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방법 논문

인간 다 능성에 대한 대안 문화는 전지 생산, 유지 보수 및 유전 분석을 줄기

12.2K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51519

⸱

2014년 7월 24일

 ,  ,  , 
1NIH Stem Cell Unit, National Institute of Neurological Disorders and Stroke, National Institutes of Health, 2Craniofacial and Skeletal Diseases Branch, National Institute of Dental and Craniofacial Research, National Institutes of Health

이 논문에서

요약

여기에서는 해리된 단일 세포의 비집락형 단층(NCM) 성장을 기반으로 하는 인간 만능 줄기 세포(hPSC) 배양 프로토콜을 제시합니다. Rho 관련 키나아제 억제제 또는 라미닌 동형(laminin isoform 521, LN-521)을 활용하는 이 새로운 방법은 다량의 동질적인 hPSC 생산, 유전자 조작 및 약물 발견에 적합합니다.

초록

인간 만능 줄기 세포(hPSC)는 재생 의학 및 바이오 제약 응용 분야에서 큰 가능성을 가지고 있습니다. 현재 대량의 임상 등급 hPSC의 최적 배양 및 효율적인 증식은 hPSC 기반 치료에서 중요한 문제입니다. 일반적으로 hPSC는 피더 배양 시스템과 피더 프리 배양 시스템 모두에서 콜로니로 증식됩니다. 그러나 이러한 방법에는 낮은 세포 수율 및 이질적으로 분화된 세포 생성을 포함하여 몇 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 현재의 hPSC 배양 방법을 개선하기 위해 최근에는 해리된 단일 세포의 NCM(Non-colony type monolayer) 배양을 기반으로 하는 새로운 방법을 개발했습니다. 여기에서는 ROCK(Rho-associated kinase) 억제제 Y-27632를 기반으로 하는 상세한 NCM 프로토콜을 제시합니다. 또한 Y-39983(ROCK I 억제제), 페닐벤조디옥산(ROCK II 억제제) 및 티아조비빈(새로운 ROCK 억제제)과 같은 다양한 소분자를 가진 NCM 배양에 대한 새로운 정보를 제공합니다. 또한 ROCK 억제제를 사용하지 않고 laminin isoform 521(LN-521)과 같은 정의된 세포외 단백질에서 hPSC를 배양하기 위해 기본 프로토콜을 확장합니다. 또한, NCM을 기반으로 분자 분석 및 신약 개발을 위해 이러한 세포를 유전적으로 변형하기 위해 플라스미드 DNA, 렌티바이러스 입자 및 올리고뉴클레오티드 기반 microRNA를 hPSC로 효율적인 transfection 또는 transduction을 입증했습니다. NCM 기반 방법은 콜로니형 배양의 주요 단점을 극복하여 향후 임상 치료, 줄기 세포 연구 및 약물 발견을 위해 다량의 균질한 hPSC를 생산하는 데 적합할 수 있습니다.

서론

multilineage의 성인 조직으로 분화하는 hPSCs의 용량은 심장, 간, 췌장, 및 신경 시스템 1-4을 포함하는 심각한 질병으로 고통받는 환자를 치료에 새로운 길을 열었습니다. hPSCs에서 파생 된 다양한 종류의 세포는 질병 모델링, 유전 공학, 약물 검사 및 독성 시험 1,4에 대한 강력한 휴대폰 플랫폼을 제공 할 것이다. 미래 임상 약리학 응용 프로그램을 보장하는 중요한 문제는 체외 세포 배양을 통해 임상 수준의 hPSCs 많은 수의 세대입니다. 그러나, 현재의 문화 시스템은 식민지 5,6 등 hPSCs의 다양한 장치와 피더 무료 문화를 포함, 부족하거나 본질적으로 변수 중 하나입니다.

