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방법 논문

섬유 공사장 공중 발판으로 마이크로 스피어를 해제 전기 방사의 성장 인자

12K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51517

⸱

2014년 8월 16일

 , 
1Biomedical Engineering, Wayne State University

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 전기 방사와 마이크로 스피어를 결합하여 뉴런을 지시하는 조직 공학 골격을 개발합니다. 신경 성장 인자는 PLGA 미세구 내에 캡슐화되어 히알루론산(HA) 섬유 골격으로 전기 방사되었습니다. 단백질 생체 활성은 기본 병아리 Dorsal Root Ganglia를 골격에 파종하고 4-6일 동안 배양하여 테스트했습니다.

초록

이 절차는 신경 세포 성장을 지시하기 위해 다면적 기질을 제작하는 방법을 설명합니다. 이 시스템은 기계적, 지형적, 접착적 및 화학적 신호를 통합합니다. 기계적 특성은 전기 방사 섬유를 제조하는 데 사용되는 재료의 유형에 의해 제어됩니다. 이 프로토콜에서는 인장 계수가 ~500Pa인 30% 메타크릴화 히알루론산(HA)을 사용하여 부드러운 섬유질 골격을 생성합니다. 회전하는 맨드릴에 전기 방사를 하면 정렬된 섬유가 생성되어 지형학적 단서를 생성합니다. 접착력은 골격을 피브로넥틴으로 코팅함으로써 이루어집니다. 여기서 다루는 주요 과제는 장기간 동안 골격 깊이 전체에 화학적 신호를 제공하는 것입니다. 이 절차는 신경 성장 인자(NGF)를 포함하는 폴리(락틱-코-글리콜산)(PLGA) 미세구를 제작하고 전기방사 과정에서 이러한 미세구를 골격에 직접 함침시키는 방법을 설명합니다. 높은 절삭력과 전하를 포함한 가혹한 생산 환경으로 인해 생산 후 단백질 생존율을 측정합니다. 이 시스템은 60일 이상 단백질 방출을 제공하며 1차 신경 세포 성장을 촉진하는 것으로 나타났습니다.

서론

신경 조직 공학의 지속적인 과제 중 하나는 신경이 자연적으로 성장 세포 외 매트릭스를 모방 한 신경 도관 (NC)를 만드는 것입니다. 연구는 세포가 기계, 지형, 접착제 및 화학 신호 1-3 포함한 환경에서 여러 가지 요인에 반응 것으로 나타났습니다. 이 분야의 주된 문제점 중 하나는 신호들의 적절한 조합을 결정하고 세포의 성장을 지원하기 위해 4 장기간 큐들을 유지할 수있는 시스템을 제조한다. 말초 신경은 연질 기판을 선호하는 것으로 알려져있다, 섬유 배향에 의해 지시되는, 신경 성장 인자 (NGF)에 대응 5-7. 주 화학적 신호를 제공 할 수있는 나노 결정은 가까운 이식, 신경 수리 8,9 현재 금 표준의 기능 회복에 대한 개선을 제공하는 것으로 나타났다.

재료 및 제조 방법은 각종 기계적 및 지형 생성하는데 사용될 수있다알은 10-13 큐들. 기계 단서 1,13 중요한 애플리케이션에 대한 적절한 재료의 선택을, 선택된 물질에 고유하다. 생산 방법은 지형적 단서가 상분리, 자기 조립 및 1,13 전기 방사를 포함 제어한다. 마이크로 애플리케이션, 마이크로 유체, 포토 패터닝, 에칭, 염 침출 또는 가스 발포체를 들어도 14-17을 사용할 수있다. 전기 방사로 인해 유연성 및 생산 13,18-23의 용이성에 조직 배양을위한 섬유 기판을 설계하는 가장 인기있는 방법으로 떠오르고있다. 전기 방사 나노 섬유는 그 자체 격퇴 24를 방전 짧은 갭을 가로 질러 스트레칭 일으키는 고분자 용액에 고전압을인가함으로써 제조된다. 정렬 비계 접지 회전 맨드릴에 섬유를 수집하여 생성 할 수 있습니다 및 비동맹 비계는 고정 플레이트 (25)에 수집됩니다. 접착 시그널링은 섬유질 골격 재치 코팅함으로써 달성 될 수있다H의 피브로넥틴 또는 26을 전기 방사 전에 HA 그러한 RGD 같은 접착 펩타이드, 컨쥬 게이트.

