여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.
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이 논문에서
요약
초록
인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 재생 의학 및 바이오 제약 응용 분야에서 큰 가능성을 가지고 있습니다. 현재 대량의 임상 등급 hPSC의 최적 배양 및 효율적인 증식은 hPSC 기반 치료에서 중요한 문제입니다. 일반적으로 hPSC는 피더 배양 시스템과 피더 프리 배양 시스템 모두에서 콜로니로 증식됩니다. 그러나 이러한 방법에는 낮은 세포 수율 및 이질적으로 분화된 세포 생성을 포함하여 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 현재의 hPSC 배양 방법을 개선하기 위해 최근에는 해리된 단일 세포의 NCM(Non-colony type monolayer) 배양을 기반으로 하는 새로운 방법을 개발했습니다. 여기에서는 ROCK(Rho-associated kinase) 억제제 Y-27632를 기반으로 하는 상세한 NCM 프로토콜을 제시합니다. 또한 Y-39983(ROCK I 억제제), 페닐벤조디옥산(ROCK II 억제제) 및 티아조비빈(새로운 ROCK 억제제)과 같은 다양한 소분자를 가진 NCM 배양에 대한 새로운 정보를 제공합니다. 또한 ROCK 억제제를 사용하지 않고 laminin isoform 521(LN-521)과 같은 정의된 세포외 단백질에서 hPSC를 배양하기 위해 기본 프로토콜을 확장합니다. 또한, NCM을 기반으로 분자 분석 및 신약 개발을 위해 이러한 세포를 유전적으로 변형하기 위해 플라스미드 DNA, 렌티바이러스 입자 및 올리고뉴클레오티드 기반 microRNA를 hPSC로 효율적인 transfection 또는 transduction을 입증했습니다. NCM 기반 방법은 콜로니형 배양의 주요 단점을 극복하여 향후 임상 치료, 줄기 세포 연구 및 약물 발견을 위해 다량의 균질한 hPSC를 생산하는 데 적합할 수 있습니다.
서론
multilineage의 성인 조직으로 분화하는 hPSCs의 용량은 심장, 간, 췌장, 및 신경 시스템 1-4을 포함하는 심각한 질병으로 고통받는 환자를 치료에 새로운 길을 열었습니다. hPSCs에서 파생 된 다양한 종류의 세포는 질병 모델링, 유전 공학, 약물 검사 및 독성 시험 1,4에 대한 강력한 휴대폰 플랫폼을 제공 할 것이다. 미래 임상 약리학 응용 프로그램을 보장하는 중요한 문제는 체외 세포 배양을 통해 임상 수준의 hPSCs 많은 수의 세대입니다. 그러나, 현재의 문화 시스템은 식민지 5,6 등 hPSCs의 다양한 장치와 피더 무료 문화를 포함, 부족하거나 본질적으로 변수 중 하나입니다.
hPSCs 공유 초기 포유류 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)의 많은 구조적 특징의 식민지 형 성장. ICM은 세 가지 세균 층으로 분화하는 경향이있다때문에 이종 신호 그라디언트의 존재 다세포 환경에서. 따라서, 초기 배아 발달에 이성의 인수는 차별화를위한 필수 과정으로 간주하지만, hPSC 문화의 원치 않는 기능입니다. hPSC 문화의 이질성은 종종 인해 차선의 성장 조건에 과도한 세포 사멸 신호와 자발적 분화에 의해 유도된다. 따라서, 콜로니 식 배양에서, 이종 ....
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프로토콜
hPSCs의 단일 셀 기반이 아닌 식민지 형 단일 층 (NCM) 문화.
1. 준비
- 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA)와 보충 DMEM 매체 : 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 배양 배지 500 ㎖로 만든다.
- 마우스 배아 섬유 아세포를 DMEM 배지에서 0.1 % 젤라틴 코팅 6 - 웰 세포 배양 접시에 일상적인 프로토콜 (16)와 문화 MEFs 다음 CF1 균주에서 유래 (MEFs) 세포를 분리. 또한, 상업 자원의 통로 (3)에 MEF의 주식을 구입할 수 있습니다.
- 리겔 플레이트를 준비합니다.