hPSCs 공유 초기 포유류 배아의 내부 세포 덩어리 (ICM)의 많은 구조적 특징의 식민지 형 성장. ICM은 세 가지 세균 층으로 분화하는 경향이있다때문에 이종 신호 그라디언트의 존재 다세포 환경에서. 따라서, 초기 배아 발달에 이성의 인수는 차별화를위한 필수 과정으로 간주하지만, hPSC 문화의 원치 않는 기능입니다. hPSC 문화의 이질성은 종종 인해 차선의 성장 조건에 과도한 세포 사멸 신호와 자발적 분화에 의해 유도된다. 따라서, 콜로니 식 배양에서, 이종 세포는 종종 7,8 콜로니의 주위에서 관찰된다. 또한 인간 배아 줄기 세포 (hESC의)에서 세포는 BMP-4와 같은 구 신호 분자로 전시 차동 응답 콜로니 것으로 밝혀졌다. 또한, 식민지 배양 방법으로 인해 통제 할 수없는 성장 속도와 세포 사멸 신호가 6,9를 경로에 낮은 세포 수율뿐만 아니라 냉동 보존에서 매우 낮은 세포 회수율을 생산하고 있습니다. 최근 몇 년 동안, 다양한 서스펜션 문화, 배양 hPSCs에 particul을 개발 한피더 행렬없는 조건 6,10-13에 hPSCs 많은 양의 확장을위한 아 흘리. 물론, 다른 문화 시스템은 자신의 장점과 단점이있다. 일반적으로, hPSCs의 이질적인 성격은 유전 공학 6에 hPSCs에 DNA와 RNA 자료를 제공하기위한 차선이다 식민지 유형 및 집계 문화 방법의 주요 단점 중 하나를 나타냅니다.

명백하게, 현재의 배양 방법의 몇 가지 단점을 회피 새로운 시스템을 개발하는 필수적인 필요가있다. 단일 세포의 생존을 개선 (예 : ROCK 억제제 Y-27632 및 JAK 억제제 1과) 작은 분자 억제제의 발견은 해리 - hPSC 문화 (14, 15)에 대한 방법을 포장. 이러한 작은 분자의 사용으로, 우리는 최근 비 식민지 유형 해리 - hPSCs 9 (NCM)의 성장에 따라 배양 방법을 개발했습니다. 이 신규 한 배양 방법은 단일 세포 계대 고밀도 모두 결합, 도금 방법을 우리가 주요 염색체 이상 9없이 안정적인 성장주기에 따라 균일 한 hPSCs 많은 양을 생산할 수 있도록. 또한, NCM 문화는 다양한 응용 프로그램에 대한 배양 방법을 최적화하기 위해 다른 작은 분자 (예 : 라미닌 등) 정의 행렬로 구현 될 수 있습니다. 여기, 우리는 NCM 문화를 기반으로 몇 가지 상세한 프로토콜을 제시하고 유전 공학에 대한 자세한 절차를 서술. NCM 프로토콜의 다양성을 설명하기 위해, 우리는 또한 다양한 ROCK 억제제와 하나의 라미닌 이소 521 (즉, LN-521)와 NCM 문화를 테스트했다.

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프로토콜

hPSCs의 단일 셀 기반이 아닌 식민지 형 단일 층 (NCM) 문화.

1. 준비

  1. 10 % FBS, 2 밀리미터 L-글루타민, 0.1 mM 비 필수 아미노산 (NEAA)와 보충 DMEM 매체 : 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)의 배양 배지 500 ㎖로 만든다.
  2. 마우스 배아 섬유 아세포를 DMEM 배지에서 0.1 % 젤라틴 코팅 6 - 웰 세포 배양 접시에 일상적인 프로토콜 (16)와 문화 MEFs 다음 CF1 균주에서 유래 (MEFs) 세포를 분리. 또한, 상업 자원의 통로 (3)에 MEF의 주식을 구입할 수 있습니다.
  3. 리겔 플레이트를 준비합니다.
    1. -20 ° C의 냉동고에 50 % 씩 분주로 5 (~ 4 ° C에서 냉장) DMEM/F12 배지 ㎖ 및 저장소와 hESC의 자격 리겔 주식의 5 ㎖를 희석. 냉장고 (~ 4 ° C) O / N에서 냉동 마트 리겔 주식을 해동하고 추가 (2.5 % 작업 농도 상승을주는) 차가운 DMEM/F12 배지에서 리겔을 희석.
    2. 웰 당 1.5 ml의 2.5 % 리겔과 코트 6 - 웰 세포 배양 플레이트, 냉장고 O / N에 코팅 된 플레이트를 저장하는 (주 : 2 주 안에 리겔 코팅 된 플레이트를 사용한다.)
    3. 플레이트는 10 ~ 30 분 동안 세포 배양 후드 (참고 : 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 따뜻하게하지 않는다)에 실온에서 따뜻하게 할 수 있도록, 냉장고에서 리겔 플레이트를 제거하고 대기음 DMEM 매체 전에 hPSCs을 도금 할 수 있습니다.
  4. 500 ㎖의 hESC 매체 만들기 : 80 % DMEM/F12 배지, 20 % KSR 2 ㎜의 L-글루타민, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 0.1 ㎜의 β-메르 캅토 에탄올, 4는 FGF-2 / ㎖를 겨.
  5. , 60 % FBS, 20 % DMSO 및 mTeSR1 배지에서 20 μM Y-27632 여과 살균, 1 주 안에 매체를 사용 2X hPSC 동결 매체의 10 ㎖를 준비합니다.

