자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포 배양 시스템을 구축하는 것은 이전의 연구 목표의 광대 한 배열을 추구하는 귀중한 생물 기술과 중요한 단계입니다. 여기서 우리는 인간의 환자의 수술 적 절제술 자궁 내막 조직에서 기질 문화를 설정하는 데 사용되는 두 가지 방법을 설명합니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
방법 논문
자궁 적출술 검체에서 차 인간의 자궁 내막 기질 세포를 구축하는 두 가지 방법
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
많은 노력이 체외 세포 배양 시스템의 구축에 전념하고 있습니다. 이러한 시스템은 생체 내 프로세스의 광대 한 번호를 모델로 설계되어 있습니다. 인간의 자궁 내막 샘플에서 발생하는 세포 배양 시스템도 예외는 아니다. 응용 프로그램은 정상적인 생리주기 프로세스에서 같은 부인과 암, 감염성 질환, 생식 결함으로 자궁 내막 병변의 범위. 여기, 우리는 수술 절제 자궁 적출술 검체에서 기본 자궁 내막 기질 세포를 확립하기위한 두 가지 방법을 제공합니다. 첫 번째 방법은 "스크래핑 방법"이라하고 두 번째 방법은 칭했다 반면 수술 또는 면도날을 사용하여 기계적 스크래핑 통합되는 "트립신 방법."이 후자의 방법은 세포의 분리 및 일차 홍보 트립신 효소 활성을 사용 세포 가지. 우리는 디지털 이미지와 현미경을 통해 단계별 방법을 설명한다. 우리는 또한 제공하기양적 실시간 중합 효소 연쇄 반응 (qPCR에) 및 면역 (IF)를 통해 자궁 내막 기질 세포 라인의 유효성을 검사하는 전자의 예입니다.
서론
인간의 자궁 체부는 세 개의 층, perimetrium (또는 장막), 자궁 근층 및 자궁 내막으로 구성되어 있습니다. 이들 층의 각각을 구별하는 것은 내막 세포주를 확립하는 중요한 단계이다. perimetrium은 자궁의 가장 바깥 층과 얇은 장액 세포로 구성. 근육층은 두꺼운 중간 자궁의 층과 평활근 세포로 구성된다. 자궁 내막은 자궁의 내부 층으로 식별하고 상피 및 간질 세포 집단을 포함한다.
자궁 내막은 또한 그 줄기 세포 인구는 약 28 일마다 1 functionalis 층을 다시 채울 가설 basalis 층으로 구분된다. 인간의 자궁 내막의 functionalis 층 호르몬 순환에 대한 응답으로 중요한 생화학 적 및 형태 학적 변화를 겪는다. 이 호르몬은 뇌하수체와 난소에서 파생됩니다.
생식주기의 조정 생산 및 호르몬 결과의 릴리스. 생식주기는 잠재적 인 배아 주입 이벤트에 대한 내막을 준비하도록 설계되었습니다. 인간의 생식주기는 "월경주기"라고하며 다음과 같은 세 가지 단계로 구분 - 증식, 분비, 월경. 분비 단계가 functionalis 성숙에 의해 표시되는 반면 증식 단계는 functionalis 자궁 내막 층의 확산을 포함한다. 특히, 세포 변화, 분....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
이 원고에 사용 된 자궁 절제술 표본 IRB-HSR # 14424 번호가 대학 IRB 승인 윤리 프로토콜과 일치에 수집되었다.
임상 자료 1. 샘플 수집
- 시작하기 전에 정부와 기관 기반의 윤리 지침 및 승인 문서를 얻습니다.
- 무균 조건의 모든 단계를 실시한다.
- 샘플이 바로 문화에서 처리 할 수없는 경우 4 ° C에서 50 ML 튜브 미디어 (RPMI 또는 DMEM / 높은 포도당)의 환자에서 파생 된 조직을 유지. 샘플은 24 시간의 최대이 상태로 저장 될 수있다.
- 1X 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)와 조직 샘플을 세 번 씻고 세척 사이의 솔루션을 폐기하십시오.
긁는 방법을 사용하여 차 전지 라인 2. 준비
- 성장 배지 (RPMI 또는 10 % 태아 소 혈청과 1 % 페니실린 - streptomy 보충 DMEM / 높은 포도당의 4-10 ML을 추가CIN) 조직에 30 분 동안 Fungizone (0.25 ㎍ / ㎖의 최종 농도)를 추가합니다.
- 성장 미디어를 폐기하십시오.
- 1X PBS로 두 번 조직을 씻으십시오.
- 자궁 근층 및 ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
프로토콜 섹션에 강조으로, 인간의 조직을 처리하고 준비 할 때 모든 기관 정부에서 방법, 윤리적 지침을 수행해야합니다.
"긁는 방법"의 일반적인 워크 플로의 그림 (그림 1A) 및 기본 자궁 내막 문화를 설정하는 데 사용 "트립신 방법"(그림 1B)은이 원고에 포함되어 있습니다. 이들 방법은 프로토콜 섹션에서 상세히 설명된다 (파트 1 참조 -. 3.). 두 가지 방법은 기본 자궁 내막 문화의 성장에 성공적으로 증명한다. 장점은 "긁기 방법은"준비 시간이 단축되는; 에 비해 4 배 이상 - 그러나, 생존 세포를 관찰하는 데 걸리는 시간은 통상 2 "트립신 방법."
