방법 논문

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

DOI:

10.3791/51510

⸱

2014년 2월 21일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Engineering, University of Michigan, 2Department of Biomedical Engineering, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, Institute for Cellular and Molecular Biology, The University of Texas at Austin, 4Department of Bioengineering, University of California, Berkeley, 5Physical Biosciences Division, Lawrence Berkeley National Laboratory

이 논문에서

요약

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물방울 인터페이스 지질 이중층에 대한 미세 유체 분사는 막 비대칭, 횡단 단백질의 결합, 재료의 캡슐화 제어와 소포를 생성 할 수있는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이 기술은 구획화 된 생체 분자가 소망되는 생물학적 시스템의 다양한 연구에 적용 할 수있다.

초록

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상향식 합성 생물학은 잠재적 생화학 시스템과, 최소한의 생물을 조사하고 재구성을위한 새로운 접근 방식을 제시한다. 이 새로운 필드는 아래에서 위로 복잡한 작동 시스템에 기본적인 생물학적 구성 요소를 설계하고 조립하는 엔지니어, 화학자, 생물 학자, 물리학을 결합한다. 이러한 상향식 (bottom-up) 시스템은 기본적인 생물학적 문의 및 혁신적인 치료 1,2 인공 세포의 개발로 이어질 수 있습니다. 거대한 단일 층 소포 (GUVs는) 때문에 자신의 세포와 같은 막 구조와 크기로 합성 생물학에 대한 모델의 플랫폼 역할을 할 수 있습니다. 미세 유체 분사 또는 microjetting는 제어 크기, 막 조성, 막 횡단 단백질 내장 한 캡슐 3 GUVs의 생성을 허용하는 기술이다. 이 방법의 기본 원리는 현탁 L 변형하는 압전 구동 잉크젯 장치에 의해 생성 된 다수의 고주파수 유체 펄스를 사용하는 것이다GUV에 IPID 이중층. 이 과정은 비누 필름에서 비누 거품을 불고에 가깝다. 분사 용액 감싸는 용액의 조성, 및 / 또는 구성 요소의 구성을 변화시킴으로써 이중층에 포함 연구자 받아서 소포를 만드는이 기술을 적용 할 수있다. 이 논문은 microjetting에 의해 물방울 인터페이스 이중층에서 간단한 소포를 생성하는 절차를 설명합니다.

서론

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그것은 세포 생물학은 분자에서 세포에 대한 우리의 이해를 통합 포함하는 멀티 스케일의 문제가 점점 명백 해졌다. 따라서, 분자가 개별적으로 작동하는 방법을 정확하게 아는 것은 복잡한 세포의 행동을 이해하는 것만으로는 충분하지 않습니다. 이것은 5를 추출 Xenopus의 지질 이중층 소포 4, 유사 분열 스핀들 어셈블리와 액틴 네트워크 상호 작용의 재구성에 의해 예시 된 바와 같이, 부분적으로 다 성분 시스템의 긴급 행동이 존재하는 것이며, 세균 세포 분열 기계 (6)의 공간적 역학. 생명체의 분자 프로세스를 해부의 환원의 접근 방식을 보완하는 방법 중 하나는 생물학적 최소 구성 요소를 사용하여 세포의 행동을 재구성의 반대 접근을하는 것입니다. 이 방법의 중요한 부분은 제한된 양의 생체 분자의 믿을 수있는 캡슐, 세포의 핵심 기능을 포함한다.