. 2 프로토콜 1 (기본) : 공급기에 hPSC 식민지를 성장

  1. 일관성 resul을 얻기 위해 hPSC 문화에 대해 5 또는 6 (P5 및 P6로 지정)에서 MEF 통로 번호를 사용TS. Mitotically 37 ° C에서 3 시간 동안 10 ㎍ / ㎖의 마이 토마 이신 C와 세포를 치료에 의해 MEFs을 비활성화, 세척 세포는 1X 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)으로 3 배, 다음 0.53 밀리미터에서 0.05 % 트립신 MEFs을 떼어 놓다 EDTA. 대안 적으로, X-선 조사 장치와 8,000 라드의 투여 량으로 MEFs를 조사.
  2. 현미경 하에서 트립 판 블루 염색 배제 방법을 이용하여 세포 수를 센다. 또한, 자동 세포 계수기를 사용합니다.
  3. 6 자 폴리스티렌 번호판 플레이트 조사 MEFs 잘 당 1.88 × 10 5 세포 (즉, 1.96 × 10 4 세포 / ㎠)의 밀도로 0.1 % 젤라틴으로 코팅. 37 ° C에서 세포를 품어 5 % CO 2 24 시간 동안.
  4. 파스퇴르 피펫 (이 시간에 필요로 한 세척 단계를 참고 없음)로 흡인하여 MEF 문화 매체를 제거합니다.
  5. 작은 덩어​​리로 이전의 문화에서 씹다 hPSC 식민지, FR에 이르기까지 자신의 크기를 확인하기 위해 현미경으로 수풀을 검사OM (50) 직경의 100 ㎛, 잘 hPSC 2 ㎖를 포함하는 하나의 MEF 피더 레이어의 상단에 hPSC 덩어리를 접시.
  6. 어떤 형태 학적으로 변형 된 또는 차별화 된 식민지 (~ 5 %)를 마크, 사진 에의 한 5 일 기록 식민지의 성장을위한 hESC의 매체 일상을 변경하고 수동으로 파스퇴르 피펫으로 조심스럽게 흡인에 의해 표시 식민지를 제거합니다.
  7. 두 번 MEFs에 남아있는 식민지 (2 분 D-PBS로 각을) 씻어, 2 ㎖를 1 ㎎ / 10 ~ 30 분 hPSC 매체 ㎖의 콜라게나 제 IV)에 식민지를 배양하고,에서 hPSC 식민지의 분리를 검토 MEF 도포면 (주 : 콜로니 단단히 플레이트에 부착되는 경우에만 박리 공정을 돕기 위하여 스크레이퍼를 사용).
  8. , 15 ML 튜브에 효소 반응, 전송 식민지를 최소화 hPSC 식민지는 실온에서 3 ~ 5 분 동안 침전 할 수 있도록, 그리고 C의 직접적인 시각화에 의해 식민지의 침전을 보장하기 위해 각 웰에 hPSC 매체의 5 ML을 추가합니다튜브의 바닥에 ELL 학생 (참고 :이 단계에서 튜브를 원심 분리하지 않음).
  9. 잔류 MEFs를 함유 상청액을 제거하고 단일 세포를 해리, hESC의 매체 (5 mL)로 콜로니를 재현 탁하고, 두 번 침전 단계를 반복한다.
  10. 세포의 계대를위한 6 자 접시에 (1 아니라 냉동 바이알 당 합류) 또는 판 냉동 보존을위한 매체 (또는 CryoStore CS10 동결 매체) 냉동 1X hPSC 작은 덩어​​리, 저장소로 매체, 씹다 hPSC 식민지를 제거합니다.