그들이 제어 방출을위한 소스가 필요하기 때문에 이러한 성장 인자와 같은 화학 신호는, 장기간에 걸쳐 유지하는 것이 가장 어렵다. 대부분의 시스템은 성공의 다양한 수준으로 전기 방사 섬유 네트워크 제어 방출을 추가하려고 시도하고있다. 이러한 방법은 혼합 전기 방사, 에멀젼 전기 방사, 코어 쉘 전기 방사 및 단백질 접합 (27)을 포함한다. 또한, 전기 방사는 전통적 따라서 단백질의 생활 성이 고려되어야 유지, 단백질 (28)의 생존에 영향을 미칠 수 휘발성 용매에서 수행된다.

이 접근법은 특히 말초 신경 성장 동조 지지체를 작성하기 위해 기계적, 지형, 화학적 및 접착 신호를 결합 다룬다. 비계 역학 정밀 합성에 의해 제어된다methacrylated 히알루 론산 (HA). 메타 크릴 사이트는 사진 반응 가교제를 연결하는 데 사용됩니다. 가교 물질은 더 이상 수용성없는 독점적 효소 (29)에 의해 분류됩니다. 가교제의 양이 열화 속도, 기계 및 기타 물질의 물성을 변화시킨다. ~ 500 Pa의 인장 탄성률이 30 % 메타 크릴로 HA를 사용하여 신경 조직의 기본 역학에 가까운 일반적으로 신경 세포 26,29 선호하는 부드러운 기판을 만듭니다. 회전하는 맨드릴에 전기 방사하는 지형 큐에 대한 정렬 된 섬유를 만드는 데 사용됩니다. 미소와 함께 전기 방사를 사용하면 확장 된 기간 동안 비계 내에서 화학적 신호를 제공한다. 화학적 신호를 생성하는 데 사용되는 NGF를 함유하는 미세 신경 돌기 성장을 지원하기 위해. NGF 생산시 솔벤트가 발생하지 않도록 대부분의 전기 방사 물질과는 달리 HA는 물에 용해합니다. , SCA를 접착제 신호를 추가하려면ffold는 피브로넥틴으로 코팅된다. NGF는 피브로넥틴 (접착제)로 코팅 된 마이크로 스피어 (화학)를 해제 소프트 (기계) 정렬 (지형) 섬유 : 완성 된 시스템은 전술 한 신호의 네 종류가 포함되어 있습니다. 생산 및이 시스템의 테스트는이 프로토콜에 설명되어있다.

프로세스는 유중 수중 이중 에멀젼 미립자의 제조로 시작된다. 에멀젼은 계면 활성제, 폴리 비닐 알코올 (PVA)로 안정화된다. 내부 수상은 단백질이 포함되어 있습니다. 이를 디클로로 메탄 (DCM)에 용해 PLGA 쉘 물질을 함유하는 유상에 첨가 될 때, 계면 활성제는 DCM로부터 단백질을 보호 상 사이의 장벽을 생성한다. 이 미소 에멀젼의 외부 표면을 생성하기 위해 PVA를 함유하는 다른 수상에 분산보다. 안정한 에멀젼을 DCM가 증발 할 수 있도록 교반 하였다. 세정 및 동결 건조 후에는 건조 미소의 계속 남아 있습니다단백질 aining.

미소가 완료되면 그들은 발판으로 전기 방사 할 준비가 된 것입니다. 먼저 전기 방사 용액을 제조. 용액의 점도는 적절한 섬유 형성에 중요하다. 순수 HA의 솔루션은 이러한 요구 사항을 충족하지 않는; PEO는 전기 방사를 허용하는 담체 중합체로 추가된다. 마이크로 전반에 걸쳐 분산 미소와 섬유 지지체의 결과로 솔루션 및 전기 방사에 추가됩니다.

