이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다. 단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 절차는 신경 세포 성장을 지시하기 위해 다면적 기질을 제작하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 기계적, 지형적, 접착적 및 화학적 신호를 통합합니다. 기계적 특성은 전기 방사 섬유를 제조하는 데 사용되는 재료의 유형에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜에서는 인장 계수가 ~500Pa인 30% 메타크릴화 히알루론산(HA)을 사용하여 부드러운 섬유질 골격을 생성합니다. 회전하는 맨드릴에 전기 방사를 하면 정렬된 섬유가 생성되어 지형학적 단서를 생성합니다. 접착력은 골격을 피브로넥틴으로 코팅함으로써 이루어집니다. 여기서 다루는 주요 과제는 장기간 동안 골격 깊이 전체에 화학적 신호를 제공하는 것입니다. 이 절차는 신경 성장 인자(NGF)를 포함하는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구를 제작하고 전기방사 과정에서 이러한 미세구를 골격에 직접 함침시키는 방법을 설명합니다. 높은 절삭력과 전하를 포함한 가혹한 생산 환경으로 인해 생산 후 단백질 생존율을 측정합니다. 이 시스템은 60일 이상 단백질 방출을 제공하며 1차 신경 세포 성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다.
서론
신경 조직 공학의 지속적인 과제 중 하나는 신경이 자연적으로 성장 세포 외 매트릭스를 모방 한 신경 도관 (NC)를 만드는 것입니다. 연구는 세포가 기계, 지형, 접착제 및 화학 신호 1-3 포함한 환경에서 여러 가지 요인에 반응 것으로 나타났습니다. 이 분야의 주된 문제점 중 하나는 신호들의 적절한 조합을 결정하고 세포의 성장을 지원하기 위해 4 장기간 큐들을 유지할 수있는 시스템을 제조한다. 말초 신경은 연질 기판을 선호하는 것으로 알려져있다, 섬유 배향에 의해 지시되는, 신경 성장 인자 (NGF)에 대응 5-7. 주 화학적 신호를 제공 할 수있는 나노 결정은 가까운 이식, 신경 수리 8,9 현재 금 표준의 기능 회복에 대한 개선을 제공하는 것으로 나타났다.
재료 및 제조 방법은 각종 기계적 및 지형 생성하는데 사용될 수있다알은 10-13 큐들. 기계 단서 1,13 중요한 애플리케이션에 대한 적절한 재료의 선택을, 선택된 물질에 고유하다. 생산 방법은 지형적 단서가 상분리, 자기 조립 및 1,13 전기 방사를 포함 제어한다. 마이크로 애플리케이션, 마이크로 유체, 포토 패터닝, 에....
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프로토콜
1 물 / 오일 / 물 에멀젼을 두 번 미소 구 생산
- 제 2 % 및 탈 이온수에 폴리 비닐 알코올 (PVA)의 w / v 용액 0.5 %를 준비한다. 클리어 할 때까지 50 ° C에서 솔루션을 저어,이 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 탈 이온수에서 2 %의 v / V 이소 프로필 알코올의 용액을 준비합니다.
- 바람직한 친수성 단백질 수용액을 준비한다. 아래의 표는 예 제제를 제공한다.
표 1. 예 단백질 해법은 다음과 같은 단백질 용액을 성공적으로 캡슐화 전기 방사는이 프로토콜을 이용하고있다. 필요에 따라 기타 친수성 단백질 용액을 사용할 수있다.
- 50 ㎖의 원심 분리 관에 0.5 % PVA 수용액 40 ㎖에 넣고 옆으로 설정합니다.
- 15 ㎖의 원심 분리 튜브에서 65:35의 300 mg을 용해폴리 디클로로 메탄 3 ㎖ 중의 (락....
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결과
85 %의 단백질 캡슐화 직경에, 미소 ± 14 μm의 (50)는 지속적으로 생산 발판으로 전기 방사되고있다. 크기는 세 개의 분리 된 생산 배치에서 미소 구체의 샘플을 이미징에 의해 결정 하였다. 상업용 랩 소프트웨어를 사용하여 측정 한 광학 현미경과 길이에 캡처 이미지. 도표 1은 크기 분포의 히스토그램을 도시한다. 캡슐화 율은 생산 공정 중에 탈출 단백질을 정량화하여, 세 개의 분리 된 미세 구 배치에서 시험 하였다.