3 프로토콜 2. NCM에 hPSC 식민지를 공급기로 변환

  1. 일단 D-PBS에서 hPSC 펠렛을 씻어 10 분 동안 1X Accutase 1 ㎖로 알약을 배양하고, 단일 셀의 분리를 보장하기 위해 현미경으로 효소 반응을 검사합니다.
  2. 온화 Y-27632은 5 분 동안 RT에서 200 XG에서 원심 분리 한 다음 10 μM을 함유 mTeSR1 배지 5 ㎖에 세포를 재현 탁하여 효소 반응을 종결(세포 손상의 원인이 과도한 원심 분리의 힘을 사용하지 않는 참조).
  3. 펠렛에 mTeSR1 매체의 5 ML을 추가, 하나의 세포로 펠렛을 재현 탁하고, 필터는 40 μm의 셀 스트레이너 (잔여 세포 집합체를 제거하는)를 통해 세포를 해리.
  4. 잘 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 2.5 % hESC의 자격 리겔로 코팅 된 6 - 웰 플레이트의 (1.4-2.1 × 10 5 세포 / ㎠), 2.5 mL로 mTeSR1 매체를 추가하고, 10 μM을 포함 배지에서 Y-27632 (초기 24 시간 단세포 도금을 촉진하기 위해). 1 μM Y-39983 (내가 억제제 ROCK), 1 μM의 phenylbenzodioxane (ROCK II 억제제), 1 μM의 thiazovivin (소설 ROCK 억제제) 또는 강화 단일 셀 도금 10 μM Y-27632을 대체하기 위해 다음과 같은 작은 분자를 이용 , 2 μM의 JAK 억제제 1.
  5. (24 시간 이내) 다음날 약 자유로운 mTeSR1 매체와 매체를 교체, 추가로 하나의 세포를 떼어 놓다또한, 단일 세포 도금의 효율을 결정하는 세포의 수를 계산합니다 (참고 : 대략,이 단계에서 달성 될 수 단일 셀 도금 효율 50-90%).
  6. 세포가 mTeSR1 매체의 3 ㎖로 몇 일 동안 단일 세포 형성 단층으로 성장 할 수 있습니다. 매일 매체를 변경합니다.
  7. 경험적으로 세포 밀도에 따라 적응 NCM을 계대 일정을 결정합니다. 세포의 성장은 3 일 또는 4 일에 합류, 또는 세포 간 경계의 소멸 후 4 시간 시점에 도달 통로. 1 ~ 3 분할 비율 (즉, 잘 6 잘 플레이트의 3 우물에서 도금 세포의 1 합류) 세포의 계대 용을 사용 Accutase 1 ㎖의 세포를 떼어 놓다, 5 통로에 적응 NCM을 안정.
  8. 세포 동결
    1. 하나의 고정 된 유리 병에 대해 하나의 합류도 (~ 5 ~ 6 배 6 셀) 활용 : 음 10 분 Accutase 1 ㎖로 한 융합 세포를 떼어 놓다.
    2. w를 희석i 번째 5 전술 한 바와 같이 mTeSR1 매질 및 원심 셀 ML.
    3. mTeSR1 매체의 500 μL에 펠렛을 재현 탁하고 천천히 냉동 보존 유리 병 (20 μM Y-27632 포함)을 2 배 hPSC 동결 매체 500 μl를 추가합니다. 대안 적으로, 10 μM Y-27632 또는이 어느 μM의 JAK 억제제 1의 존재하에 2 μM의 JAK 억제제 1 또는 1X CryoStor CS10 매체를 함유하는 1X hPSC 동결 배지에서 세포를 재현 탁.
    4. 얼음 냉각 cryocontainer (isopranol하여 하단 작성)에 냉동 튜브를 삽입하고 즉시 -80 ° C 냉동고에 cryocontainer를 전송합니다.
    5. 장기간의 냉동 보존에 대한 (다음 날) 액체 질소 탱크에 -80 ° C 냉동고에서 세포를 전송합니다.
  9. 세포의 해동
    1. 6 잘 플레이트의 1도를 도금 한 냉동 보존 유리 병을 사용한다.
    2. 2 분 동안 동일한 물을 욕조에 10 분, 해동 세포에 대한 37 ° C의 물을 욕조에 미리 따뜻한 mTeSR1 매체,적가 10 μM Y-27632을 포함하는 미리 예열 mTeSR1 매체의 5 ML에 셀을 추가하고, 상기 한 바와 같이 원심 분리기.
    3. 조심스럽게 10 μM Y-27632을 포함 mTeSR1 2 ㎖와 세포 펠렛을 재현 탁 천천히 잘 리겔으로 미리 코팅에 세포를 전송 (참고 : 공기 방울을 생성하지 않도록).
    4. 매일 매체를 변경하고 hPSC 성장은 3 일 또는 4에 합류에 도달 할 전망이다.

