지역을 대상으로한다는 사실에 기인 할 수있다체외 16-21에 복제하는 바이러스의 능력을 감소 탈출 돌연변이 선택합니다. 세포 면역 시스템으로부터의 탈출 내가 대립 선택 HLA 클래스의 맥락에서 바이러스에 유익하지만, 이러한 돌연변이의 효과는 ....
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프로토콜
감염에서 HIV-1 개그 유전자의 1 증폭, 냉동 혈장
- 추출 키트를 사용하여 HIV-1 감염 플라즈마를 해동 140 μL에서 바이러스 성 RNA를 추출합니다.
- 가능하면 즉시 RNA 추출이 같은 고정되지 않은 바이러스 성 RNA 최고의 증폭 결과를 얻을 후 cDNA 합성을 진행합니다. 가능하면 이전에 바이러스 성 RNA 추출에 4 ° C에서 1 라운드 DNA 증폭 및 저장소에 대한 PCR 마스터 믹스를 설정합니다.
- RNA로부터의 cDNA를 역 전사 및 역전사 및 한 단계 RT-PCR의 내열성 DNA 중합 효소를 사용하여 1 라운드 DNA 제품을 증폭.
- 실온에서 -80 ° C 냉동고 (동결이 필요한 경우) 간단히 녹여 밖으로 RNA를 가지고하는 것은 다음 차가운 블록에 배치합니다. 마스터 믹스를 45 ㎕의 PCR를 포함하는 각 튜브에 5 ㎕의 RNA 전사는 50 μL의 최종 부피를 얻었다. 즉시 C 냉동고 °에 -80 RNA 샘플을 나머지 놓습니다.
- 효소가되면원하는 반응의 수에 대한 각각의 얇은 PCR 증폭 관에 1 차 PCR 마스터 믹스 (표 1A), 분취 액 45 μL에 dded. 샘플 사이의 최소한의 교차 오염을 보장하기 위해 제거 캡을 ....
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결과
제대로 완전한 기능, 전염성 개그 - MJ4의 키메라를 조립 할 수있는 프로 바이러스 플라스미드를 생성이 프로토콜을 실행하기 위해 큰 관심은 적절한 PCR 증폭 산물을 생성하기 위해주의해야합니다. PCR은 적절한 크기의 개그 앰플 리콘을 생성 여부를 결정하는 것은 매우 중요합니다. 제품도 1a에 도시 된 약 1,700 bp의 증폭 물 100 염기쌍 (bp의) 내에 있어야합니다. 이 조각의 정확한 길이는 연구중인 개그 유전자에 따라 달라질 수 있습니다. 다음에, MJ4 분자 클론의 5 '긴 말단 반복 (LTR)는 증폭 부와 후속 클로닝에 적합하게하기 위해 개그 앰플 리콘에 접합되어야한다. MJ4 LTR의 amplicon의 길이는 1,474 bp의이어야한다. 그림 1B는 올바른 밴드 크기가 표시되어있는 대표적인 젤 이미지를 보여줍니다. 스플 라이스 - 중첩 연장 PCR (41) 후, 결합 LTR-.......
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토론
인해 길이 및이 프로토콜의 기술적 특성상 키메라 개그-MJ4 플라스미드의 성공적인 구조 모두에 중요뿐만 아니라 바이러스 복제 용량의 정량 용으로 여러 가지 방법이 있습니다. 이 프로토콜에 설명 MJ4에 외국 개그 유전자의 도입에 대한 제한 효소 기반의 복제 전략은 이전에 사용 된 재조합 기반 방법에 비해 많은 장점을 가지고 있지만 중요한 단계가 정확하게 준수하지 않을 경우, 프로토콜은 기술적으로 문제가 될 수 있습니다.
첫째, DCM 및 댐 DNA의 methylases 결여 유능한 균주 생성 된 MJ4 플라스미드 DNA를 사용하는 것이 절대적으로 필수적이다. 이것은 MJ4 백본에 개그 유전자를 복제하는 데 사용되는 BclI의 제한 효소의 효소 활성 등 필요 댐 / DCM 메틸화를 구분합니다. JM110와 SCS110 (ENDA 부정적인 JM110 유도체) E. 대장균 균주MJ4 메틸화 플라스미드 DNA를 생성하기에 적합한 재. .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
연구자들은 이 연구에 참여한 잠비아의 모든 자원봉사자들과 이 연구를 가능하게 해준 루사카의 잠비아 에모리 HIV 연구 프로젝트의 모든 직원들에게 감사를 표합니다. 조사관들은 기술 지원과 검체 관리에 대해 Jon Allen, Smita Chavan 및 Mackenzie Hurlston에게 감사의 뜻을 전합니다. 또한 GXR25 세포에 대한 논의와 관대한 기부에 대해 Mark Brockman 박사에게 감사드립니다.
이 연구는 R01 AI64060 및 R37 AI51231(EH) 및 국제 AIDS 백신 이니셔티브의 지원을 받았습니다. 이 작업은 미국 국제개발처(USAID)를 통한 미국 국민의 관대한 지원에 의해 부분적으로 가능했습니다.내용은 연구 저자의 책임이며 반드시 USAID 또는 미국 정부의 견해를 반영하는 것은 아닙니다. 이 연구는 또한 에모리 에이즈 연구 센터(Emory Center for AIDS Research)의 바이러스학 코어(Virology Core, Grant P30 AI050409)의 지원을 받았습니다. DC와 JP는 Action Cycling Fellowships의 일부 지원을 받았습니다. 이 연구는 Yerkes National Primate Research Center 기본 보조금(2P51RR000165-51)의 일부 지....