티슈 조달로부터 수신 된 초기 인체 조직의 디지털 이미지가 개시된다. 자.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
다른 그룹은 콜라게나 4,12,13,15-18를 활용 대부분의 자궁 내막 기질 문화의 제조 방법을 설명하고 적응. 이 논문에서, 우리는 경제적 인 이유와 트립신 및 / 또는 면도날의 편리한 이용 가능 여부 연구실로 활용 둘 중 두 가지 간단한 기본 자궁 내막 배양 방법에 대한 방법론과 증거를 제공했다.
우리의 두 가지 방법을 비교했을 때, 모두가 성공적으로 실행 가능한 차 문화를 생성합니다. 작은 샘플 크기 요구 사항과 높은 수익률은 일반적으로 존재하는 한 우리의 기본 방법은 트립신 방법입니다. 준비 시간이 한정되어있는 경우 트립신 방법을 사용하여 세포를 도금하는 것은 시간 반 이상을 소요하는 반면, 연삭 법은 30 분을 필요로한다.
또한 주목할만한 자궁 내막 생검 반대로 우리가 자궁 적출술의 샘플이 방법을 보여 것입니다. 자궁 내막 바이오psies 상당한 침입하지 않고 찍은 작은 표본을 생산하는 경향이있.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자는 공개 아무것도 없어.
감사의 글
우리는 그들의 이미징 및 현미경 장비의 사용을 위해 박사 타오 댕와 그녀의 실험실의 구성원의 공동 노력을 주셔서 감사합니다. 우리는 또한 자궁 조직으로 우리를 제공하기위한 Biorepository 및 조직 연구 시설 (BTRF) 코어, 제프 하퍼, 버지니아 대학에서 주민 감사합니다. 우리는 도식 개요와 도움 카롤 Szlachta 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.25 트립신 또는 0.05% 트립신 | Hyclone | SH3023602 또는 SH30004202 | |
| 1.7 마이크로 원심분리기 튜브 | 제네시 사이언티픽 | 22-272A | |
| 1 &마이크로; l, 20 &마이크로; L, 200 ml 및 1,000 µ l 피펫 | Genesee Scientific | 24-401,24-402, 24-412, 24-430 | |
| 15 ml 원뿔형 튜브 | Hyclone | 339650 | |
| 50 ml 원뿔형 튜브 | Hyclone | 339652 | |
| 6cm 세포 배양 접시 | Thermo scientific | 12-556-002 | |
| 8 웰 챔버 | Thermo Scientific | AB-4162 | |
| 아세테이트 | Fisher scientific | C4-100 | |
| AMV RT 효소/완충액 | Bio Labs | M077L | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | Fisher Scientific | BP-1605-100 | |
| 완충 아연 포르말린 | Thermo | 59201ZF | |
| 차콜 스트립 FBS | 피셔 | NC9019735 | |
| 클로로포름 | Fisher Scientific | BP1145-1 | |
| 커버 슬립 | 피셔 브랜드 | 12-544D | |
| 사이클릭 AMP(cAMP) | 시그마 | B7880 | |
| DMEM/고혈당 | Hyclone | SH30243FS | |
| dNTP | Bioline | BIO-39025 | |
| 당나귀 안티 염소 -TRITC | 산타 | SC-3855 | |
| 당나귀 세럼 | 잭슨' s lab | 017-000-002 | |
| E Cadherin 항체 | Epitomics | 1702-1 | |
| 에탄올 | 피셔 사이언티픽 | BP2818-1 | |
| 소태아 혈청 (FBS) | Fisher Scientific | 03-600-511 | |
| Fungizone Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | |
| GAPDH 프로브 | 라이프 테크놀로지 | HS99999905 | |
| 글리코겐 | 5Prime | 2301440 | |
| 염소 안티 마우스 - FITC | 잭슨' s Lab | 115-096-003 | |
| 이소프로판올 | 피셔 사이언티픽 | BP2618-1 | |
| 카나마이신 | 피셔 사이언티픽 | BP906-5 | |
| 메드록시프로게스테론 아세테이트 (MPA) | Sigma | M1629 | |
| MeOH (메탄올) | Fisher Scientific | A4-08-1 | |
| 마운팅 미디어 (w/DAPI) | 벡터 Labratories | H-1500 | |
| N6 DNA 올리고 | Invitrogen | ||
| Number 15 스크래퍼 | BD | 371615 | |
| 팬 사이토케라틴 마우스 mAB | Cell Signaling | 4545 | |
| PBS (인산염 완충 식염수) | Fisher Scientific | BP-399-4 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 글루타민 용액 100X | Hyclone | SV30082.01 | |
| PML 안티 염소 안티 바디 | 산타크루즈 | SC-9862 | |
| 프라이머 | 유로핀 | ||
| RPMI | Hyclone | SH30027FS | |
| RPMI (페놀 프리) | Gibco | 11835 | |
| Sybr 그린 | 써모 사이언티픽 | AB-4162 | |
| Taqman | 써모 | AB-4138 | |
| 트리졸 | Life Technologies | 15596018 | |
| Vimentin 항체 | 에피토믹스 | 4211-1 |
참고문헌
- Heller, D. in The endometrium: a clinicopathologic approach. Heller, D. , 56-75 (1994).
- Emera, D., Romero, R., Wagner, G. The evolution of menstruation: a new model for genetic assimilation: explaining molecular origins of maternal responses to fetal inva....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