4 프로토콜 3. NCM 문화에 리겔에 hPSC 식민지로 변환

  1. , 냉장고에서 마트 리겔 코팅 된 플레이트를 제거합니다 10 ~ 30 분 동안 조직 문화 후드에서 플레이트를 배치, 플레이트의 각 우물에서 매체를 제거하고 각 웰에 미리 예열 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다.
  2. 전송 위의 리겔 플레이트에 피더 문화 (기본 프로토콜의 단계 2.10)에서 hPSC 덩어리를 분쇄. 각 웰에 2.5 ㎖의 최종 부피까지 mTeSR1 매체를 추가합니다.
  3. 3~4일 매일 매체 변경식민지까지의 80 % 내지 90 %의 합류에 도달합니다.
  4. 세포의 계대의 경우 : 두 번 D-PBS로 식민지를 씻어 15 ~ 20 분 동안 37 ° C에서 2 ㎎ / ㎖ 디스 파제 1 ㎖의 세포를 치료하고, 수풀 등의 침전물과 통로 세포.
  5. NCM 문화의 경우 : 3.1 ~ 3.9 프로토콜 2에서 설명하는 단계를 반복합니다.

5 프로토콜 4.에 hPSCs의 NCM 문화 LN-521

  1. 사용 하루 전에 4 ° C에서 재조합 LN-521 솔루션을 해동하고 최종 농도에 (칼슘 2 + / 마그네슘 2 +를 포함) 1X D-PBS와 해동 라미닌을 희석하여 라미닌 코팅 용액 (LCS)을 만들 10 ㎍ / ㎖의.
  2. (: 드라이 아웃 코팅 과정에서 피할 주)도 6 - 웰 플레이트에 하나에 LCS의 1 ML을 추가합니다.
  3. 증발을 방지하고 냉장고 (4 ° C) O / N (1 주일 이내에 플레이트를 사용 주)의 플레이트를 저장하는 파라 필름과 코팅 된 플레이트를 밀봉.
  4. 부드럽게에없이 파스퇴르 피펫 LCS를 제거코팅 된 표면을 uching 잘 하나 mTeSR1 2 ㎖를 추가합니다.
  5. 25 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 (D-PBS를 포함하여) 모든 문화 솔루션을 따뜻하게.
  6. hPSC 식민지 NCM로 변환
    1. 프로토콜 2에 설명 된대로 Accutase으로 하나의 세포에 세포 집합체를 떼어 놓다.
    2. 하나에 씨 1.3-2 X 10 6 hPSCs 잘 LN-521-코팅 (1.4-2.1 × 10 / ㎠ 5 셀) ROCK 억제제의 존재없이.
    3. 3~4일 매일 매체를 변경합니다.
    4. 1 내지 3 개의 분할 비를 이용하여 다음 세포 계대 1 일 3 또는 4의 Accutase 1 ml의 세포 해리.