e_content "> 여러 가지 전략이 생체 모방 시스템을 공부 생체 분자를 캡슐화 존재한다. 가장 생물학적으로 관련 시스템이 세포의 세포막에 의해 부과 된 생화학 적 및 물리적 제약을 모방. electroformation 7로 거대한 단일 층 소포 (GUVs)의 형성 지질 이중층 막이다, 정제 된 단백질 작업에 문제가 될 수 GUV 세대 14에 가장 널리 사용되는 방법 중 하나는, 일반적으로 높은 소금 버퍼 (8)과의 비 호환성으로 인해 가난한 캡슐화 수율을 가지고 있습니다. Electroformation 또한 많은 양의 샘플이 필요합니다 (> 100 μL), , 비효율적 근접한 지질 층 사이 확산의 어려움으로 인해 큰 분자를 포함한다. 지질 소포를 생성하기위한 여러 가지 미세 유체 접근 방식. W / O (레이어 물 - 기름 - 물 사이에 두 개의 인터페이스를 통해 구성 요소를 전달하는 이중 에멀젼 방법을 개발 한 / W), 할머니의 증발에 의존지질 이중층 형성 9를 구동 할 latile 용매. 기타 지질 이중층 소포 (10) 또는 두 개의 독립적 인 단계 (11)에서의 연속적인 스트림을 생성 미세 조립 라인을 사용했다. 우리는 빠르게 조절 크기, 조성, 및 캡슐화 GUVs 생산하는 액적 인터페이스 이중층 (12)에 대해 유체 펄스를인가에 기초하여 대안적인 기술을 개발했다. 미세 유체 분사로 알려진 우리의 접근 방식은 생물학적 다양한 문제를 조사하는 기능 생체 분자 시스템을 만들기위한 접근 방식을 제공, 기존의 여러 소포 세대​​ 기술의 결합 된 이점을 제공합니다.

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프로토콜

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1. 무한 상공 회의소 제작

  1. 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 (모양의 이름을 딴) 무한대 실을 디자인하고, 레이저 커터와 호환되도록 파일을 저장합니다. 레이저 커터와 투명 아크릴에 1/8- 3 / 16에서 실을 잘라 인치 0.15의 중심 간 거리를이 모양, 직경 0.183의 분리 된 두 개의 원을 만들 수 있습니다. 무한대 모양이 물방울 인터페이스 이중층의 형성과 안정성을 용이하게한다.
  2. 무한 형 웰에 아크릴 챔버의 에지를 통해 1 / 16에서 구멍을 드릴. 반대편에 반복합니다. 가위로 0.2 mm의 아크릴 시트 또는 우물 바닥 역할을 레이저 커터에서 작은 사각형을 잘라.
  3. 0.2 mm 아크릴 한쪽 속건성 접착제의 얇은하지만 완전한 층을 적용하고 상기 챔버의 하부에 접착제. 챔버의 바닥에 단단히 자리에 0.2 mm의 아크릴을 잡고 분배접착제는 밀봉을 생성하지만, 가시 영역을 커버하는 방지 할 수 있도록하는 인터페이스에서의 접착제. 가장자리가 챔버 벽의 가장자리에 닿을 때와 완전히 무한대 실 컷 아웃을 덮도록 아크릴을 정렬해야합니다. 이것은 충분한 제트 침투를 허용하고 잘의 누출을 방지 할 수 있습니다.
  4. 드릴 구멍을 커버하는 천연 고무의 두 개의 작은 조각을 잘라. 구멍 주위 속건성 접착제를 적용합니다. 고정 집게 한 쌍의 모든 영역에 구멍을 누릅니다에 고무를 배치합니다. 두 드릴 구멍을 반복합니다. 누출을 방지하기 위해 모든 접착 연결이 완료 밀봉되어 있는지 확인하십시오.
  5. 바늘 (23) G, 1을 사용하여, 압전 잉크젯 팁의 삽입을 용이하게하기 위해 챔버의 양면에 천연 고무에 구멍을 찌를.