- -20 ° C의 냉동고에 50 % 씩 분주로 5 (~ 4 ° C에서 냉장) DMEM/F12 배지 ㎖ 및 저장소와 hESC의 자격 리겔 주식의 5 ㎖를 희석. 냉장고 (~ 4 ° C) O / N에서 냉동 마트 리겔 주식을 해동하고 추가 (2.5 % 작업 농도 상승을주는) 차가운 DMEM/F12 배지에서 리겔을 희석.
- 웰 당 1.5 ml의 2.5 % 리겔과 코트 6 - 웰 세포 배양 플레이트, 냉장고 O / N에 코팅 된 플레이트를 저장하는 (주 : 2 주 안에 리겔 코팅 된 플레이트....
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결과
NCM 문화의 일반적인 스키마
그림 1은 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 고밀도 단일 셀 도금 후 hPSCs의 역동적 인 변화를 보여주는 전형적인 NCM 문화 스키마를 나타냅니다. 이러한 형태 변화는 세포의 클러스터 형성을 도금, 세포 응축 다음에 지수 세포 성장 (그림 1A) 후 세포 간 연결이 (가) 있습니다. 대표적인 실험이 1 일에서 10 μM Y-27632의 존재 / ㎠ 1.9 × 10 5 세포의 밀도로 단일 세포로 도금, WA01 (H1) 인간 배아 줄기 세포를 나타냅니다 (그림 1B, 왼쪽 패널), 더없이 전파 하루 2의 식민지 (그림 1B, 가운데 패널)의 형성, 원하는 실험 또는 3 일 (그림 1B, 오른쪽 패널)에서 세포 계대에 적합한.......
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토론
기존의 (피더 또는 세포 외 매트릭스에 세포의) 식민지 형 문화와 지류 6없이 집계로 hPSCs의 현탁 배양 : 체외에서 배양 hPSCs에 두 가지 주요 방법이 있습니다. 식민지 형 서스펜션 모두 배양 방법의 한계는 축적 된 이질성 및 상속 성적인 변경 내용이 포함되어 있습니다. NCM 배양, 단세포 계대 및 고밀도 세포 도금 양에 기초 hPSC 성장 6,18위한 새로운 배양 방법을 나타낸다. 다양한 단일 세포 계대 방법은 문헌에 기록되어있다,하지만 그들 중 누구도 일상적인 전파를 사용하지 않지만. 예를 들어, 우 및 동료 hPSC 성장 19에 다양한 작은 분자 칵테일의 효과를 연구 할 수있는 단일 세포 계대 방법을 채택했다. 그러나, 최종 문화 제품은 식민지입니다. 따라서, 저밀도 기반 단일 셀 계대 방법은 여전히 콜로니 식 배양에 속한다. NCM 문화, 높은 굴과 관련하여최종 셀 제품은 균질 한 단일 층이기 때문에 ITY 도금, 새로운 방법이 문.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 미국 국립신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)의 국립보건원(NIH)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트에 대한 토론과 논평에 대해 Ronald D. McKay 박사에게 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 백작 부인 자동화 세포 계수기 | Invitrogen Inc. | C10227 | 자동 셀 카운팅 |
| Faxitron 캐비닛 X-ray 시스템 | Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL | 모델 RX-650 | MEF의 X선 조사 |
| MULTIWELL 6웰 플레이트 | Becton Dickinson Labware | 353046 | 폴리스티렌 플레이트 |
| DMEM | Invitrogen Inc. | 11965– 092 | MEF 매체 |
| 미토마이신 C | Roche | 107409 | 유사분열 억제제 |
| Trypsin | Invitrogen Inc. | 25300-054 | MEF 해리 |
| DMEM/F12 | Invitrogen Inc. | 11330– 032 | hPSC 미디엄 |
| Opti-MEM I 리듀스 세럼 미디엄 | Invitrogen 주식 회사 | 31985-062 | hPSC 형질주입 |
| 열비활성화 FBS | Invitrogen Inc. | 16000– 044 | MEF 미디엄 |
| 녹아웃 세럼 교체 | Invitrogen Inc. | 10828– 028 | KSR, hPSC 배지 |
| Dulbecco' 구성 요소 s 인산염 완충 식염수 | Invitrogen Inc. | 14190-144 | D-PBS, Ca2+/Mg2+ |
| Non-essential 아미노산 | 없음 Invitrogen | 11140– 050 | NEAA, hPSC 배지 |
| L-글루타민 | 인비트로겐의 구성 요소 | 25030– 081 | hPSC 매체 |
| mTeSR1 & 보충제 | StemCell Technologies | 5850 | 동물성 무단백질 |
| TeSR2 & 보충제 | StemCell Technologies | 5860 | 무제계 매체 |
| &베타;-메르캅토에탄올 | 시그마 | M7522 | hPSC 매체의 구성 |
| 요소 MEF (CF-1) ATCC | American Type Culture Collection (ATCC) | SCRC-1040 | hPSC의 피더 배양용 |
| hESC 인증 Matrigel | BD Bioscience | 354277 | hPSC의 피더 없는 배양용 |