. 6 프로토콜 5 : NCM 문화 플라스미드 DNA 형질에 대한

  1. 4 프로토콜 2에 설명 된대로 NCM 문화에 hPSC 식민지 적응.
  2. 플레이트는 10 μM Y-2763의 존재에 mTeSR1 매체에 5 세포 / 웰 × 10 7.5 세포 밀도로 12 - 웰 플레이트에 hPSCs 해리2.
  3. 세포를 도금 후 4-8 시간 사이에 약 자유로운 mTeSR1 매체와 mTeSR1 매체를 교체합니다.
  4. 각 형질의 경우 (예를 들어, pmaxGFP) 발현 플라스미드의 2.5 μg을 희석하고 125 ㎕의 옵티-MEM 각 별도의 에펜 도르프 튜브에 리포 펙 타민 2000 년 5 μL 세럼 중간을 감소.
  5. 5 분 후, 희석 시약을 혼합하고 RT (형질 단지를 형성)에서 20 분 동안 품어.
  6. 1 ㎖ mTeSR1 매체의 각 잘 포함 hPSCs에 250 ㎕의 형질 단지를 추가하고 24 시간 동안 CO 2 배양기에서 37 ° C에서 세포를 품어.
  7. 형광 현미경과 실제 형질 전환 효율의 계산을 위해 무작위로 사진에서 형질 전환 효율을 검사합니다.

. 7 프로토콜 6 : NCM 문화 마이크로 RNA의 형질에 대한

  1. 6에 잘 당 Accutase 1 ㎖를 추가하여 NCM 조건에서 2 일에 반 합류 hPSCs을 떼어 놓다 - 잘 플레이트.
  2. 5 분 200 XG에서 효소 반응과 원심 분리기를 희석 mTeSR1 매체의 10 ML을 추가합니다.
  3. , mTeSR1 배지로 세포 펠렛을 재현 탁 10 μM Y-27632를 함유 mTeSR1 배지에서 12 - 웰 플레이트에 웰 당 7.5 × 105 세포의 밀도로 세포를 시드하고, 세포가 4 시간 동안 부착시킨.
  4. Y27632없는 mTeSR1 매체와 매체를 교체합니다.
  5. 상업적으로 이용 가능한 마이크로 RNA (예를 들어, Dy547 레이블이 아닌 대상 miRIDIAN miRNA의 형질 컨트롤)를 사용합니다. 제공되는 시약을 사용하여 0-160 nm의에 이르기까지 농도를 적정하고 제조 업체의 지침을 따르십시오.
  6. 형질 감염 후 24 시간에서 현미경 생균의 Dy547 형광을 영상화함으로써 hPSC 라인의 각 농도에 대한 형질 전환 효율을 최적화.
  7. 모든 묘화 셀 위에 Dy547 양성 세포의 백분율에 기초하여 형질 전환 효율을 계산한다.
. TLE "> 8 프로토콜 7 : 렌티 바이러스 벡터의 형질 도입에 대한 NCM 문화

  1. 반복 프로토콜 6 7.4 7.1 단계를 반복합니다.
  2. 전달에 사용되는 바이러스 입자의 양을 계산 : 다음 식에 사용 TU를 = TU는 단위 변환의 총 수를 의미하는 반면 (MOI는 CN을 X) / VT, MOI은 잘 (MOI 또는 감염의 원하는 다수의 동일 TU / 셀), CN은 물론 각 세포의 수를 지정하고, VT 재고 바이러스 역가 (TU / ㎖)를 나타냅니다. 예를 들어, SMART-shRNA를 벡터에 대한 스톡 바이러스 역가가 (ML 당 단위 변환) 1 × 10 9 TU / ㎖ 동일 주어진, 7.5 × 10 5 전달시에 웰 당 세포 및 (20)의 예상 MOI는 : 15을 사용 각 웰에 대한 재고 바이러스 입자의 μL가 (주의 :이 조건이 과도 렌티 바이러스 유도하는 것이 좋습니다).
  3. 30 분 동안 폴리 브렌의 10 ㎎ / ㎖와 mTeSR1 매체의 사전 따뜻한 300 μL.
  4. 주식 바이러스 입자의 15 μl를 추가로예열 mTeSR1 매체는 폴리 브렌을 함유하는 용액을 부드럽게 혼합한다.
  5. 바이러스 입자를 포함하는 예비 가온 매체의 300 μL와 세포 배양 배지를 교체합니다.
  6. 4 시간 배양 한 후, 전달 효율을 결정하는 turboGFP 형광 (shRNA를 발현에 대한 메이커)를 검사합니다.
  7. 세포가 turboGFP을 표현하기 시작하면 잘 열 변환에 추가 mTeSR1 매체 300 μl를 추가합니다.
  8. 12 ~ 16 시간 배양 한 후, 터보-GFP 발현을 재검토.
  9. 72 시간 이내에 형질 세포로 원하는 후속 실험을 수행합니다.