도 2는 캡슐화 PLGA 셸 및 소 혈청 알부민 (BSA)에 -FITC 로다 민 (2 μg / ml)로 대표적인 미소 구체를 나타낸다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 쉘은 명확 내부 (녹색)에 농축 단백질 (적색)을 볼 수있다.
, 마이크로 스피어를 캡슐화를 평가하려면의는 BSA 가득 브래드 포드 단백질 분석과 단백질 방출을 위해.......
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토론
많은 연구는 신경 세포가 지형적 큐들 (섬유 배향) 및 화학 신호 (성장 인자) 1,2,10,11,35로 지향 될 수 있음을 보여 주었다. 전기 방사는 정렬 된 섬유를 만들 수있는 손쉬운 방법이다. 성장 인자는 신경 성장하지만 신경 도관 (NC)로 포함하기 위해, 지속 방출을위한 방법이 요구된다 바랍니다. 두 신호와 함께보다 강력한 시스템을 만들려면 다음이 신호가 결합되어야한다. 여러 가지 방법으로 이전에 신경 재생을위한 전기 방사 섬유 지지체 내에서 단백질의 확장 된 버전을 제공하기 위해 연구되고 있지만, 지금까지 아무도 60 일 이상 지속 방출 할 수 없었다. 또한, 성장 인자의 방출 패터닝은 불가능 하였다. 여기서 우리는 신호 모두를 제공하는 PLGA 미세 구를 제공하여 전기 방사를 결합하는 시스템을 설명한다.
전통적인 방법은 드 보어 등에 의해 설명 된 프로토콜로, PLGA 미소 구체를 제조한다. </ EM>.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 Richard Barber Foundation과 Thomas Rumble Fellowship(TJW)을 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Irgacure 2959 | BASF | 24650-42-8 | 빛으로부터 보호 |
| PEO 900 kDa | Sigma-Aldrich | 189456 | |
| Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine B | Polysciences, Inc. | 23591-100 | 에 재고 용액 준비 |
| KD Scientific | KDS100 | ||
| 전원 | 감마 고전압 | ES30P-5W | |
| 모터 | Triem Electric Motors, Inc | 0132022-15 | 맞춤형 맨드릴 |
| 타코미터 | 네트워크 도구 창고 | ESI-330 | 드릴 속도를 |
| 모니터링하는 데 사용합니다.Omnicure UV 스팟 경화 시스템(시준 어댑터 포함 | EXFO | S1000 | |
| 바늘 | Fisher Scientific | 14-825-16H | |
| 커버슬립 | Fisher Scientific | 12-545-81 | |
| 폴리비닐 알코올 | 시그마-알드리치 | P8136-250G | |
| 이소포로필 알코올 | 시그마-알드리치 | I9030-500mL | |
| 소 혈청 알부민(BSA) | 피셔 사이언티픽 | BP9703-100 | |
| BSA-FITC | 시그마-알드리치 | 080M7400 | |
| &베타;-신경 성장 인자(NGF) | R& D Systems | 1156-NG | |
| 65:35 Poly-lactic-Glycolic-Acid (PLGA) | Sigma-Aldrich | 1001554270 | |
| Dichloromethane | Sigma-Aldrich | 34856-2L | |
| Coomassie (Bradford) 단백질 분석 | Thermo Scientific | 1856209 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate | Sigma-Aldrich | 1001558456 | |
| 피브로넥틴 | 시그마-알드리치 | F2006 | |
| DMEM | 론자 | 12-604F | |
| FBS | 애틀랜타 생물학 | S11150 | |
| PBS | 하이클론 | SH30256.01 | |
| 글루타민 | 피셔 사이언티픽 | G7513 | |
| 펜-스트렙 | 시그마-알드리치 | P4333 | |
| 파라포름알데히 | 드 알파 에자르 | A11313 |
참고문헌
- Wrobel, M. R., Sundararaghavan, H. G. Directed migration in neural tissue engineering. Tissue Eng Part B Rev. , (2013).
- Schmidt, C. E., Leach, J. B. Neural tissue engineering: strategies for repair and regeneration. Annual Review of Biomedical Engineering. 5
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