제작이 완료되면, 단백질은 그 가능성을 검증하기 위해 테스트되어야한다. 이를 위해, NGF에 응답 일차 전지가 사용될 수있다. 이 프로토콜은 8 ~ 10 일 이전 닭 배아에서 등쪽 뿌리 신경절 (DRG)를 사용합니다. 셀 번들은 NGF 또는 비어있는 것들로 가득 미소를 포함하는 발판에 씨앗을 품고있다. NGF는 여전히 실행 가능한 경우에는 NGF 포함 비계에 강화 된 신경 돌기의 성장을 볼 수 있습니다. NGF가 더 이상 실행 가능한 없으면 그것 것하지 확장하는 신경 돌기를 촉진하고 컨트롤과 유사하게 나타납니다.

본원에 설명 된 정확한 순서는 단순한 변형 재료, 전기 방사 방법 및 시스템은 다양한 세포 및 조직 종류에 최적화 될 수있는 단백질로, 그러나, 신경 지지체 상에 집중된다.

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프로토콜

1 물 / 오일 / 물 에멀젼을 두 번 미소 구 생산

  1. 제 2 % 및 탈 이온수에 폴리 비닐 알코올 (PVA)의 w / v 용액 0.5 %를 준비한다. 클리어 할 때까지 50 ° C에서 솔루션을 저어,이 몇 시간이 걸릴 수 있습니다. 탈 이온수에서 2 %의 v / V 이소 프로필 알코올의 용액을 준비합니다.
  2. 바람직한 친수성 ​​단백질 수용액을 준비한다. 아래의 표는 예 제제를 제공한다.

figure-protocol-1
표 1. 예 단백질 해법은 다음과 같은 단백질 용액을 성공적으로 캡슐화 전기 방사는이 프로토콜을 이용하고있다. 필요에 따라 기타 친수성 ​​단백질 용액을 사용할 수있다.

  1. 50 ㎖의 원심 분리 관에 0.5 % PVA 수용액 40 ㎖에 넣고 옆으로 설정합니다.
  2. 15 ㎖의 원심 분리 튜브에서 65:35의 300 mg을 용해폴리 디클로로 메탄 3 ㎖ 중의 (락트산 - 코 - 글리콜 산) (PLGA). 볼텍스 믹서는 PLGA의 분해를 촉진하는데 사용될 수있다.
  3. 단백질 용액을 200 μL 및 2 % PVA 용액 4 μl를 겸용. PLGA 용액에 단백질 혼합물을 따르 (1.4 단계). 솔루션은 대부분 별도의 유지됩니다.
  4. 얼음 물을 비커에 넣고, 튜브를 놓습니다. ~ 10 와트 (RMS)에 지팡이 초음파기를 사용하여, 균일 한 유백색 에멀젼이 생성 될 때까지 몇 초간 (5-10)에 대한 용액을 교반.
  5. 0.5 % PVA (단계 1.3)를 함유하는 50 ㎖의 튜브에 에멀젼을 붓는다. ~ 20 초간 볼텍스 혼합기에서 고속으로 용액을 혼합한다. 이 솔루션은 흐린 모양을 개발할 것입니다.
  6. 2 분 동안 350 rpm으로 저어 접시에 200 ㎖의 비이커과 장소에 에멀젼을 전송합니다. 볶음 접시에 비커에 2 % 이소 프로필 알코올 50 ㎖를 추가합니다. 혼합물을 강화하기 위해 DCM이 증발 할 수 있도록 1 시간의 최소 및 PLGA 동안 교반을 계속 할 수 있습니다.
  7. 전송 t그는 원심 분리기 튜브에 솔루션을 마이크로 스피어.
  8. 3 분 동안 425 XG에 원심 분리기. 미소 구체는 튜브의 바닥에 수집하고, 흰색 나타난다. 조심스럽게 미소 위에 튜브에서 뜨는을 제거하고, 500 ㎖의 병에 저장합니다.
  9. 전체 튜브 세 분기 채우고 그것을 액체에 미소 재배포 진탕 탈 이온수로 린스 미소.
  10. 반복 1.10 및 1.11 네 번 단계를 반복합니다.
  11. 마지막 헹굼에 따라, 다른 샘플을 500 ㎖의 병에 다시 장소 뜨는을 제거합니다. 후 최소 24 시간 동안 동결 건조, 원심 분리 관에서 수집 한 미소를 동결.
  12. 가벼운 현미경 또는 주사 전자 현미경으로 미세 시각화. 60 μm의보다 더 큰 마이크로 스피어는 효과적인 전기 방사를위한 것입니다. 미소 구가 너무 큰 경우, 이상 초음파 처리 또는 텍싱 시간은 단계 1.6 또는 1.7에서 요구 될 수있다.
    13. <리> -20 ° C 냉동고에있는 말린 미소를 저장합니다.
  13. 옵션 : 1.10 단계 30에서 500 ㎖의 병에 단백질의 양을 테스트하기 위해, 제조업체의 지침에 따라, 단백질 분석을 사용합니다. 이는 미소 구에 캡슐화 된 단백질의 제조 방법에 사용 된 것과 용액의 양을 뺌으로써 퍼센트를 계산하는데 사용된다.