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| PCR 시약 | |||
| GOF: 5' ATTTGACTAGCGGAGGCTAGAA 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| VifOR: 5' TTCTACGGAGACTCCATGACCC 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| GagInnerF1: 5' AGGCTAGAAGGAGAGAGATG 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| BclIDegRev2: 5' AGTATTTGATCATAYTGYYTYACTTTR 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| MJ4For1b: 5' CGAAATCGGCAAAATCCC 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| MJ4Rev: 5' CCCATCTCTCTCCTTCTAGC 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| BclIRev: 5' TCTATAAGTATTTGATCATACTGTCTT 3' | IDT DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| GagF2: 5' GGGACATCAAGCAGCCAT 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| For3: 5' CTAGGAAAAAGGGCTGTTGGAAATG 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| GagR6: 5' CTGTATCATCTGCTCCTG 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| Rev3: 5' GACAGGGCTATACATTCTTACTAT 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
| Rev1: 5' AATTTTTCCAGCTCCCTGCTTGCCCCA 3'IDT | DNA | 맞춤형 올리고 | 25 nmol, 표준 탈염 |
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| Conical Tubes에서 제조, 15 ml, 파란색 캡 | Fisher | 14-959-70C | BD Biosciences |
| 제조 Trypsin-EDTA | Fisher | MT25052CI | Mediatech |
| RPMI에서 제조, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11875-119 | |
| DMEM, 500 ml | Life Technologies/Invitrogen | 11965-118 | |
| Penicillin/ 스트렙토마이신/글루타민, 마그네슘 및 칼슘이 포함된 100x | Life Technologies/Invitrogen | 10378-016 | |
| PBS, 마그네슘 및 칼슘이 없는 500ml | Life Technologies/Invitrogen | 14040-133 | |
| PBS Life | Technologies/Invitrogen | 20012-050 | |
| Sarstedt 튜브, 다양한 색상 | Sarstedt | 72.694.996 | |
| 저장소 트레이 멀티 채널, 55 ml | Fisher | 13-681-501 | |
| DEAE-Dextran | Fisher | NC9691007 | |
| Corning 96 웰 클리어 V 바닥 조직 배양 처리 마이크로 플레이트 | Fisher | 07-200-96 | Corning Life |
| HEPES에서 제조, 1 M 버퍼 솔루션 | Life Technologies / Invitrogen | 15630-080 | |
| FBS, 정의, 500 ml | Fisher | SH30070 03 | |
| X-gal | VWR | PAV3941 | Promega |
| Glutaraldehyde, Grade II, H2O 25% | Sigma-Aldrich | G6257-100ML | |
| 1 M 염화마그네슘 용액 | Sigma-Aldrich | M1028-100ML | |
| 포름알데히드 용액, 분자 생물학용, 36.5% | Sigma-Aldrich | F8775-500ML | |
| 칼륨 헥사시아노페레이트(II) 삼수화물 | 시그마-알드리치 | P9387-100G | |
| 칼륨 헥사시아노페레이트(III) | 시그마-알드리치 | P8131-100G | |
| 알레그라 X15-R 원심분리기 | 벡크만 쿨터 | 392932 | |
| TC10 자동 세포 계수기 | Bio-Rad | 1450001 | |
| VistaVision 도립 현미경 | VWR | ||
| Reverse-Transcriptase Quantification Assay Reagents | |||
| dTTP, [α-33P]- 3000 Ci/mmol, 10 mCi/ml, 1 mCi | Perkin-Elmer | NEG605H001MC | |
| 1 M Tris-Cl, pH 8.0 | Life Technologies/Invitrogen | 15568025 | 을 사용하여 pH 7.8로 조정해야 합니다 |
| AM9640G | . | 1 M 용액 | |
| 0.5 M EDTA | Life Technologies/Invitrogen | 15575-020 | |
| Nonidet P40 | Roche | 11333941103 | |
| Polyadenylic acid (Poly rA) potassium salt | 미들랜드 시약 (주) | P-3001 | |
| Oligo d(T) 프라이머 | Life Technologies/Invitrogen | 18418-012 | |
| 디티오트레이톨(DTT) | 시그마-알드리치 | 43815-1G | |
| SR, 초고해상도 인광체 스크린, 소형 | Perkin-Elmer | 7001485 | |
| Corning Costar Thermowell 96웰 플레이트 모델(M) 폴리카보네이 | Fisher | 07-200-245 | Corning Life에서 제조 |
| Corning 96-well Microplate 알루미늄 밀봉 테이프, 비멸균 | Fisher | 07-200-684 | Corning Life |
| 제조 DE-81 음이온 교환지 | Whatman | 3658-915 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | S1804-1KG | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-3 | |
| Autoradiography cassette | Fisher | FB-CA-810 | |
| 사이클론 스토리지 형광체 스크린 | Packard |
참고문헌
- Borrow, P., Lewicki, H., Hahn, B. H., Shaw, G. M., Oldstone, M. B. Virus-specific CD8+ cytotoxic T-lymphocyte activity associated with control of viremia in primary human immunodeficiency virus type 1 infection. Journal of virology. 68, 6103-6110 (1994).
- Koup, R. A., et al.
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재인쇄 및 허가