| Laminin-521 | BioLamina | LN521-02 | 인간 재조합 단백질 |
| FGF-2(재조합 FGF, 기본) | R& D Systems, MN | 223-FB | hPSC 배지의 성장 인자 |
| CryoStor CS10 | StemCell Technologies | 7930 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT-104 | 1X 혼합 효소 용액 |
| JAK 억제제 I | EMD4 Biosciences | 420099 | Janus kinase |
| Y-27632 | EMD4 Biosciences | 688000 | ROCK 억제제 |
| Y-27632 | Stemgent | 04-0012 | ROCK 억제제 |
| Y-39983 | Stemgent | 04-0029 | ROCK I 억제제 |
| Phenylbenzodioxane | Stemgent | 04-0030 | ROCK II 억제제 |
| Thiazovivin | Stemgent | 04-0017 | 새로운 ROCK 억제제 |
| BD Falcon Cell Strainer | BD Bioscience | 352340 | 40 µ m 세포 여과기 |
| Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° C | 써모 사이언티픽 | C6516F-1 | "서리가 내린 씨" 냉동 용기 |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Inc. | 11668-027 | 트랜스펙션 시약 |
| DharmaFECT Duo | Thermo Scientific | T-2010-02 | 트랜스펙션 시약 |
| 비표적 miRIDIAN miRNA 트랜스펙션 제어 | Thermo Scientific | IP-004500-01-05 | Dy547로 라벨링되어 마이크로RNA의 전달을 모니터링하기 위해 |
| SMART-shRNA | 써모 사이언티픽 | 모든 | |
| transfection kit에 포함된 | pmaxGFP | amaxa Inc (Lonza) | control |
| Oct-4 | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | Mouse IgG2b, pluripotent marker |
| SSEA-1 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21702 | Mouse IgM, differentiation marker |
| SSEA-4 | Santa Cruz 생명공학 | sc-21704 | 마우스 IgG3, 만능 마커 |
| Tra-1-60 | Santa Cruz 생명공학 | sc-21705 | 마우스 IgM, 만능 마커 |
| Tra-1-81 | Santa Cruz Biotechnology | sc-21706 | 마우스 IgM, 만능 마커 |
| CK8 (C51) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8020 | 마우스 IgG1, 사이토케라틴 8 |
| &알파;-태아단백 | Santa Cruz Biotechnology | sc-8399 | AFP, 마우스 IgG2a |
| HNF-3β (P-19) | Santa Cruz Biotechnology | sc-9187 | FOXA2, 염소 다클론 항체 |
| Troponin T (Av-1) | Thermo Scientific | MS-295-P0 | 마우스 IgG1 |
| Desmin | Thermo Scientific | RB-9014-P1 | Rabbit IgG |
| Anti-NANOG | ReproCELL Inc, Japan | RCAB0004P-F | Polyclonal 항체 |
| 쥐 anti-GFAP | Zymed | 13-0300 | Glial fibrillary acidic |
| protein Albumin (clone HSA1/25.1.3) | Cedarlane Laboratories Ltd. | CL2513A | 마우스 IgG1 |
| 평활근 액틴 (클론 1A4) | DakoCytomation Inc | IR611 / IS611 | 마우스 IgG2a |
| Nestin | Chemicon International | MAB5326 | 토끼 다클론 항체 |
| TUBB3 | Convance Inc | MMS-435P | Tuj1, 마우스 IgG2a |
| HNF4 α (C11F12) | Cell Signaling Technologies | 3113 | Rabbit monoclonal antibody |
| 파라포름알데히드(용액) | Electron Microscopy Sciences | 15710 | PFA, 고정제, D-PBS에 희석 |
참고문헌
- Cherry, A. B., Daley, G. Q. Reprogrammed cells for disease modeling and regenerative medicine. Annu Rev Med. 64, 277-290 (2013).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined ....
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재인쇄 및 허가