. 마이크로 스피어에서 단백질의 위치가 PLGA 용액 31에 로다 민에게 ㎖의 2 μg /를 추가하고 FITC 복합 단백질을 캡슐화 시각화하는 일이 예를 보여줍니다 :합니다.

마이크로 스피어와 2 전기 방사

  1. 이전 전기 방사 용액을 제조에, 37 ° C에서 용해시켜 탈 이온수 광개시제 0.5 % / V w 솔루션을 만들 수 있습니다. 이 프로세스는 몇 시간이 걸릴 수 있습니다.
  2. 히알루 론산 (MEHA)를 methacrylated 29 절, 3 % (버딕 외. 합성 참조) / w 2 % 만들기/ V 900 kDa의 폴리 (에틸렌 옥사이드) (PEO)와 w 0.05 % / 탈 이온수 V 사진 개시제 용액 w.
    1. 원하는 볼륨 MEHA와 PEO의 정확한 금액을 계산합니다. 예를 들어, 솔루션을 전기 방사의 10 ㎖를 MEHA의 200 밀리그램 및 PEO의 300 밀리그램을 필요로한다.
    2. 원하는 최종 부피 (이 예 9 ㎖)의 90 %를 탈 이온수에 PEO 녹인다. 이것은 몇 시간이 걸릴 수 있으며, 37 ℃에서 가열 교반 플레이트 또는 수욕은 프로세스를 가속화하는데 사용될 수있다.
    3. 다음 MEHA을 추가하고 명확 때까지 저어하는 와류 믹서를 사용합니다. 이것은 단지 몇 분 정도 걸립니다.
    4. 마지막으로 나머지 10 %의 볼륨 (이 예를 들어 1 ml)에 채우기 위해 0.5 % 광개시제 솔루션을 추가합니다.
  3. 400 ㎎ / ㎖까지 원하는 농도에 미소를 추가합니다. 미세 균일 용액에 분산 될 때까지 소용돌이 혼합기에 용액을 혼합한다.
  4. 주사기에 대한 해결책을 전송하고 6 인치 18 게이지 (BL)을 첨부UNT 팁 바늘입니다.
  5. 주사기 펌프에 주사기를 놓고는 1.2 ㎖ / 시간에 분배하도록 설정합니다.
  6. 수집 판 또는 맨드릴에 알루미늄 호일 층을 테이프입니다. 이것은 완성 된 지지체를 쉽게 정리 및 저장이 가능합니다. 회전하는 맨드릴은 정렬 된 섬유를 만드는 데 사용됩니다. 평판이나 고정 맨드릴은 무작위로 배열 된 섬유에서 발생합니다.
  7. 수집 장치에 고전압 전원으로부터 접지 와이어를 연결한다. 바늘에 긍정적 인 리드를 연결합니다.
  8. 니들 팁과 수집 표면 사이 15cm가되도록 주사기 펌프 및 수집 표면을 조정한다.
  9. 이 솔루션은 주사기의 끝에서 볼 때, 고분자 펌핑을 시작 전압 소스를 켜고 24 kV의주의에 전압을 설정합니다.을 시스템의 금속 부분을 만지지 마십시오에 전압이 전원을 켜면. 요금은 피부에 전기 부분에서 짧은 거리를 이동할 수 있습니다.
  10. D까지 솔루션을 실행esired 비계 두께는 달성된다. 전체 전압 소스와 주사기 펌프를 해제합니다.
  11. 비계가 붙어과 호일을 제거합니다. 단백질을 함유 완료 발판은 -20 ° C 냉동고에 저장됩니다.