2. 실험 준비

-20 ° C 냉동고에 클로로포름 매장 재고 지질 솔루션입니다. 본 연구의 경우, 1,2 - diphytano 하나일-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DPhPC) 1,2-dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린 (DOPC)을 사용 하였다. 2 ㎖의 25 ㎎ / ㎖ 지질 솔루션은 일반적으로이 프로토콜에 준비하고 -20 ℃에서 저장 될 때 두 달 동안 지속됩니다

  1. N-데칸의 지질을 재현 탁하려면 먼저 작은 유리 항아리에 재고 유리 병에서 전송하고, 아르곤, 질소 하에서 부드럽게 건조. 지질 빨리 건조 할 수 있도록 가스 자세히 표면적을 노출하면서 건조 각도 항아리 잡아.
  2. 약간에 나사 항아리의 뚜껑으로, 건조 된 솔루션은 1 ~ 2 시간 동안 건조기 진공 아래에 앉아 할 수 있습니다. 그런 다음 25 ㎎ / ㎖에서 지질을 resolubilize하려면 n-데칸을 추가합니다. 소용돌이 지질 솔루션 짧게 15 분 동안 목욕 초음파 분쇄기에 초음파 처리. -20 ℃에서 N-데칸의 재구성 지질을 저장
  3. 주식 자당 솔루션을 준비합니다. 1.5 ML microcentrifuge 관에 300 밀리미터 자당의 900 μL, 100 μL를 추가1 % 메틸 셀룰로오스 (MC)의. 메틸 셀룰로오스는 분사에 도움 용액의 점도를 증가 추가됩니다. 선택 단계 : 각각 이미지에 더 많은 대비 또는 형광을 빌려 어두운 색의 식품 염료 또는 형광 구슬의 선택 1 μl를 추가합니다. 이 용액은 세포 삼투압 일치하고 microjetting 중에 콘트라스트를 제공하도록 설계 300 mOsm 자당 용액이다.
  4. 일회용 1 ㎖ 플라스틱 주사기로 솔루션을 그립니다. 끝이 위쪽으로 향하도록 주사기를 들고 있지만, 끝을 향해 모든 거품을 추방하기 위해 반복적으로 샤프트를 가볍게하고, 갇힌 공기를 배출하는 플런저를 밀어 넣습니다. 이 분사에 대한 책임 적절한 압전 수축을 방해하므로, 진행하기 전에 주사기에서 모든 공기를 대피해야합니다.
  5. 주사기의 단부에 0.22 ㎛의 필터를 설치. 필터에 포집되는 공기를 방지하기 위해 수직으로 주사기를 잡고 물방울이 팁 위에 형성 될 때까지 플런저를 밀어 넣습니다. 참고 :33mm 직경의 주사기 필터 유닛은 가장 잘 작동하는 것으로 확인되었지만, 3mm 직경 주사기 필터의 소형 대체 필터는 데드 볼륨을 줄이기 위해 사용될 수있다.
  6. 잉크젯의 여성 루어 어댑터를 풉니 다, 안전하게 필터의 말을 통해 장소에 키를 누릅니다. 또, 공기를 포집 방지하기 위해 유체를 꺼냅니다. 잉크젯의 상단에 고정합니다. 그것은 완전히 부착 한 후 유체는 잉크젯의 끝을 이동해야합니다.