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결과

NCM 문화의 일반적인 스키마

그림 1은 ROCK 억제제 Y-27632의 존재 고밀도 단일 셀 도금 후 hPSCs의 역동적 인 변화를 보여주는 전형적인 NCM 문화 스키마를 나타냅니다. 이러한 형태 변화는 세포의 클러스터 형성을 도금, 세포 응축 다음에 지수 세포 성장 (그림 1A) 후 세포 간 연결이 (가) 있습니다. 대표적인 실험이 1 일에서 10 μM Y-27632의 존재 / ㎠ 1.9 × 10 5 세포의 밀도로 단일 세포로 도금, WA01 (H1) 인간 배아 줄기 세포를 나타냅니다 (그림 1B, 왼쪽 패널), 더없이 전파 하루 2의 식민지 (그림 1B, 가운데 패널)의 형성, 원하는 실험 또는 3 일 (그림 1B, 오른쪽 패널)에서 세포 계대에 적합한...

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토론

기존의 (피더 또는 세포 외 매트릭스에 세포의) 식민지 형 문화와 지류 6없이 집계로 hPSCs의 현탁 배양 : 체외에서 배양 hPSCs에 두 가지 주요 방법이 있습니다. 식민지 형 서스펜션 모두 배양 방법의 한계는 축적 된 이질성 및 상속 성적인 변경 내용이 포함되어 있습니다. NCM 배양, 단세포 계대 및 고밀도 세포 도금 양에 기초 hPSC 성장 6,18위한 새로운 배양 방법을 나타낸다. 다양한 단일 세포 계대 방법은 문헌에 기록되어있다,하지만 그들 중 누구도 일상적인 전파를 사용하지 않지만. 예를 들어, 우 및 동료 hPSC 성장 19에 다양한 작은 분자 칵테일의 효과를 연구 할 수있는 단일 세포 계대 방법을 채택했다. 그러나, 최종 문화 제품은 식민지입니다. 따라서, 저밀도 기반 단일 셀 계대 방법은 여전히​​ 콜로니 식 배양에 속한다. NCM 문화, 높은 굴과 관련하여최종 셀 제품은 균질 한 단일 층이기 때문에 ITY 도금, 새로운 방법이 문...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 연구는 미국 국립신경질환 및 뇌졸중 연구소(National Institute of Neurological Disorders and Stroke)의 국립보건원(NIH)의 교내 연구 프로그램(Intramural Research Program)의 지원을 받았습니다. 이 프로젝트에 대한 토론과 논평에 대해 Ronald D. McKay 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
백작 부인 자동화 세포 계수기Invitrogen Inc.C10227자동 셀 카운팅
Faxitron 캐비닛 X-ray 시스템Faxitron X-ray Corporation, Wheeling, IL 모델 RX-650MEF의 X선 조사
MULTIWELL 6웰 플레이트Becton Dickinson Labware353046폴리스티렌 플레이트
DMEMInvitrogen Inc.11965– 092MEF 매체
미토마이신 CRoche107409유사분열 억제제
TrypsinInvitrogen Inc.25300-054MEF 해리
DMEM/F12Invitrogen Inc.11330– 032hPSC 미디엄
Opti-MEM I 리듀스 세럼 미디엄 Invitrogen 주식 회사31985-062hPSC 형질주입
열비활성화 FBSInvitrogen Inc.16000– 044MEF 미디엄
녹아웃 세럼 교체Invitrogen Inc.10828– 028KSR, hPSC 배지
Dulbecco' 구성 요소 s 인산염 완충 식염수Invitrogen Inc.14190-144D-PBS, Ca2+/Mg2+
Non-essential 아미노산없음 Invitrogen11140– 050NEAA, hPSC 배지
L-글루타민인비트로겐의 구성 요소 25030– 081hPSC 매체
mTeSR1 & 보충제StemCell Technologies5850동물성 무단백질
TeSR2 & 보충제StemCell Technologies5860무제계 매체
&베타;-메르캅토에탄올시그마 M7522hPSC 매체의 구성
요소