3 단백질 생물 작용 (Bioactivity) 테스트

  1. 세포 배양 매체를 준비합니다. 추가 10 % v / V를 소 태아 혈청 둘 베코 변형 이글의 중간에, 1 %의 v / V의 L-글루타민, 1 % V / V 페니실린 - 스트렙토 마이신.
  2. 잘 판에 완전히 맞게 선택 유리 커버 슬립.
  3. 제조자에 의해 설명 된 커버 슬립을 치료 3- (트리 메 톡시 실릴) 프로필 메타 크릴 레이트를 사용한다. 메타 크릴은 커버 슬립에 비계 준수를 강화합니다.
  4. 전기 방사하기 전에 이동식 양면 테이프로 electrospinner의 수집 지역에 methacrylated 된 커버를 부착합니다. 커버 슬립에 스피닝 처리 및 시청을 용이하게합니다.
  5. 전술 한 바와 같이 소망의 두께로 Electrospin.
  6. 따고 조심스럽게 맨드릴에서 커버 슬립을 제거 전기 방사. 명확한 질소 챔버로 비계에게 코팅 된 커버를 놓고 모든 산소가 제거되어 있는지 확인합니다.
  7. 15 분 동안 10 mW의 / cm 2 365 nm의 빛 아래 챔버와 비계를 놓습니다. 적절한 크기의 잘 플레이트로 장소를 가교 후. 발판면이 위를 향하도록합니다.
  8. 30 분 동안 살균 램프 아래 장소의 발판 살균합니다. 원하는 피브로넥틴 또는 기타 단백질은 세포 부착을 향상시키기 위해 코팅으로서 사용되는 경우. 코트 발판으로 제조업체의 지침을 따르십시오.
  9. 수확 등쪽 뿌리 신경절 (DRG)이 아니라 이전에 Hollenbeck (32)에 의해 설명했다. 한 DRG는 각 시험 비계 덮여 coverslip에 대한 필요합니다.
  10. 잘 플레이트의 각 발판 용지의 100 ~ 200 μl를 놓습니다. 조심스럽게 미디어 방울의 각 지지체에 한 DRG를 놓습니다. 두꺼운 비계에 대한 더 많은 미디어가 필요할 수있다; DRG 완전히 잠긴 floa하지해​​야팅.
  11. 세포가 지지체에 부착 할 수 있도록 4 시간 동안 37 ° C에서의 비계와 DRG를 품어.
  12. 잘에 대한 적절한 수준으로 미디어를 입력하고 인큐베이터에 배치합니다. 4-6일 배양하고 계속합니다.
  13. 잠복기 후 신중 아니라 각에서 용지를 제거하고 부드럽게 PBS로 한번 씻어. / V 파라 포름 알데히드 와트 4 %를 사용하여 30 분 동안 세포를 고정합니다.
  14. 신경 미세 섬유에 대한 항체 염색을 사용하여 얼룩 세포. 이 정량 신경 돌기 생성의 시각화 수 있습니다. DAPI 또한 세포의 핵을 표시하는데 사용될 수있다. 예를 염색 프로토콜은 Sundararaghavan 및 동료 (14)에 의해 설명되었다.
  15. 형광 현미경을 사용하여 세포를 시각화.
    1. 현미경의 무대에 웰 플레이트를 놓습니다.
    2. DAPI에 대한 필터 및 여기 설정을 사용하여 세포 질량을 찾습니다.
    3. 셀되면 확장 된 신경 돌기를 시각화 FITC에 필터를 전환합니다. U수집하고 전체 구조를보고 필요한만큼의 이미지를 결합 현미경 스티치 기능을 노래. DAPI, FITC 밝은 필드에 대해이 단계를 반복합니다.