3. 장비를 준비하고

  1. V-클램프를 사용하여, 현미경 스테이지 주사기 장착 조립체. 잉크젯 컨트롤러에 잉크젯에서 와이어를 연결합니다. 참고 : 지정 단계는이 프로토콜에 대한 지어진; 스테이지 디자인이 사용자에 의해 결정될 수 있지만, 주사기 및 샘플 홀더의 XY 제어 독립적 XYZ 컨트롤을하는 것이 중요하다.
  2. 원하는 영상을 달성하기 위해 확대하고 필요한 렌즈의 조합을 결정합니다. 여기에 10 배 목표와 10 배의 접안 렌즈가 사용됩니다.
  3. 분사 및 소포 생성을 시각화하기 위해 고속 카메라 (≥ 1,000 fps)를 사용합니다. 이전 영상에 필요한 카메라 보정을 수행합니다. 이미지 캡처를 시작하기 위해 카메라 소프트웨어 내에서 이미지 기반의 자동 트리거를 사용합니다.
  4. 현미경 무대에 무한 챔버를 탑재합니다. 무대에서 제자리에 테이핑에 의해 챔버를 고정합니다.
  5. 조심스럽게 천연 고무에 구멍 구멍 (그림 1b 참조) 잉크젯 끝을 맞 춥니 다. 이렇게하려면 챔버에 가까운 잉크젯을 가져와 눈에 의해 위치를 조정하려면 다음 현미경 렌즈를 통해보다 정확한 조정. 거친 움직임 잉크젯 팁을 손상시킬 수 있으므로, 조심스럽게 진행합니다.
  6. 잉크젯가 정렬되면, 웰의 로딩 중에 잉크젯 손상을 방지하기 위하여 멀리 챔버로부터 주사기 조립체 백. 이 막에있는 구멍과 정렬 유지되도록 잉크젯의 움직임은 단방향 있는지 확인합니다.
  7. plun에 부드럽게 누르십시오잉크젯 노즐의 작은 액적 형성 될 때까지 주사기 조립체의 GER. 이것은 몇 가지 초기 배압을 제공 할 것입니다.
  8. 입력 분사 매개 변수를 설정합니다. 사다리꼴 바이폴라 파 들어, 다음과 같은 매개 변수 사용 : 20 kHz의 펄스 주파수 3 마이크로 초 상승 시간, 35 마이크로 초 펄스 지속 시간, 3 μsec는 하강 시간, 65 V의인가 전압 (펄스 진폭) 및 트리거 당 100 분사 펄스 (펄스 수) . 그러나,인가 전압 (펄스 진폭)과 펄스 수 (트리거 당 분사 펄스) 소포 크기를 제어하기 위해 변할 수있다.

4. 소포 세대

  1. 두 우물의 전체 표면을 덮고, 무한대 실에 N-데칸에 현탁 25 ~ 30 ㎕의 지질 솔루션을 추가합니다.
  2. 잘 하나, 피펫 천천히 부드럽게의 바깥 쪽 가장자리 (자당 솔루션과 같은 삼투압의) 25 μL의 포도당을 추가합니다. 포도당 및 지질 용액을 혼합하지 않기 때문에, 성막시, 글루코오스 방울 형성​​한다. 추가 다른 251, 또 다른 배달을 5 ~ 10 분 이내에 챔버의 중앙에있는 지질 이중층 막을 형성 할 것이다 반대 아니라, 포도당의 L.
  3. 천연 고무를 통해 잉크젯를 삽입하고 조심스럽게 방울 인터페이스 이중층을 향해 안내합니다. 소개 잉크젯 볼륨을 치환하고 이중층 파열 수, 천천히 이중층 접근.
  4. 잉크젯 ~ 200 ㎛ 이내 인 경우, 단계 3.8에 설명 된 설정을 사용하여 분사를 적용합니다. 이중층에서의 거리가 다른 매개 변수들 사이의 전압 펄스 수에 따라 주로 다를 수 있습니다. 이 프로토콜은 천천히 설정 (전압 펄스 수)을 증가시키고, 이중층의 변형을 관찰하는 것이 좋습니다.

5. 장비를 청소

  1. 현미경 단계에서 주사기 어셈블리를 분리하고, 1 ㎖의 플라스틱 주사기 필터 처리.
  2. 잉크젯을 청소하려면 solutio의 끝을 찍기 위해 다음과 같은 솔루션을 대기음N 7 배 각 : 따뜻한 물, 70 % 에탄올 및 DDH 2 O.에서 70 % 에탄올, 2 % Neutrad 솔루션 잉크젯 흡인 피펫에 안전하게 맞지 않으면 어댑터를 형성하기 위해 피펫 팁을 잘라.
  3. 티슈로 챔버를 건조. 5 ~ 10 분 동안 2 % V / V의 따뜻한 물에 Neutrad 및 초음파 처리와 함께 250 ㎖의 비이커에 무한대 실을 배치합니다. 초음파 후, 철저하게 압축 공기에서 우물을 건조. 웰에있는 습기는 지질 이중층 막 안정성을 손상시킬 수 있으므로, 또한 챔버가 15 분 동안 60 ° C의 오븐에서 배치되는 것이 추천된다.

