두 광자<em&gt; 생체</em&gt; 시닝 두개골 준비를 사용하여 마우스 피질 돌기 쪽의 영상

요약

살아있는 동물의 타임랩스 영상은 온전한 뇌의 구조적 재구성에 대한 귀중한 정보를 제공합니다. 여기에서는 이광자 현미경으로 살아있는 쥐 피질의 형광 표지된 시냅스 구조를 경두개 이미징할 수 있는 얇은 두개골 제제를 소개합니다.

초록

포유류의 피질에서 신경 세포는 매우 복잡한 네트워크와 시냅스에서 정보 교환을 형성한다. 시냅스 강도뿐만 아니라, 시냅스의 추가 / 제거의 변화, 신경 가소성의 구조적 기초를 제공하고, 환경 의존적으로 발생한다. 피질에서 가장 흥분성 시냅스의 시냅스 구성 요소로, 돌기 쪽은 시냅스의 좋은 프록시로 간주됩니다. 마우스 유전학과 형광 라벨 기법, 개별 뉴런과 자신의 시냅스 구조의 촬영 장점은 그대로 뇌에 표시 할 수 있습니다. 여기에서 우리는 생체 내에서 시간이 지남에 형광 표지 시냅스 돌기 쪽을 따라 두 광자 레이저 스캐닝 현미경을 사용하여 두개 영상 프로토콜을 소개합니다. 이 프로토콜은 그대로 두개골을 유지하고 수막의 노출과 피질에 의한 염증 효과를 방지 얇게 두개골 준비를 활용합니다. 따라서, 이미지는 SU 직후에 취득 할 수있다rgery이 수행된다. 실험 절차는 시간부터 년까지 다양한 시간 간격들에 걸쳐 반복하여 수행 될 수있다. 이 혼합물을 또한 생리적 및 병리 적 조건에서, 다른 피질 영역과 층뿐만 아니라, 다른 세포 유형을 조사하기 위해 확장 될 수있다.

서론

포유류의 피질 감각 지각과 운동 제어에서 추상적 인 정보 처리 및 인식, 많은 뇌 기능에 참여하고 있습니다. 다양한 대뇌 피질의 기능은 신경 세포의 다른 종류의 통신 및 개별 시냅스에서 정보를 교환하기로 구성되어 다른 신경 회로에 구축 할 수 있습니다. 시냅스의 구조 및 기능은 일관 경험 및 병리에 대한 응답으로 수정되고있다. 성숙한 뇌에서 시냅스 가소성 형성과 기능적 신경 회로의 유지에 중요한 역할을 수행, 강도 변화와 시냅스의 추가 / 제거를 두의 형태를 취한다. 돌기 쪽은 포유류 뇌의 흥분성 시냅스의 대부분의 시냅스 구성 요소입니다. 지속적인 매출 및 척추의 형태 학적 변화는 시냅스 연결 ^1-7 수정의 좋은 지표 역할을 것으로 추정된다.

이광자 레이저 스캐닝 마이크로SCOPY 두꺼운 불투명 준비하고 그대로 뇌 ⁸ 라이브 영상에 적합하게 낮은 광독성을 통해 깊은 침투를 제공합니다. 형광 표시와 함께, 두 광자 영상은 살아있는 뇌 들여다 높은 공간과 시간적 해상도를 가진 개별 시냅스의 구조 개편을 수행 할 수있는 강력한 도구를 제공합니다. 다양한 방법은 실시간 이미징 ^9-13 생쥐를 제조하는데 사용되었다. 여기, 우리는 마우스 피질에서 시냅스 돌기 쪽의 구조적 가소성을 조사하기 ....

프로토콜

승인은 수술 및 이미징 연구의 개시 전에 홈 기관에서 얻을 수 있어야합니다. 이 논문에 기술 된 실험은 캘리포니아 대학 산타 크루즈 기관 동물 관리 및 사용위원회의 지침과 규정에 따라 수행되었다.

1. 수술

1. 모든 수술 도구를 압력솥 철저하게 수술 전 70 % 알코올로 작업 영역을 소독.
2. KX 마취 용액 (200 ㎎ / kg 케타민 20 ㎎ / kg 자일 라진)을 복강 내 (IP) 주사하여 마우스를 마취 마우스의 체중에 따라 주 :. KX 투여는 건강 상태는 스트레인, 연령에 따라 조절 될 수 있고, 마우스. 최적의 복용량을 결정하는 수의 상담도 추천합니다.
3. 마우스의 발가락을 눌러 마취 상태를 모니터링 할 수 재귀 응답을 확인하여 주기적으로 발가락 핀치 테스트를 수행합니다.마우스가 완전히 수술을 시작하기 전에 마취되어 있는지 확인합니다주의 :. 장시간 영상 세션 동안, 필요한 경우 추가 KX를 리다, 주기적으로 마우스의 마취 상태를 확인합니다.
4. 수술 동안 체온을 유지하기 위해 가열 패드에 마우스를 배치.
5. 두피를 노출하는 면도날을 사용하여 쥐의 머리를 면도.
6. 알코올 패드와 베타 딘을 교대로 피....