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결과

85 %의 단백질 캡슐화 직경에, 미소 ± 14 μm의 (50)는 지속적으로 생산 발판으로 전기 방사되고있다. 크기는 세 개의 분리 된 생산 배치에서 미소 구체의 샘플을 이미징에 의해 결정 하였다. 상업용 랩 소프트웨어를 사용하여 측정 한 광학 현미경과 길이에 캡처 이미지. 도표 1은 크기 분포의 히스토그램을 도시한다. 캡슐화 율은 생산 공정 중에 탈출 단백질을 정량화하여, 세 개의 분리 된 미세 구 배치에서 시험 하였다.

도 2는 캡슐화 PLGA 셸 및 소 혈청 알부민 (BSA)에 -FITC 로다 민 (2 μg / ml)로 대표적인 미소 구체를 나타낸다. 이미지는 형광 현미경을 사용하여 촬영 하였다. 쉘은 명확 내부 (녹색)에 농축 단백질 (적색)을 볼 수있다.

, 마이크로 스피어를 캡슐화를 평가하려면의는 BSA 가득 브래드 포드 단백질 분석과 단백질 방출을 위해...

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토론

많은 연구는 신경 세포가 지형적 큐들 (섬유 배향) 및 화학 신호 (성장 인자) 1,2,10,11,35로 지향 될 수 있음을 보여 주었다. 전기 방사는 정렬 된 섬유를 만들 수있는 손쉬운 방법이다. 성장 인자는 신경 성장하지만 신경 도관 (NC)로 포함하기 위해, 지속 방출을위한 방법이 요구된다 바랍니다. 두 신호와 함께보다 강력한 시스템을 만들려면 다음이 신호가 결합되어야한다. 여러 가지 방법으로 이전에 신경 재생을위한 전기 방사 섬유 지지체 내에서 단백질의 확장 된 버전을 제공하기 위해 연구되고 있지만, 지금까지 아무도 60 일 이상 지속 방출 할 수 없었다. 또한, 성장 인자의 방출 패터닝은 불가능 하였다. 여기서 우리는 신호 모두를 제공하는 PLGA 미세 구를 제공하여 전기 방사를 결합하는 시스템을 설명한다.

전통적인 방법은 드 보어 등에 의해 설명 된 프로토콜로, PLGA 미소 구체를 제조한다. </ EM>...

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

이 작업은 Richard Barber Foundation과 Thomas Rumble Fellowship(TJW)을 통해 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DAPIInvitrogenD1306
Irgacure 2959BASF24650-42-8빛으로부터 보호
PEO 900 kDaSigma-Aldrich189456
Methacryloxethyl thiocarbamoyl rhodamine BPolysciences, Inc.23591-100에 재고 용액 준비
KD ScientificKDS100
전원감마 고전압ES30P-5W
모터Triem Electric Motors, Inc0132022-15맞춤형 맨드릴
타코미터네트워크 도구 창고ESI-330드릴 속도를
모니터링하는 데 사용합니다.Omnicure UV 스팟 경화 시스템(시준 어댑터 포함EXFOS1000
바늘Fisher Scientific14-825-16H
커버슬립Fisher Scientific12-545-81
폴리비닐 알코올시그마-알드리치P8136-250G
이소포로필 알코올시그마-알드리치I9030-500mL
소 혈청 알부민(BSA)피셔 사이언티픽BP9703-100
BSA-FITC시그마-알드리치080M7400
&베타;-신경 성장 인자(NGF)R& D Systems1156-NG
65:35 Poly-lactic-Glycolic-Acid (PLGA)Sigma-Aldrich1001554270
DichloromethaneSigma-Aldrich34856-2L
Coomassie (Bradford) 단백질 분석Thermo Scientific1856209
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylateSigma-Aldrich1001558456
피브로넥틴시그마-알드리치F2006
DMEM론자12-604F
FBS애틀랜타 생물학S11150
PBS하이클론SH30256.01
글루타민피셔 사이언티픽G7513
펜-스트렙시그마-알드리치P4333
파라포름알데히드 알파 에자르A11313 
DMSO 주사기 펌프에 부착해야 합니다. 맨)

참고문헌

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