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결과

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우리는 기계 가공 부품 및 수동 마이크로 미터에서 조립 된 사용자 정의 단계 (그림 1)와 기존의 거꾸로 형광 현미경의 미세 유체 분사 설치를 조립했다. 잉크젯의 특성은 소포의 생성 과정에 대한 통찰력을 제공합니다. 잉크젯 노즐 및 지질 이중층 사이의 거리를 변화하는 힘이 멤브레인의 변형을 야기하기 위해 적용에 영향을 미친다. 이중층에 근접는 제트 기류 초점을 맞추고 멀리 소포 세대​​의 관점에서 에너지를 분산에서 막을 수 없습니다. 와류 여행 예상치 (도 2)과 일치 압전 액츄에이터에인가되는 전압이 증가한다. 소포 형성 및 대표 소체는도 3에 도시되어 분사.도 3a는 microjetting 의해 소포 형성을위한 대표적인 이미지 시퀀스를 나타낸다. 형성 후, 소포 안정성 소포 diamete로 변화하는 경향R, 작은 소포는 안정 있었던 곳.

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토론

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대부분의 기술은 electroformation, 에멀젼, 비말 세대 14-16를 포함, 소포 생성을 위해 개발되었다. 그러나 새로운 실험 기술은 생명체에 성장 유사성 생물학적 시스템의 설계를 허용 할 필요합니다. 특히 미세 유체 방법은 가까운 생물학 소포 모델을 가져, 막 unilamellarity 크기의 단 분산, 내부 내용 (17, 18)을 관리하는 컨트롤의 증가 수준을 제안했다. 또한, 미세 유체 분사를 사용하여 특성과 실험 효과 중심의 막 단백질의 결합, 막 비대칭, 캡슐화 3,13을 보여 주었다.

이 기술은 간단하지만주의가 이동해야합니다 몇 가지 단계가 포함되어 있습니다. 아크릴 시트와 천연 고무는 모두 제조시 무한대 실에 완전한 밀봉을 형성해야합니다. 그렇지 않으면, 무한대 모양의 우물 누출 R 것입니다ISK 이중층 안정성. 실험 준비를하는 동안, 연구원은 초기에 각 구성 요소를 연결 한 후, 전체 공기의 ...

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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우리는 microjetting 매개 변수에 대한 조언 버클리 캘리포니아 대학의 플레처 연구소에서 마이크 Vahey 감사합니다. 이 작품은 NIH 보조금 HL117748 DP2-01가 후원했다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
압전 잉크젯MicroFab TechnologiesMJ-AL-01-xxxxxx는 오리피스 직경(미크론
Jet Drive III 컨트롤러MicroFab TechnologiesCT-M3-02
고속 카메라Vision ResearchMiroEX2
DPhPC 클로로포름 지질Avanti850356C에 담긴 작은 부분 표본으로 주문
필터, 0.2 &마이크로; mFisher ScientificSLGV033RS
1ml 주사기Fisher Scientific14823434
n-DecaneAcros Organics111871000
GlucoseAcros Organics410950010
SucroseSigma-AldrichS7903-1KG
MethylcelluloseFisher ScientificNC9084958
1/8 인치 아크릴McMaster Carr8560K239CAD 디자인은 요청에 따라 제공됩니다.
0.2 mm 아크릴Astra 제품Clarex clear 001
아크릴 시멘트TAP Plastics10693
Loctite 495 SuperglueFisher ScientificNC9011323
Loctite 3494 UV 강화 접착제스트로벨 공급30765
천연 고무McMaster Carr85995K14
사용자 정의 무대수제N / ACAD 디자인은 요청시 제공됩니다
)을 나타냅니다. 바이알 33mm PVDF.

참고문헌

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