결과

YFP-H 라인 쥐 ^25에서 노란색 형광 단백질이 대뇌 피질의 표면 층에 자신의 혀끝의 수상 돌기를 돌출 레이어 V 피라미드 신경의 부분 집합에 표현한다. 얇게 두개골 준비를 통해, 형광 표지 된 수지상 세그먼트 반복적 시간에서 달에 이르기까지, 다양한 영상 간격을 통해 두 광자 현미경으로 몇 군데 있습니다. 여기에서 우리는 개인의 척추뿐만 아니라 filopodia 명확하게 수상 돌기를 따라 시각화 할 수있는 1 개월 마우스의 운동 피질에있는 8 일 동안 같은 수상 돌기의 네 시간 영상의 예를 보여줍니다. 일반적으로, 화상 스택 깊이 pial 표면으로부터 약 100 내지 200 μM이다. 각종 분석은 이러한 이미지에 기초하여 수행 될 수있다. 예를 들어, 척추 형성, 제거 및 회전율은 다른 세션에서 이미지를 비교함으로써 정량화 될 수있다. 척추 밀도는 dendrit의 길이에 의해 가시의 수를 나누어 계산 될 수있다IC 세그먼트. 척추의 운동성 및 형태의 변화도 분석 할 수 있습니다.

토론

성공적인 얇게 두개골 준비를 얻으려면,이 프로토콜의 몇 가지 단계가 매우 중요하다. 1) 두개골의 두께. 두개골 뼈이 고밀도 치밀골의 층과 저밀도 해면골의 중간층과 함께 샌드위치 구조를 갖는다. 고속 마이크로 드릴 치밀골과 해면골의 외부 층을 제거하기에 적합한 반면, 미세 수술 블레이드 치밀골의 내부 층을 얇게 이상적이다. 개발하는 동안 두개골의 두께가 증가하고 강성으로, 성인 쥐의 촬상 좋은 품질의 이미지를 얻기 위해서 제거되어야 할 더 많은 골을 요구한다. 얇아진 영역은 투명 고체 외관을 나타내고 두개골의 두께는 약 20 ~ 30 ㎛의 경우 양호한 이미징 품질을 제공한다. 지나치게 숱이 이후의 재 이미징 세션의 숱이 어려운 과정을 만들면서 두개골의 두께는 얇아 과정 중에 주기적으로 확인해야합니다. 2) 박막화 영역의 크기.이 원추 형상의 캐비티를 실현하고 안정된 박막화 두개골 구성을 확립하는 것이 중요하다. 적당한 크기로 얇게 영역의 구조는 외피에 손상을 일으키는 것을 방지하고 후속 재 촬상 세션 얇게 돕는다. 그것은 상부.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민	Bioniche Pharma	67457-034-10	마취를 위해 자일라진과 혼합
Xylazine	Lloyd laboratories	139-236	마취를 위해 케타민과 혼합
식염수	Hospira	0409-7983-09	주입 및 이미징 용 0.9 % NaCl
면도날	전자 현미경 과학	72000	양날 스테인레스 스틸 면도날
알코올 패드	Fisher Scientific	06-669-62	멸균 알코올 준비 패드
눈 연고	Henry Schein	102-9470	바셀린 안과 연고 멸균 안구 윤활제
고속 마이크로 드릴	Fine Science Tools	18000-17	고속 마이크로 드릴은 조밀한 뼈의 바깥 층을 얇게하고 작은 면적의
마이크로 드릴 스틸 버	를 대상으로하는 데 적합합니다.Fine Science Tools	19007-14	1.4 mm 지름
미세수술 블레이드	Surgistar	6961	미세수술 블레이드는 조밀한 뼈의 내부 층과 스폰지 뼈의 중간 층을 얇게 하는 데 적합합니다
. 시아노아크릴레이트 접착제	Fisher Scientific	NC9062131	두개골에 헤드 플레이트를 고정
봉합	Havard 장치	510461	비흡수성, 멸균 실크 봉합사, 6-0 모노필라멘트
해부 현미경	Olympus		SZ61
CCD 카메라	인피니티
이광자 현미경	Prairie Technologies		Ultima IV
10X 대물	Olympus		NA 0.30, 공기
60X 대물렌즈	Olympus		NA 1.1, IR 투과성,
침수 Ti-sapphire 레이저	Spectra-Physics		마이 타이 HP

합니다. 사 렌즈