이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.
이 절차는 자궁 내 전기천공법을 통해 발달 중인 마우스 전뇌의 인터뉴런을 표적으로 삼는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 피질의 표재층으로 향하는 중간뉴런 아형에서 선택적 유전자 발현을 달성하는 데 특히 효율적이었습니다.
중추 신경계 (CNS) 성숙의 연구는 신경 세포 집단의 유전자 타겟팅에 의존한다. 그러나, 특정 신경 세포 아형의 관심의 유전자의 발현을 제한하는 작업으로 인해 특정 프로모터 요소의 상대적 부족에 현저 도전 입증되었다. GABA 성의의 interneurons 광범위한 유전 적, 형태 적 다양성을 가진 신경 세포의 인구를 구성한다. 실제로, GABA 성의의 interneurons의 11 개 이상의 서로 다른 하위 유형 마우스 피질 한 것을 특징으로하고있다. 여기에서 우리는 GABA 성 인구의 표적으로 선택에 대한 적응 프로토콜을 제시한다. 우리는 호 메오 박스 (homeobox) 전사의 증강 요소를 사용하여 GABA 성의의 interneurons의 하위 표적으로 선택 달성 자궁 일렉트로 특정 유전자의 발현을 통해 운전 Dlx5 및 Dlx6, 초파리 말초없는 (DLL) 유전자 2,3의 상 동체를, 요인.
대뇌 피질의 GABA 성의의 interneurons의 대부분은 중간과 꼬리 신경절 eminences (각각 MGE 및 CGE)을 명명 된이 과도 배아 구조에서 발생 4. Parvalbumin 및 소마토스타틴 (somatostatin) 표현의 interneurons는의 interneurons는 CGE에서 발생 표현 Calretinin 반면 MGE 크롬 (Cr), Vasointestinal 펩티드 (VIP) 및 Reelin (재)에서 발생. 이 interneuron 하위 유형은 자신의 생일에 의해 구별 될 수있다. MGE 파생 된 하위 유형은 배아 일 9.5 (E9.5)와 e16.5 5,6 사이에서 태어난다. 반면, CGE 유래의 interneurons는 생산이 E15.5 6 고점으로 E18.5 통해 E12.5에서 태어난다. 늦게 태어난 인구의 유전자 타겟팅은, 그러나, 어려운 남아있다.
쥐의 말초없는 (DLX) 유전자를 독점적으로 개발 복부 전뇌 3 표현됩니다. GABA 성의 선조체의 interneurons 및 투영 아니라 피질 뉴런 피라미드 세포 Dlx1 표현할초기 발달 단계 3에서 2,5, 6 유전자. 실....
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모든 동물은 의학의 NYU 학교의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 규정 및 지침에 따라 처리 하였다.
마우스 균주
코닉 의해 제공 암컷 스위스 웹스터 마우스는이 실험에 사용 하였다. 특히 표면층의 interneurons를 타겟팅하기 위하여, E15.5 태아 사용 하였다.
주 : 표준 클로닝 기술을 사용하여 생성 된 본 작업 (Dlx5 / 6.eGFP 플라스미드 3 μg / μL)에 사용 된 플라스미드. eGFP는 cDNA를 Dlx5 / 6 PMIN-polyA 플라스미드에 클로닝 하였다. 이 플라스미드를 요청 (demarn02@nyumc.org)에 따라 사용할 수 있습니다.
미세 주입 피펫의 1 준비
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우리는 성숙 뉴런 세포 유형 특정한 타겟팅을 달성하기에 자궁 일렉트로 기법을 적응. CGE 유래의 interneurons에서 eGFP는의 발현을 구동하기 위해, 우리는 Dlx5 / 6 증강 요소를 사용 E15.5에 우리의 주사를 제한, 무대 CGE 유래의 interneurons의 대부분이 발생하는 경우. 우리는 P8에서 분석을 수행하고 P15 (11) (도 1 및도 2). 우리는 E15.5에서 몰 농도에서 CAG-mCherry 및 Dlx5 / 6 eGFP는 플라스미드를 electroporating 공동으로 electroporation하여 신경 세포의 복부 출처를 확인했다. 이 실험에서, 우리는 뇌실 영역 (SVZ)의 공동에있는 유일한 복부 전구 세포가 모두 단백질 11을 표명 것을 관찰했다. 형광 단백질의 발현이 시공 시간은 심실하지만 subventr 표현되지 Dlx5 6 유전자.......
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기술의 한계
이 기술은 셀 프로세스 셀 자율적 분석이 가능하지만,이 집단 분석에 적합하지 않다. electroporations 뇌 당 electroporation하여보다 천 세포와 매우 드물다. 결과적으로, 기술은 CGE의 interneurons 유래의 유전자 조작으로 인한 행동 결과를 평가하기 위해 사용될 수 없다.
electroporations가 E13.5-E14.5 대상 MGE에서 파생 된 하위 유형에서 수행하지만, 효율이 낮은 10입니다. 우리는 Dlx5 / 6 증강 적어도 에피 솜 표현의 맥락에서 postmitotic MGE의 하위 유형이 덜 활성화되어 있음을 추측.
기존 방법에 대한 의의
이 기술의 interneurons의 연구 이전에 전기 천공 법 (electroporatio.......
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저자가 공개하는 게 없다.
우리는 기술 지원을 Lihong 음에 감사하고 있습니다. NVD는 NARSAD 젊은 연구자 상을받는 사람이며, 또한 NIH (5 K99 MH095825-02)에서 보조금에 의해 지원됩니다. Fishell 실험실에서 연구는 건강의 국립 연구소, 정신 건강 (5 R01 MH095147-02, 5 R01 MH071679-09)의 국립 연구소, 신경 질환 및 뇌졸중 (5 R01 NS081297-02의 국립 연구소에서 지원 한 P01 NS074972 -01A1)와 시몬스 재단.
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| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 페달이 있는 Electroporator | Protech International | CUY21 | |
| 5mm 패들 전극 | Protech International | CUY650P5 | |
| 히팅 패드 | Kent Scientific | DCT-15 | |
| Sutter Instruments P30 풀러 | Sutter Instruments | 3282322 | |
| Fluovac 마취 시스템 | 하버드 장치 | 726425 | |
| 섬세한 운영 가위 4.75" 스트레이트 샤프/샤프 | Roboz | RS-6702 | |
| 5-0 실크 블랙 브레이드 18" C-1 박스 36 | Roboz | SUT-1073-21 | |
| 마이크로 클립 적용 펜치 5.5" | Roboz | RS-5410 | |
| 2 클램프 가위 | Roboz | RC-4894 | |
| 홀딩 펜치 | Fine Science Tools | 11031-15 | |
| 유리 모세관 튜빙 | FHC | 27-30-0 | Borosil 1.0 mm OD x 0.75 mm ID |
| 패스트 그린 | 시그마-알드리치 | F7258 | |
| 멸균 PBS | Life Technologies | 20012-027 |
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