MEF (CF-1) ATCC		American Type Culture Collection (ATCC) SCRC-1040hPSC의 피더 배양용
hESC 인증 MatrigelBD Bioscience354277hPSC의 피더 없는 배양용
Laminin-521BioLaminaLN521-02인간 재조합 단백질
FGF-2(재조합 FGF, 기본)R& D Systems, MN223-FBhPSC 배지의 성장 인자
CryoStor CS10StemCell Technologies7930
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT-1041X 혼합 효소 용액
JAK 억제제 IEMD4 Biosciences420099Janus kinase
Y-27632EMD4 Biosciences688000ROCK 억제제
Y-27632Stemgent04-0012ROCK 억제제
Y-39983Stemgent04-0029ROCK I 억제제
PhenylbenzodioxaneStemgent04-0030ROCK II 억제제
ThiazovivinStemgent04-0017새로운 ROCK 억제제
BD Falcon Cell StrainerBD Bioscience35234040 µ m 세포 여과기
Nalgene 5100-0001 Cryo 1 ° C써모 사이언티픽 C6516F-1"서리가 내린 씨" 냉동 용기
Lipofectamine 2000Invitrogen Inc.11668-027트랜스펙션 시약
DharmaFECT DuoThermo ScientificT-2010-02트랜스펙션 시약
비표적 miRIDIAN miRNA 트랜스펙션 제어Thermo ScientificIP-004500-01-05Dy547로 라벨링되어 마이크로RNA의 전달을 모니터링하기 위해 
SMART-shRNA써모 사이언티픽 모든
transfection kit에 포함된pmaxGFPamaxa Inc (Lonza)control
Oct-4Santa Cruz Biotechnologysc-5279Mouse IgG2b, pluripotent marker
SSEA-1Santa Cruz Biotechnologysc-21702Mouse IgM, differentiation marker
SSEA-4Santa Cruz 생명공학sc-21704마우스 IgG3, 만능 마커
Tra-1-60Santa Cruz 생명공학sc-21705 마우스 IgM, 만능 마커
Tra-1-81Santa Cruz Biotechnologysc-21706마우스 IgM, 만능 마커
CK8 (C51)Santa Cruz Biotechnologysc-8020마우스 IgG1, 사이토케라틴 8
&알파;-태아단백Santa Cruz Biotechnologysc-8399AFP, 마우스 IgG2a
HNF-3β (P-19)Santa Cruz Biotechnologysc-9187FOXA2, 염소 다클론 항체
Troponin T (Av-1)Thermo ScientificMS-295-P0마우스 IgG1
DesminThermo ScientificRB-9014-P1Rabbit IgG
Anti-NANOGReproCELL Inc, JapanRCAB0004P-FPolyclonal 항체 
쥐 anti-GFAPZymed13-0300Glial fibrillary acidic
protein Albumin (clone HSA1/25.1.3)Cedarlane Laboratories Ltd.CL2513A마우스 IgG1
평활근 액틴 (클론 1A4)DakoCytomation IncIR611 / IS611마우스 IgG2a
NestinChemicon InternationalMAB5326토끼 다클론 항체
TUBB3Convance IncMMS-435PTuj1, 마우스 IgG2a
HNF4 α (C11F12)Cell Signaling Technologies3113Rabbit monoclonal antibody
파라포름알데히드(용액)Electron Microscopy Sciences15710PFA, 고정제, D-PBS에 희석
, , 의 구성 요소 Lentiviral vectorTransfection

참고문헌

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